2,4-二氯苯氧乙酸酶聯免疫檢測試劑盒的製作方法

2023-06-26 14:33:31

2,4-二氯苯氧乙酸酶聯免疫檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測食品中2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）含量的酶聯免疫檢測試劑盒。該試劑盒包括：96孔酶標板，2,4-D9個濃度的標準品溶液、高濃度標準品溶液、高濃度的2,4-D單抗溶液、高濃度的酶標2,4-D溶液、底物顯色液、終止液、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、蓋模板、自封袋、說明書和質檢報告。採用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被羊抗鼠二抗，與工作濃度的2,4-D單克隆抗體結合之後，樣本中含有的2,4-D和酶標2,4-D抗原共同競爭2,4-D單克隆抗體上的有限位點，反應達到平衡後用底物顯色，樣本吸光度與標準曲線比較對應的值，反對數後再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣品中2,4-D的含量。
【專利說明】2, 4- 二氯苯氧乙酸酶聯免疫檢測試劑盒
一、【技術領域】:
[0001]本發明涉及一種試劑盒，尤其是涉及一種2，4-二氯苯氧乙酸酶聯免疫檢測試劑盒。
二、技術背景:
[0002]俗話說:「民以食為天」，食品安全問題是關係千千萬萬人民群眾切身利益和國計民生的大問題。但是隨著畜牧業的現代化和高科技，食品安全問題日益嚴峻，令人心驚膽戰。為了除草和蟲害，有人大量使用有毒，甚至劇毒農藥，致使蔬菜、果品農藥殘留嚴重超標，對人的身體健康和生命健康構成嚴重的威脅。如2，4- 二氯苯氧乙酸是一種世界廣泛使用的除草劑也是一種人工合成的植物激素具有與生長素相似得生理效應。它可以通過我們的皮膚和呼吸系統進入體內，具有潛在的致癌性和致突變性，能刺激人體分泌大量的雌性激素，幹擾內分泌系統，對生殖和免疫系統會產生很不良的影響。除此之外，2，4-二氯苯氧乙酸還能使血紅細胞聚集，阻礙紅細胞的攜氧能力，損傷肌肉、腎臟、肝臟和腦組織。鑑於2，4-二氯苯氧乙酸對人類健康和生態環境造成的危害，許多國家都制訂了該農藥在農產品中的最高殘留限量，我國2001年新頒布的《飲用水水質衛生規範》將2，4- 二氯苯氧乙酸的極限值規定為0.03mg/L。世界衛生組織2003年8月頒布的《飲用水水質指南》規定飲用水中2，4- 二氯苯氧乙酸的最大檢出濃度為30 μ g/L。充分認識2，4- 二氯苯氧乙酸的性質，研究出快速方便的檢測方法、建立有效的監控體系和控制標準是十分必要的。
[0003]目前，2，4-二氯苯氧乙酸殘留的檢測方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、聯用技術等。色譜法具有分離速度快、檢測效率高、重現性好、靈敏度高等顯著優點，但由於前處理比較複雜、儀器昂貴、技術難度大、檢測費用高而且需要專業的技術人員等不足，較適合於確證使用，難以應對大批量樣品的檢測，大大限制了其廣泛應用。因此要研製特異、敏感、快速、簡便的2，4- 二氯苯氧乙酸檢測方法具有十分重要的意義。
三、
【發明內容】
:
[0004]本發明的目的:提供一種檢測方便快捷、成本低、靈敏度高、特異性好的檢測工具，此種檢測工具不需要專業人員操作，可快速準確檢測樣品的2，4-二氯苯氧乙酸含量，彌補了高效液相色譜檢測的不足。
[0005]本發明的技術方案:2，4-二氯苯氧乙酸酶聯免疫快速檢測試劑盒，包括盒體、17個試劑瓶、I塊酶標板，其中，塑料泡沫板設置在盒體內，塑料泡沫板上設有多個試劑瓶凹槽，多個試劑瓶下凹槽的高度是所對應的試劑瓶高度的1/3-3/4，各組試劑瓶放置在多個試劑瓶下的凹槽內。
[0006]上述一種2，4- 二氯苯氧乙酸酶聯免疫快速檢測試劑盒，包括盒體，17個試劑瓶，一塊酶標板，一塊蓋模板，一個自封袋，一個放試劑瓶的下凹槽，一份說明書，一份質檢報
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[0007]其特徵在於:96孔酶標板，上麵包被有羊抗鼠二抗，可拆卸成12條酶標微孔條，可以一次測試多個樣品，也可以拆開分次測試，剩餘的酶標微孔條可以儲存在自封袋內，下次使用；所述的試劑瓶分為八組:第一組試劑瓶是裝有標準溶液的試劑瓶，共9瓶，第二組是裝有高濃度標準品溶液的試劑瓶，共I瓶；第三組試劑瓶是裝有酶標2，4- 二氯苯氧乙酸的試劑瓶，共I瓶；第四組試劑瓶為裝有2，4- 二氯苯氧乙酸單抗濃縮液的試劑瓶，共I瓶，第五組試劑瓶是分別裝有顯色液A液和B液的試劑瓶，分別各I瓶，共2瓶；第六組試劑瓶是裝有終止液的試劑瓶，共I瓶；第七組試劑瓶是裝有樣品稀釋液的試劑瓶，共I瓶；第八組是濃縮洗滌液試劑瓶，共I瓶。用不同顏色的瓶蓋和瓶體對試劑進一步加以區分。
[0008]上述的一種2，4-二氯苯氧乙酸酶聯免疫快速檢測試劑盒，其中八組試劑瓶分別為:標準品溶液和高濃度標準品溶液均用黑色帽的棕色玻璃瓶,酶標2，4- 二氯苯氧乙酸用紅色帽的白色PE塑料瓶，2，4- 二氯苯氧乙酸單抗濃縮溶液用黑色帽的黑色PE塑料瓶，顯色液A液用白色帽的黑色塑料瓶，顯色液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶，終止液用黃色帽的白色PE塑料瓶，凝縮洗滌液用透明帽的白色PE塑料瓶，抗體稀釋液，用紅色帽的白色PE塑料瓶。下凹瓶位由白色塑料泡沫製成。
[0009]根據權利要求1所述的一種2，4-二氯苯氧乙酸酶聯免疫分析試劑盒，其特徵在於，所述的盒體為硬質盒體。
[0010]上述的2，4-二氯苯氧乙酸酶聯免疫分析試劑盒，其中，所述的多個試劑瓶下凹槽的大小與所對應的試劑瓶大小相匹配。
[0011]試劑瓶放在塑料泡沫凹槽內，和說明書、質檢報告、蓋模板、酶標板、自封袋一起封裝在硬質盒內，便於攜帶和運輸。
[0012]測試時，採用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被羊抗鼠二抗，與工作濃度的2，4- 二氯苯氧乙酸單抗結合之後，樣本中含有的2，4- 二氯苯氧乙酸和酶標2，4- 二氯苯氧乙酸抗原共同競爭2，4- 二氯苯氧乙酸單抗上的有限位點，反應達到平衡後用底物顯色，樣本吸光度與標準曲線比較對應的值，反對數後再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣品中2，4- 二氯苯氧乙酸的含量。
[0013]與現有的檢測技術相比，本發明具有顯著的優勢:1)和高效液相色譜一質譜技術相比，本試劑盒成本低廉；2)與常規技術相比，本試劑盒不需要專門的熟練的操作人員，操作簡單，方便；可滿足不同層次人員需要，包括專業檢驗、海關檢疫、衛生檢疫、質量檢測、力口工企業和養殖場戶等，便於推廣應用。3 )本試劑盒對樣品的要求低，前處理簡單，可廣泛應用於各種食品檢測；4)本試劑盒的原理是酶聯免疫反應，因此，靈敏度較其他方法高，最低檢測限達到0.659 μ g/L，回收率達到88 ±16%ο
四、【專利附圖】

【附圖說明】:
[0014]下面結合附圖和具體試劑試試本發明的試劑盒做進一步的說明，但不構成本發明的任何限制。
[0015]圖1是本發明酶聯板橫切示意圖；
[0016]圖2是本發明酶聯板縱切示意圖；
[0017]圖3是本發明酶聯板剖面示意圖；
[0018]圖4是本發明的酶聯板的蓋板示意圖；
[0019]圖5是本發明的試劑瓶的測視不意圖；[0020]圖6是本發明的泡沫模板的俯視示意圖；
[0021]圖7是本發明的試劑盒的打開示意圖。
五、【具體實施方式】
[0022](一)樣品的前處理
[0023]1.配製溶液:配製溶液1.0moI/L氫氧化鈉溶液，稱取4.0g的氫氧化鈉，加蒸餾水溶解定容到100mL。
[0024]2.洗滌溶液:根據需要量，將25X濃縮洗滌溶液用蒸餾水按照1:24的體積比進行稀釋，用於酶標板的洗滌。
[0025]以2，4-二氯苯氧乙酸為食品添加劑的樣本處理步驟:食品樣，稱取10.0g樣品，力口入 40mLPBS 和 5mLlmol/L NaOH 溶液，攪拌 30min，過濾，濾液用 lmol/L HCl 調 ρΗ7.2 ?7.4，處理後的溶液仍加熱濃縮至IOmL ;飲用水樣，一般可直接用於檢測，若渾濁不清，可3000r/min離心IOmin或過濾，取上清液或濾液用於檢測。
[0026](二)使用試劑盒操作步驟
[0027]1.將所需的試劑盒包括稀釋液及洗滌液從冷藏的環境中取出，放置在室溫(20-25°C) 30分鐘以上，使其達到室溫，在使用前將每種試劑搖勻。
[0028]2.取出酶標板架及需要數量的微孔，不需要的微孔放入自封袋，冷藏。
[0029]3.將濃縮2，4- 二氯苯氧乙酸單抗和濃縮酶標2，4_ 二氯苯氧乙酸用樣品稀釋液5倍稀釋。
[0030]4.編號:將樣本溶液和標準品工作溶液對應的微孔編號，每個樣品溶液和標準品工作溶液做2孔平行，並記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
[0031]5.加入稀釋後的2，4-二氯苯氧乙酸單抗，每孔50yL，設陰性和空白對照，37°C中反應15分鐘。
[0032]6.取出微孔板，甩出孔內溶液，用洗滌液洗滌3-4次，每次洗滌後用吸水紙拍幹。
[0033]7.每孔加入酶標2，4- 二氯苯氧乙酸工作液50 μ L，同時等體積加入2，4_ 二氯苯氧乙酸標準品及樣品溶液，蓋上蓋板膜置於37°C 30分鐘，取出重複上述洗滌步驟。
[0034]8.將顯色液A和B按體積1:1混合,每孔加50 μ L,室溫顯色5分鐘。
[0035]9.每孔加入終止液50 μ L,用酶標儀於450nm處，測定每孔OD值(若無酶標液儀，則不加終止液用目測法可進行判定)
[0036](三)結果判定
[0037]結果判定有兩種方法，粗略判定可用第I種方法，定量判定用第2種方法。
[0038]注意樣本吸光值與2，4- 二氯苯氧乙酸含量的關係。
[0039]1.目標判斷法:根據樣品和標準品的顏色的深淺來判斷樣品的濃度範圍。標準品的顏色是按照濃度(O μ g/L, I μ g/L, 2 μ g/L, 4 μ g/L, 8 μ g/L, 16 μ g/L, 32 μ g/L, 64 μ g/L,128 μ g/L)的升高顏色依次變淺至無色，假如樣品的顏色處於8 μ g/L, 16 μ g/L兩孔顏色之間，那麼樣品的濃度就處於8 μ g/L, 16 μ g/L之間再乘以稀釋倍數。
[0040]2.定量分析法:
[0041](I)製作標準曲線:
[0042]百分吸光率的計算，樣品或者標準品的吸光值的百分率等於標準品或者樣品的平均值除以第一個標準品(標準品濃度為O的孔)的吸光值，再乘以100%，即百分吸光度值(％)=Β/Β0Χ 100%，B為標準品或者樣品對應孔的吸光值的平均值，BO為標準品濃度為O的孔的吸光值的平均值。
[0043]以標準品百分吸光率為縱坐標，以標準品濃度(O μ g/L)的對數為橫坐標，繪製標準曲線。將樣本的百分吸光率帶入標準曲線中，從標準曲線讀出樣本所對應的樣品濃度的對數值，再反對數，得到濃度再乘以稀釋倍數，得到樣本中2，4-二氯苯氧乙酸的含量。
[0044](四)測定時注意事項:
[0045]1.測試前應將所用的試劑和樣品回到常溫(20_25°C)，否則導致OD值偏低。
[0046]2.洗滌過程中不可間斷洗完拍完板應立即進行下一步試驗，否則，出現半空乾燥造成標準曲線不成線性，重複性差，測定結果不準確。
[0047]3.試劑混合要均勻，顯色液B要加入到顯色液A，充分混勻，否則標準曲線不成線性，重複性不好，影響測定結果。
[0048]4.終止液為2mol/L的硫酸溶液,避免接觸皮膚。
[0049]5.儲存條件:保存試劑盒應在0_8°C，不要冷凍，將不用的微孔板放進自封袋重新密封，標準物質和無色發光劑對光敏感，因此避免直接暴漏在光線下。顯色液若有任何顏色表明變質，不應再使用。O標準的吸光度應在I左右，小於0.5時，表示試劑可能變質。不要使用過了有效期的試劑盒，稀釋與摻雜使用會引起實驗結果不準確，不要使用不同批號試劑盒中的試劑。
[0050]加A、B液後一般顯色15min即可，若顏色較淺，可延長顯色時間，但不能超過30mino
[0051]該試劑盒最佳反應溫度為25°C，溫度過高或者過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。
【權利要求】
1.一種檢測食品中2，4-二氯苯氧乙酸含量的酶聯免疫試劑盒，包括盒體和盒內的一塊96孔的酶標板、一張蓋板膜，17瓶試劑和放試劑的小凹瓶位、一個自封袋、一份說明書和一份質檢報告，其特徵在於:酶標板是採用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預包被羊抗鼠二抗製成檢測板，17瓶試劑分別為9瓶標準品溶液、I瓶高濃度標準品溶液、I瓶2，4- 二氯苯氧乙酸單抗濃縮溶液、I瓶高濃度酶標2，4- 二氯苯氧乙酸溶液、I瓶顯色液A溶液、I瓶顯色液B溶液、I瓶終止液、I瓶樣品稀釋溶液、I瓶濃縮洗滌溶液，下凹位共18個。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於:盒體是硬紙盒；96孔的聚苯乙烯酶標板，放於真空鋁鉬袋內；蓋板膜是塑料硬模；標準品溶液和高濃度標準品溶液均用黑色帽的棕色玻璃瓶，酶標2，4- 二氯苯氧乙酸用紅色帽的白色PE塑料瓶，2，4- 二氯苯氧乙酸單抗濃縮溶液用黑色帽的黑色PE塑料瓶，顯色液A液用白色帽的黑色塑料瓶，顯色液B用紅色帽的黑色PE塑料瓶，終止液用黃色帽的白色PE塑料瓶，樣品稀釋液用紅色帽的白色PE塑料瓶，濃縮洗滌液用透明帽的白色PE塑料瓶；下凹瓶位由白色塑料泡沫製成。
3.根據權利要求1所述的一種2，4-二氯苯氧乙酸酶聯免疫分析試劑盒，其特徵在於，所述酶聯板(2)是可拆的96孔酶聯板，可拆卸為12條酶標反應微孔條，每個酶標反應微孔條有8個反應孔，酶聯板的微孔上包被有羊抗鼠二抗製成包被板。
4.根據權利要求1所述的一種2，4-二氯苯氧乙酸酶聯免疫分析試劑盒，其特徵在於，蓋板膜大小與酶標板大小相一致。
5.根據權利要求1所述的一種2，4-二氯苯氧乙酸酶聯免疫分析試劑盒，其特徵在於，標準品溶液共9瓶，ImL /瓶，濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0 Pg/L，高濃度標準品溶液(lmg/L)，I瓶，ImL ;2，4- 二氯苯氧乙酸單抗濃縮液I瓶，2mL ;高濃度酶標2，4- 二氯苯氧乙酸I瓶，2mL ;顯色液A液I瓶，7mL ;顯色液B液I瓶，7mL ;終止液I瓶，7mL ;樣品稀釋液I瓶，30mL ;濃縮洗滌液I瓶，30mL。
6.根據權利要求1所述的一種2，4-二氯苯氧乙酸酶聯免疫分析試劑盒，其特徵在於，所述的盒體為硬質盒體。
7.根據權利要求1所述的一種2，4-二氯苯氧乙酸酶聯免疫分析試劑盒，其特徵在於，所述的多個試劑瓶下凹槽的大小與所對應的試劑瓶大小相匹配。
【文檔編號】G01N33/577GK103823067SQ201410098334
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月17日 優先權日:2014年3月17日
【發明者】席俊, 龔芳, 史巧巧, 陸啟玉, 職愛民, 楊豔豔 申請人:河南工業大學