SPKP‑XI在製備Kv4.2通道抑制劑中的應用的製作方法
2023-06-26 14:33:51 1
本發明涉及一種活性多肽在離子通道工具試劑中的用途，尤其是用化學法製備的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-xi（簡寫為spkp-xi）在製備電壓門控鉀通道亞型工具試劑-kv4.2通道抑制劑中的用途。
背景技術：
電壓門控鉀通道廣泛分布於神經元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可興奮性組織中，是一種重要的跨膜結構蛋白，其參與調節神經遞質的分泌、血管收縮、胰腺分泌和骨骼肌興奮性等多種生理過程,同時也是治療藥物作用的重要靶標之一。鉀離子通道的結構與功能關係研究已經成為國際上的研究熱點。kv4.2鉀通道屬於瞬時外向鉀通道，在大腦、心臟、肺和平滑肌中高表達，它是動作電位復極化早期外向電流的主要成分，在調節神經元放電頻率和心肌興奮收縮耦聯等方面起重要作用。kv4.2鉀通道很可能成為神經性和心血管等疾病的重要治療靶點。很顯然，藉助kv4.2鉀通道的特異性調製劑對這些研究的深入開展是非常必要的。通過闡述這些特異性調製劑作用於鉀通道的分子機制，除了在理論上可深入推測kv4鉀通道亞型之間的功能活動區別和門控活動機制外，還可以為將它們開發成治療人類相關疾病的新藥提供充分的理論基礎和廣闊的應用前景。自然界的動物毒素是一類具有很高實用價值和應用前景的工具試劑或藥物導向物質，不僅是有毒動物抵禦天敵的有力武器，也是從事神經生物學和生理學研究、天然創新藥物開發以及蛋白質基礎研究的寶貴材料,同時也是研究離子通道的獨特「分子探針和解密器」。
技術實現要素：
本發明旨在於提供一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-xi在製備電壓門控鉀通道亞型工具試劑-kv4.2通道抑制劑的應用，所述的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-xi（簡寫為spkp-xi），其胺基酸序列為：
nh2-glucysarglysmetpheglyglycysservalaspseraspcyscysalahisleuglycyslysprothrleulystyrcysalatrpaspglythrphe-nh2，其特徵在於廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-xi作為單一有效活性組份用於製備kv4.2通道抑制劑。
所述的蜘蛛抑鉀肽-xi的n端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之間，n端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之間，n端第15位半胱氨酸和第28位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。
該蜘蛛抑鉀肽-xi作為單一有效活性組分用於製備kv4.2通道抑制劑，以細胞外給藥的方式製備成kv4.2通道工具試劑。
蜘蛛抑鉀肽-xi在製備kv4.2通道工具試劑或抑制劑時，配製細胞外給藥的劑量為5μmol/l。
蜘蛛抑鉀肽-xi對kv4.2通道的抑制呈現時間依從性和可逆性，是一種較好的kv4.2鉀通道工具試劑。
附圖說明
圖1是spkp-xi對表達於爪蟾卵母細胞的kv4.2鉀通道亞型的影響。
圖2是spkp-xi對表達於爪蟾卵母細胞的kv1.1鉀通道亞型的影響。
圖3是spkp-xi對表達於爪蟾卵母細胞的kv1.2鉀通道亞型的影響。
具體實施方式
為了更好的理解和更充分公開本發明，下面將通過細胞外給藥途徑，採用非洲爪蟾卵母細胞模型來說明蜘蛛抑鉀肽-xi的kv4.2通道抑制作用。
1、實驗材料和方法
1.1通道質粒的擴增和提取
採用promega公司的質粒提取試劑盒（wizard®plussvminiprepsdnapurificationsystem）。
溶液的配方如下：
細胞重懸液細胞裂解液
tris-hcl(ph7.5)50mmnaoh0.2m
edta10mm1%sds
rnasea100µg/ml
中和液洗脫液
鹽酸胍4.09m乙酸鉀60mm
乙酸鉀0.759mtris-hcl(ph7.5)8.3mm
冰醋酸2.12medta0.04mm
ph為4.2加入95%乙醇,終濃度為60%乙醇
操作步驟：
ø收集菌液（4℃，12000r/min，離心1min）
ø棄上清，用濾紙吸乾殘留在管壁的溶液，加入250μl細胞重懸液，充分混勻
ø加入250μl細胞裂解液，溫和上下顛倒4次混勻，放置5min
ø加入350μl中和液，溫和顛倒4次混勻
ø12000r/min離心10min
ø吸上清至離心柱中，12000r/min離心1min，棄下清
ø往離心柱中加入750μl洗脫液，靜置2min，12000r/min離心
1min，棄下清
ø重複第七步，加入250μl洗脫液，12000r/min離心1min棄下
清
ø離心柱風乾後轉移到乾淨滅菌的1.5mlep管上，加入50μl去
核酸酶水
ø10000r/min離心30s，所得的質粒dna可進行實驗或-20℃保
存
1.2質粒的線性化及回收
mkv1.1亞克隆用限制性內切酶noti線性化，rkv1.2用限制性內切酶sphi線性化，rkv4.2用限制性內切酶smaih線性化。
1.3cdna的體外轉錄和mrna的純化
mkv1.1、rkv1.2和rkv4.2cdna的體外轉錄均採用ambion公司的mmessagemmachinet7transcriptionkit試劑盒進行
1.4電壓鉗實驗活性檢測
取成年雌性非洲爪蟾，放入碎冰內麻醉約30min。或者在爪蟾周圍溶液（約400ml）中加入0.5g麻醉劑（3-氨基苯酸乙烷基酯），爪蟾1hr後會處於麻醉狀態。將處於麻醉狀態的爪蟾放在冰上，腹部朝上，用鑷子和手術刀在其腹部劃開一長約1.0～1.5cm的口，拉出子宮瓣，剪取2-3葉放入無鈣nd96溶液中。將子宮放回腹部，分層縫合傷口後，將爪蟾放在冰上恢復，待其甦醒後放回池中。將取出的卵葉用系線鑷初步分散成10－20個細胞一團。然後轉入50ml離心管中，加入含有膠原酶的無鈣nd96溶液，膠原酶終濃度為1mg/ml。在25℃,60rpm下酶解大約50min，直至80%以上的細胞已經去除濾泡膜及微血管後則可停止酶解。酶解完畢，用無鈣的nd96多次洗滌細胞，洗去殘留的膠原酶。然後，挑選個體比較大、動植物極分明的細胞轉入or2溶液在18℃培養。溶液配方：nd96（inmm）：nacl96、kcl2、cacl2-2h2o1.8、mgcl2-6h2o1、hepes-naoh5。用naoh調ph至7.5。or2(inmm):nacl82.5、kcl2.5、cacl2-2h2o1、mgcl2-6h2o1、na2hpo4-12h2o1、hepes5。用naoh調ph至7.5。使用前加入青黴素（10萬單位/l）。
電壓鉗實驗：通過顯微注射系統（wpi，german）將mrna注入挑選好的卵母細胞，每次注射體積約為20-50nl，從黑色的動物極一側注入。之後，放入18℃低溫振蕩培養箱中培養1～4天，每天更換一次新鮮的or2培養液。雙電極杆電壓鉗記錄在室溫（18～22℃）下進行。玻璃電極經一步拉制而成，灌注3mkcl後電阻為0.5-1.5mω。將細胞放入細胞槽中，用or2溶液灌流。然後將兩個玻璃電極分別插入細胞。將細胞鉗制在-80mv，給予去極化脈衝刺激。所用放大器為turbotec-03x（npielectronic,germany）。數據採集濾波為2khz。參比電極用ag/agcl電極與浴槽相連。刺激脈衝控制和電流信號記錄採用cellworks數據採集系統（npi公司，germany）。線性漏電流和電容電流不予刪除。數據分析採用sigmaplot軟體進行。所有毒素直接用or2溶液溶解並配製成目的濃度。
2、實驗結果與分析
2.1spkp-xi對電壓門控鉀通道的作用
我們採用雙電極電壓鉗技術研究了spkp-xi對鉀離子通道亞型的影響，其中延遲整流鉀通道kv1.1、kv1.2電流以同一種去極化方式誘導：將細胞膜電位鉗制在-90mv，以400ms的時程給予一測試電壓0mv，每隔5s重複一次；瞬時外向鉀通道kv4.2電流以另一種去極化方式誘導：將細胞膜電位鉗制在-90mv，以200ms的時程給予一測試電壓+20mv，每隔5s重複一次。5μmspkp-xi分別能抑制42%的kv4.2電流（見圖1）。5μmspkp-xi對kv1.1電流的抑制率為3.2%（見圖2）、對kv1.2電流的抑制率為2.6%、（見圖3），幾乎沒有抑制作用。因此我們可以得出spkp-xi是作用於kv4.2通道的抑制劑。
spkp-xi對kv4.2通道的抑制也呈現時間依從性，當spkp-xi的濃度為5μm時，可在不到2min的時間內達到最大抑制程度，而且spkp-xi對kv4.2通道的抑制作用是可以恢復的，即是可逆的。
sequencelisting
長沙沁才生物科技有限公司
蜘蛛抑鉀肽-xi
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廣西纓毛蛛
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