鯉魚糖轉運載體蛋白Sglt1兔抗血清的製備方法
2023-06-26 18:11:56
專利名稱：鯉魚糖轉運載體蛋白Sglt1兔抗血清的製備方法
技術領域：
本發明涉及生物製品技術領域,具體涉及鯉魚糖轉運載體蛋白Sgltl兔抗血清的製備方法。
背景技術：
鯉魚carpio),又稱鯉拐子、鯉子,隸屬於魚綱,鯉形目，鯉科。其種類多，有紅鯉、團鯉、草鯉、荷色鯉、錦鯉、火鯉、芙蓉鯉、荷包鯉等。鯉魚對水體環境適應性強，是我國淡水養殖傳統的優良品種。鯉魚腸上皮細胞刷狀緣膜上的鈉/葡萄糖共轉運載體(Na+/glUC0Secotransporter, Sgltl)是協助葡萄糖跨膜吸收的主要蛋白，在動物的生命活動中具有重要意義。Sgltl載體蛋白結合I mol葡萄糖和2 mol鈉離子,形成Na+-載體-葡萄糖複合物，順Na+濃度梯度進入細胞，隨後由位於基底膜的葡萄糖易化轉運載體2 (Glut2)將葡萄糖協助轉運至血液。為了研究sWil基因表達和轉運活性的調控因素及調控機理，需要高特異性的Sgltl抗體。Sgltl抗體可為Sgltl的組織定位、細胞定位、表達定量、魚類糖代謝障礙等系列研究奠定物質基礎。獲得大量有活性的Sgltl蛋白作為免疫抗原是製備高活性抗體的關鍵。由於鯉魚Sgltl蛋白是典型的跨膜蛋白，組織含量低，具有14個跨膜域，且其N端和C端位於胞外一側，因此，不能有效地分離純化及體外表達超量具有生物活性的Sgltl抗原蛋白成了製備Sgltl抗體的瓶頸。與本發明相關的現有技術一的技術方案是通過蛋白質分離純化的方法，從組織中直接分離純化Sgltl蛋白作免疫抗原。其缺點是細胞內蛋白一般含量很低，提取方法複雜，得到的蛋白量相對較少，含雜質多，需要複雜的純化過程，成本高。與本發明相關的現有技術二的技術方案是通過構建工程菌體外表達外源蛋白作免疫抗原。其缺點是通過構建原核或真核表達系統來表達抗原蛋白，雖然體外表達的效率和表達量比較高，但是這種方法有很多的局限性，很多特殊結構異源基因如富含AT鹼基和一些跨膜蛋白的基因很難在微生物中表達或者表達量很低，有的即使表達了但是沒有活性。與本發明相關的現有技術三的技術方案是通過無細胞表達系統表達外源蛋白，無細胞表達系統是指以細胞裂解液為基礎，加之外援的RNA模板、胺基酸和能量所構成的細胞外表達體系。其缺點是無細胞表達系統可以表達一些跨膜蛋白，但是這項技術在國內外還處於實驗室研究水平，技術難度大，成本高，目前還無法實際應用。國內外已經完成了對鯉魚Sgltl全長的測序工作，包括5'端非翻譯區(5' UTR),3'端非翻譯區(3' UTR)，一個2000bp左右的開放閱讀框(0RF)。經序列同源性分析顯示，Sgltl胺基酸序列具有高度保守性，鯉魚Sgltl胺基酸序列和斑馬魚的相似性最高達90%以上，與兔子的Sgltl胺基酸序列相似性最低(低 於70%)。鯉魚腸道I基因全長1977 bp,其Sgltl蛋白具有14個跨膜域，所以重組表達sgltl基因全長存在一定的困難。
發明內容
本發明解決的技術問題是提供了一種鯉魚糖轉運載體蛋白Sgltl兔抗血清的製備方法。本發明的技術方案是:鯉魚糖轉運載體蛋白Sgltl兔抗血清的製備方法，其特徵在於包括以下步驟:(1)克隆鯉魚腸道糖轉運載體蛋白Sgltl的基因，通過分析膜蛋白Sgltl的三維結構、跨膜區和抗原決定簇，利用原核表達具有抗原決定簇的部分Sgltl基因片段作為免疫抗原蛋白代替表達全長基因；(2)構建糖轉運載體蛋白Sgltl的基因工程菌；
(3)糖轉運載體蛋白Sgltl基因工程菌的誘導表達與鑑定；(4)製備糖轉運載體蛋白Sgltl抗原；(5)免疫兔子；(6)採血樣測定鯉魚腸道糖轉運載體蛋白Sgltl的效價；(7)頸動脈採血製備糖轉運載體蛋白Sgltl的兔抗血清；(8)免疫組織化學方法檢測。本發明所述的製備糖轉運載體蛋白Sgltl抗原的具體步驟為:將步驟(3)誘導表達的菌液離心，棄上清，按照溼重I g的菌體加6 ml蒸餾水，吹打混勻，再加入與上述菌體混合液等體積的2 X SDS-PAGE上樣緩衝液，混勻，沸水浴10 min,使蛋白變性，進行SDS-PAGE電泳，電泳結束後將分離膠放於0.3 M KCl溶液裡染色，顯示目的條帶，切下分離膠上的目的蛋白條帶，放入ddH20裡清洗，將膠條剪碎放入塑料培養皿中，冷凍乾燥I d，放入研缽中磨成粉末，每200 mg目的蛋白粉加3 ml生理鹽水溶解蛋白，離心，取上清，用超微量分光光度計檢測蛋白濃度。本發明所述的免疫兔子的具體步驟為:按注射要求將蛋白溶液稀釋；乳化:耳緣靜脈注射:0.8 ml蛋白溶液+0.4 ml完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑，漩渦震蕩，皮內注射:1 ml蛋白溶液+1 ml不完全弗氏佐劑，漩渦震蕩；注射方法:第一、二次採用耳緣靜脈注射法，第三、四次採用皮內多點注射法；每隔10 d加強免疫I次，第I次免疫加完全弗氏佐齊U，以後加強免疫時用不完全弗氏佐劑。
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本發明所述的頸動脈採血製備糖轉運載體蛋白Sgltl的兔抗血清的具體步驟為:步驟(5)中第四次免疫後8 d頸動脈採血，兔子在採血前禁食I d，採集血樣收集於經滅菌並不含抗凝劑的離心管中，室溫放置2 h，待血液凝塊後，4 °C保存使之凝固，析出淡黃色抗血清，將抗血清轉移至另一管中，血凝塊以1500 rpm離心10 min，吸出上清液合併於收集到的抗血清管中，分裝冷凍乾燥保存，部分放於4 °C備用。本發明採用表達跨膜蛋白的具有抗原決定簇部分基因片段作為抗原蛋白代替全長基因，解決了跨膜蛋白無法表達的難題，並且該方法簡單易行，快速，穩定，成本低，周期短，表達量高，製備的抗體特異性強，效價高。
圖1是本發明製備方法的流程圖，圖2是鯉魚全長Sgltl基因PCR擴增產物的電泳分析圖，圖3是鯉魚部分Sgltl基因Sgltl-P PCR擴增產物的電泳分析圖，圖4是重組Sgltl-P SDS-PAGE電泳分析圖，圖5是鯉魚腸道Sgltl表達的免疫組織化學檢測結果圖(100 X)。
具體實施例方式結合附圖詳細描述實施例。
1.鯉魚腸道Sgltl的克隆與表達 (I) PCR引物設計
利用Primer Primern 5.0設計兩對引物,基於本實驗室已獲得的鯉魚腸道5^7(7基因的全長序列，設計一對特異性引物sgltl - F和sgltl - R:sgltl - F:5』-ATGGGTGAAGAATATTTTGG-3’sgltl - R:5，-TTAGCCAAAGAAACCATGG-3』
另一對為含I RHindlll雙酶切位點的特異性引物5^/i7-F2和5^7i7_G2: Sgltl-VZ:5』-GGAATTCAAACCCATTGACGACAAA-3』 sgltl-G2:5』-CCCAAGCTTGTTTCTCCATAGCGGT-3』 劃線部分分別為IRHindUl的酶切位點。(2)全長基因的克隆與序列分析
採用Trizol法提取鯉魚前腸組織總RNA，用Oligo (dT) 18引物進行反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板，採用sgltl - F和sgltl - R引物進行PCR擴增，反應條件為95°C 3 min, 94°C50s, 52.4°C 50s, 72 °C 2min 10s，30 個循環，72°C lOmin，14°C 保溫。PCR 產物進行 L0% 瓊脂糖凝膠電泳分析。擴增到了大約2000bp左右的DNA片段(圖2)，將sgltl PCR擴增產物與pGEM_TVector連接,構建pGEM-T- sgltl重組質粒,連接載體轉化至大腸桿菌iE.coli JM109)感受態細胞中，藍白斑篩選出陽性克隆，將陽性克隆的菌液送至中美泰和生物技術(北京)有限公司測序。結果表明，該核酸片段長度為1977 bp，經序列比對顯示，該DNA片段即為鯉魚腸道的ORF區。採用在線伺服器TMHMM Server v.2.0.對5^7 7進行結構分析，具有14個跨膜區域。用BepiPred 1.0在線伺服器預測抗原表位發現:Sgltl蛋白有兩個抗原決定簇，第I個位於第9-10跨膜區胞外端(396-424)，長度為19個胺基酸(402-420);第2個位於第13-14跨膜區胞外端(546-637)，長度為51個胺基酸(546-596)。本實驗採用原核表達系統，表達第13-14跨膜區胞外端，長度為92個胺基酸、具有一個抗原決定簇的多肽。(3)抗原決定簇部分Sgltl基因SglU-P的克隆及重組質粒pMD I^-Tsgltl-P的構建
採用sgm-Y2和Sgiu-G2引物，以PGEM-T- 5^7 7質粒為模板進行PCR擴增，反應條件為 95 0C 3min，94 °C 50s, 52.4 °C 50s, 72 °C lmin，30 個循環，72 °C lOmin, 14。〇保溫。在250 bp附近獲得一條特異性條帶(圖3)(實際大小為276 bp)。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑑定後用凝膠回收試劑盒回收，將回收產物與pMD 19-T載體連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌JM109，選取陽性克隆菌株擴大培養，用Plasmid Mini Kit I 質粒提取試劑盒提取 pMD 19-T- sgltl-PJ^M.。(4)重組表達質粒ρΕΤ-5^/ 7-Ρ的構建、鑑定
將陽性克隆pMD I^-rXsgltl- 與原核表達質粒pET-32a(+)分別用及^7 !,Hindlll,37 °C雙酶切，用凝膠回收試劑盒回收sgltl-P片段和線性化pET-32a(+)質粒，按照T4 DNA連接酶的說明書設計連接反應體系，構建表達質粒pET-sgltl-P,並轉化F.coJi'Rosetta,篩選陽性克隆，進行單雙酶切鑑定。(5) Sgltl蛋白的誘導表達及鑑定將構建的基因工程菌按1%接種量接種於新鮮的含有AMP的TB培養液中，37 °C, 200rpm振蕩培養至菌液OD600達到0.5-0.6，加入IPTG (終濃度I mmol/L), 37 V，200 rpm振蕩誘導培養8 h-10 h。誘導表達後的菌液5000 rpm離心3min得到菌體，棄上清，加適量(1(1!120水，與2X上樣緩衝液1:1在1.5 ml Eppendorf管中混合。沸水浴10 min, 5000 rpm離心30 S。取35 μ I樣品進行SDS-PAGE電泳分析，以未經IPTG誘導的對照菌體樣品和誘導的含有空載體pET-32a(+)表達菌體為對照。SDS-PAGE電泳顯示I條特異性表達條帶，大小約30 kDa (圖4)，而陰性對照組在此位置沒有特異性條帶。2.鯉魚腸道Sgltl抗血清的製備 (I)融合蛋白的獲得、純化
將誘導表達的菌液離心，棄上清，按照I g菌體(溼重)加6 ml蒸餾水，吹打混勻，再加等體積的2 X SDS-PAGE上樣緩衝液，混勻，沸水浴10 min,使蛋白變性。進行SDS-PAGE電泳，電泳結束後將分離膠放於0.3 M KCl裡染色幾分鐘，顯示目的條帶。切下膠上的目的蛋白條帶，放入ddH20裡清洗。將膠條剪碎放入塑料培養皿中，冷凍乾燥I d，放入研缽中磨成粉末，每200 mg目的蛋白粉加3 ml生理鹽水溶解蛋白，離心，取上清，用超微量分光光度計檢測蛋白濃度。( 2 )免疫紐西蘭長耳兔與採血
將蛋白溶液稀釋一定的比例，使終蛋白濃度維持在一定濃度；乳化:耳緣靜脈注射:0.8 ml蛋白溶液(約375 μδ/πι1)+0.4 ml完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑，漩渦震蕩；皮內注射:1 ml蛋白溶液(約200 μδ/πι1)+1 ml不完全弗氏佐劑，漩渦震蕩；注射方法:第一、二次採用耳緣靜脈注射法，第三、四次採用皮內多點(4-6點)注射法；每隔10 d加強免疫I次(第I次免疫加完全弗氏佐劑，以後加強免疫時用不完全弗氏佐劑)。④第四次免 疫後8 d頸動脈採血(兔子在採血前禁食I d)。採集血樣收集於經滅菌並不含抗凝劑的離心管中，室溫放置2 h，待血液凝塊後，放4 °C過夜，使之凝固，析出淡黃色抗血清，將抗血清轉移至另一管中，血凝塊以1500 rpm離心10 min,吸出上清液合併於收集到的抗血清管中，分裝冷凍乾燥保存，部分放於4 °C備用。3.鯉魚腸道Sgltl抗血清的檢測
(1)抗血清效價的測定
採用酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA):將抗原(純化過的Sgltl融合蛋白)稀釋於包被緩衝液(0.05 mol/L碳酸鹽緩衝液，pH 9.6)中，終濃度為10 Pg/ml，每孔加100 μ ，並設立空白對照(只加包被緩衝液)，4°C包被過夜後，用IXPBST[I XPBS + (0.05%)Tween 20]，於室溫下洗滌3次，每次3min，然後每孔加100 μ 封閉液(0.5% BSA)，37 °C孵育2 h，IXPBST洗滌3次，加入一抗，血清樣品按IO2-1O9倍比稀釋於IXPBST中，每孔100 μ1，37 °C孵育I h，I X PBST洗滌3次，加入羊抗兔酶標二抗，酶標二抗按1: 1000稀釋於IXPBST中，每孔100 μ1，37 °C，1 h，I X PBST洗滌3次，每孔加100μ 顯色液(TMB溶液)，室溫放置10-15 min，加入50 μ1，2 mol/L H2SO4終止，酶標儀上判讀結果。抗血清效價測定結果見表I。A、B、C三行分別是不同稀釋倍數抗血清(序號1-8)的三個平行試驗；D行為正常兔子的血清；F行是沒有包被抗原的陰性對照。通過酶標儀測定Sgltl抗血清OD450值，採用終點「滴度」表示法判斷結果，Sgltl抗血清的效價為1:105。表I ELISA測定抗體效價序號 |l |2 |3 |4 |5 |6 |7 |8
稀釋倍 ο2 ο3 Tot ο5 ~ ο6 To7 ο8 —109
A—0.91001.03200Γ§4730.6173~0.2021 ~1077 0.107Γ 0.0887
B—0.91201.04130 85700.6258~0.2022 ~1099 0.1075~0.0886
C—0.92660.9957(1 85430.6196~0.1991 (Γ 089 0.1073~ 0.0886
P—0.14150.09250Γ07950.0762~0.0813 ~0769 0.0748~ 0.0760
F |θ.0803 |θ.0802 I I I I I I
(2)Sgltl抗體的免疫組化檢測
採用石蠟包埋法包埋鯉魚的前腸，進行石蠟切片，片厚5 Mffl, 1%的蛋清展片，進行脫蠟復水，免疫組織化學染色，蘇木精伊紅復染，脫水透明及樹膠封片。免疫組織化學染色的步驟是:內源性過氧化物酶阻斷、羊血清封閉、一抗孵化、二抗孵化、DAB顯色、終止。研究表明，Sgltl主要在小腸絨毛刷狀緣細胞表達。免疫組織化學方法鑑定，用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG為二抗進行染色，顯微鏡下觀察Sgltl抗體在鯉魚的前、中、後腸中的結合情況(圖5，a腸道，b腸道的陰性對照染色)。Sgltl主要定位於腸刷狀緣，明顯區別於陰性血清染色的細胞。本發明採用表達跨膜蛋白的具有抗原決定簇部分基因片段作為抗原蛋白代替全長基因，解決了跨膜蛋白無法表達分難題，該方法簡單易行，快速，穩定，成本低，周期短，表達量高，製備的抗體特異性強，效價高。
SEQUENCE LISTING〈110〉河南師範大學
〈120〉鯉魚糖轉運載體蛋白Sgltl的兔抗血清製備方法 〈160〉 I
Patentin version 3.3
〈210〉 I
〈211〉 833
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 I
atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60 gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120 ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180 atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240 ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300 aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360 catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420 ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480 gctgatatcg gatccgaatt caaacccatt gacgacaaac atctgtacag gctctgctgg 540 agtttgagga acagcactga ggagaggatt gatctggaaa aagatgactg gactgaaaat 600 caggattcag attctgtgca aacagaagag gtgcgcaagg atccaagctg ttggaagaag 660 gcctataact ggttctgcgg ttttgatcaa ggcaatgcac ctaaactgac taaagaagag 720gaggcagagt tgaatttgaa gctcacagac accactgaga aaccgctatg gagaaacaag 780cttgcggccg cactcgag ca ccaccaccac caccactgag atccggctgc taa83權利要求
1.鯉魚糖轉運載體蛋白Sgltl兔抗血清的製備方法，其特徵在於包括以下步驟:(I)克隆鯉魚腸道糖轉運載體蛋白Sgltl的基因，通過分析膜蛋白Sgltl的三維結構、跨膜區和抗原決定簇，利用原核表達具有抗原決定簇的部分Sgltl基因片段作為免疫抗原蛋白代替表達全長基因；(2)構建糖轉運載體蛋白Sgltl的基因工程菌；(3)糖轉運載體蛋白Sgltl基因工程菌的誘導表達與鑑定；(4)製備糖轉運載體蛋白Sgltl抗原；(5)免疫兔子；(6)採血樣測定鯉魚腸道糖轉運載體蛋白Sgltl的效價；(7)頸動脈採血製備糖轉運載體蛋白Sgltl的兔抗血清；(8)免疫組織化學方法檢測。
2.根據權利要求1所述的鯉魚糖轉運載體蛋白Sgltl兔抗血清的製備方法，其特徵在於所述的步驟(4)中製備糖轉運載體蛋白Sgltl抗原的具體步驟為:將步驟(3)誘導表達的菌液離心，棄上清，按照溼重I g的菌體加6 ml的蒸餾水，吹打混勻，再加入與上述菌體混合液等體積的2XSDS-PAGE上樣緩衝液，混勻，沸水浴10 min，使蛋白變性，進行SDS-PAGE電泳，電泳結束後將分離膠放於0.3 M KCl溶液裡染色，顯示目的條帶，切下分離膠上的目的蛋白條帶，放入ddH20裡清洗，將膠條剪碎放入塑料培養皿中，冷凍乾燥I d，放入研缽中磨成粉末，每200 mg目的蛋白粉加3 ml生理鹽水溶解蛋白，離心，取上清，用超微量分光光度計檢測蛋白濃度。
3.根據權利要求1所述的鯉魚糖轉運載體蛋白Sgltl兔抗血清的製備方法，其特徵在於所述的步驟(5)中免疫兔子的具體步驟為:按注射要求將蛋白溶液稀釋；乳化:耳緣靜脈 注射:0.8 ml蛋白溶液+0.4 ml完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑，漩渦震蕩，皮內注射:1ml蛋白溶液+1 ml不完全弗氏佐劑，漩渦震蕩；注射方法:第一、二次採用耳緣靜脈注射法，第三、四次採用皮內多點注射法；每隔10 d加強免疫I次，第I次免疫加完全弗氏佐劑，以後加強免疫時用不完全弗氏佐劑。
4.根據權利要求1所述的鯉魚糖轉運載體蛋白Sgltl兔抗血清的製備方法，其特徵在於所述的步驟(7)中頸動脈採血製備糖轉運載體蛋白Sgltl的兔抗血清的具體步驟為:步驟(5)中第四次免疫後8 d頸動脈採血，兔子在採血前禁食I d，採集血樣收集於經滅菌並不含抗凝劑的離心管中，室溫放置2 h，待血液凝塊後，4 °C保存使之凝固，析出淡黃色抗血清，將抗血清轉移至另一管中，血凝塊以1500 rpm離心10 min,吸出上清液合併於收集到的抗血清管中，分裝冷凍乾燥保存，部分放於4 °C備用。
全文摘要
本發明公開了一種鯉魚糖轉運載體蛋白Sglt1兔抗血清的製備方法。本發明的技術方案要點為鯉魚糖轉運載體蛋白Sglt1兔抗血清的製備方法，包括以下步驟(1)克隆鯉魚腸道糖轉運載體蛋白Sglt1的基因；(2)構建糖轉運載體蛋白Sglt1的基因工程菌；(3)糖轉運載體蛋白Sglt1基因工程菌的誘導表達與鑑定；(4)製備糖轉運載體蛋白Sglt1抗原；(5)免疫兔子；(6)採血樣測定鯉魚腸道糖轉運載體蛋白Sglt1的效價；(7)頸動脈採血製備糖轉運載體蛋白Sglt1的兔抗血清；(8)免疫組織化學方法檢測。本發明採用表達跨膜蛋白的具有抗原決定簇部分基因片段作為抗原蛋白代替全長基因，解決了跨膜蛋白無法表達的難題。
文檔編號C07K16/18GK103204932SQ20131008452
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月18日 優先權日2013年3月18日
發明者聶國興, 張建新, 王俊麗, 侯彩霞, 閆瀟, 張新勝 申請人:河南師範大學