改進的小鼠擬胚體製作方法

2023-06-27 04:58:41

專利名稱：改進的小鼠擬胚體製作方法
改進的小鼠擬胚體製作方法本發明涉及動物擬胚體製作方法，尤其涉及一種改進的小鼠擬胚體製作方法。 [背景技術]伴隨著年齡的增長，特別是在現代的社會中隨著社會的進步及腦力勞動的比例增加，人們的體質迅速下降，人類老年退化性疾病呈現多發和高發，如分泌胰島素的胰腺細胞退化引起的糖尿病、分泌神經遞質多巴胺的神經細胞退化引起的帕金森病等。另外，一些家族遺傳性疾病，由於遺傳信息的突變而引發的家族遺傳性疾病，如地中海式貧血、血友病、白化病等。對於這些疾病能夠徹底治癒的最有效方法就是利用胚胎幹細胞(Embryonic stem cell，ES細胞)誘導分化技術，小鼠作為一種重要的實驗動物模型，小鼠ES細胞的誘導分化研究將會為人類再生醫學的成功實施奠定堅實的基礎。ES細胞是一種來源於囊胚內細胞團的多能性幹細胞群體，具有較強的再生能力和可塑性，在體外培養環境條件下，能夠高效地進行外源基因導入、基因敲除或基因改造等遺傳修飾操作。在一定的誘導環境條件下ES細胞能夠分化形成機體所有類型的組成細胞，包括雌性的卵母細胞和雄性的精子。ES 細胞向卵母細胞和精子的分化將會為轉基因動物的生產、新品種培育、野生動物保護及人的生殖健康等奠定重要的基礎，具有極強的應用價值和現實意義。經過遺傳操作的ES細胞在體外誘導分化成特定細胞，能夠有效治療遺傳性疾病，通過對小鼠ES細胞體外誘導分化成特定細胞的研究，為人類再生醫學的快速發展和人類疾病的生物療法奠定堅實的基礎。 擬胚體的成功製作是ES細胞向特定細胞高效分化的平臺和基礎。在細胞消化傳代培養中，含2. 5mg/ml胰酶-0. 2mg/ml EDTA的細胞消化液是常規的商品化試劑，常規擬胚體的製作中使用含2. 5mg/ml胰酶-0. 2mg/ml EDTA的細胞消化液把ES細胞連同飼養層細胞一起消化成單個細胞，把這些混合的細胞群體採用倒掛細胞液懸滴，細胞液懸滴中的混雜細胞共同形成細胞團，這樣形成的擬胚體細胞團中包含較多的飼養層細胞，由於飼養層細胞混雜在擬胚體中，極大地降低了擬胚體的質量，會導致下遊的分化效率降低和分化質量下降，從而嚴重影響多能性幹細胞向生殖細胞精子或卵子及其他類型細胞的分化效率，削弱ES細胞的臨床和生產的應用價值和意義。本發明要解決的技術問題是提供一種改進的小鼠擬胚體製作方法，其製作簡單、 效果明顯，製作的擬胚體質量可靠。為了解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是，改進的小鼠擬胚體製作方法， 包括如下步驟(1)小鼠ES細胞的培養取12. 5d小鼠胎兒成纖維細胞用高糖DMEM培養液進行培養，待細胞鋪滿培養皿後，用含2. 5mg/ml胰酶-0. 2mg/ml EDTA的細胞消化液消化傳代培養，取鋪滿培養皿的胎兒成纖維細胞用10 μ g/ml的絲裂黴素作用2. 5h，用含2. 5mg/ml胰酶-0. 2mg/ml EDTA的細胞消化液消化後接種至0. 1 %明膠處理的培養皿上於培養箱中進行培養，取接種後第2d均勻鋪滿培養皿的細胞用作飼養層；小鼠ES細胞Rl細胞係為商品化細胞系，取第26代小鼠ES 細胞Rl細胞系接種到小鼠胎兒成纖維細胞飼養層上，添加含1000U/ml LIF的高糖DMEM培養液進行培養；(2)擬胚體的製作取小鼠ES細胞用PBS洗滌，加入含2. 5mg/ml胰酶的細胞消化液放置於培養箱消化3min，用手輕輕震動拍打培養皿，收集脫落的牛iPS細胞集落，離心，PBS洗滌，再離心後用去除1000U/ml LIF的高糖DMEM培養液重懸，接種細胞至低貼附的細菌培養皿培養箱中
培養；(3)擬胚體的懸浮培養接種培養的第2d，從低貼附的細菌培養皿中連同擬胚體一起將細胞培養液轉移至離心管中，室溫靜止，待細胞集落形成的擬胚體自然沉澱到離心管底後，轉移擬胚體接種到新的低貼附的細菌培養皿中，補加去除1000U/ml LIF的高糖DMEM培養液於培養箱中培養；(4)擬胚體的貼壁培養擬胚體在低貼附的細菌培養皿中培養一周後，從低貼附的細菌培養皿中連同擬胚體一起將細胞培養液轉移至離心管中，室溫靜止，待細胞集落形成的擬胚體自然沉澱到離心管底後，轉移擬胚體接種到明膠包被的普通細胞培養皿中，補加去除1000U/ml LIF的高糖DMEM培養液於培養箱中培養，一周後即可用於體外三胚層分化能力檢測。本發明的有益效果是採用含2. 5mg/ml胰酶的細胞消化液將小鼠ES細胞消化為細胞集落，使得這些細胞集落中細胞完整地聚集在一起，並從飼養層細胞上脫離下來，而飼養層細胞則被消化成單個細胞。因此，採用含2. 5mg/ml胰酶的細胞消化液消化的ES細胞能夠直接製作高純度、 高質量小鼠ES細胞擬胚體。從而為小鼠ES細胞高效誘導分化成機體所需要的其他類型的細胞奠定了基礎。下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明。

圖1是自然狀態下生長在飼養層上小鼠ES細胞的生長形態；圖2是懸浮培養小鼠ES細胞形成擬胚體的生長形態；一、材料和方法(1)小鼠ES細胞的培養取12. 5d小鼠胎兒成纖維細胞用高糖DMEM培養液進行培養，待細胞鋪滿培養皿後，用含2. 5mg/ml胰酶-0. 2mg/ml EDTA的細胞消化液消化傳代培養，取鋪滿培養皿的胎兒成纖維細胞用10 μ g/ml的絲裂黴素作用2. 5h，用含2. 5mg/ml胰酶-0. 2mg/ml EDTA的細胞消化液消化後接種至0. 1 %明膠處理的培養皿上於培養箱中進行培養，取接種後第2d均勻鋪滿培養皿的細胞用作飼養層。小鼠ES細胞Rl細胞係為商品化細胞系，取第26代小鼠 ES細胞Rl細胞系接種到小鼠胎兒成纖維細胞飼養層上，添加含1000U/ml LIF的高糖DMEM培養液進行培養。(2)免疫螢光和鹼性磷酸酶染色檢測小鼠ES細胞經多聚甲醛室溫固定，Triton X-100的PBS溶液通透，BSA的PBS溶液封閉後，一抗為0ct4、NanOg、SSEA-I按1 200稀釋後分別添加至細胞上共孵育，PBS洗滌，添加紅色螢光標記的二抗按1 200稀釋後室溫避光共孵育，PBS洗滌，1 μ g/ml的DAPI 細胞核染色，螢光鏡下觀察。小鼠ES細胞經多聚甲醛固定，添加鹼性磷酸酶染液進行染色， 以胞漿著色為紅棕色或咖啡色顆粒為陽性。(3)擬胚體的製作取小鼠ES細胞用PBS洗滌，加入含2. 5mg/ml胰酶的細胞消化液放置於培養箱消化3min，用手輕輕震動拍打培養皿，收集脫落的牛iPS細胞集落，離心，PBS洗滌，再離心後用去除1000U/ml LIF的高糖DMEM培養液重懸，接種細胞於低貼附的細菌培養皿中培養箱
中培養。(4)擬胚體的懸浮培養接種培養的第2d，從低貼附的細菌培養皿中連同擬胚體一起將細胞培養液轉移至離心管中，室溫靜止，待細胞集落形成的擬胚體自然沉澱到離心管底後，轉移擬胚體接種到新的低貼附的細菌培養皿中，補加去除1000U/ml LIF的高糖DMEM培養液於培養箱中培養。(5)擬胚體的貼壁培養擬胚體在低貼附的細菌培養皿中培養一周後，從低貼附的細菌培養皿中連同擬胚體一起將細胞培養液轉移至離心管中，室溫靜止，待細胞集落形成的擬胚體自然沉澱到離心管底後，轉移擬胚體接種到明膠包被的普通細胞培養皿中，補加去除1000U/ml LIF的高糖DMEM培養液於培養箱中培養，一周後用於體外三胚層分化能力檢測。(6)擬胚體的體外分化檢測小鼠ES細胞體外分化擬胚體經多聚甲醛室溫固定，Triton X-100的PBS溶液 MiS., BSA 白勺 PBS一㈱力 α -actinin (Sarcomeric)、 α —Fetoprotein (AFP)、 Neurofilament 200，一抗按1 200稀釋後分別添加至細胞上共孵育，PBS洗滌，紅色螢光標記的二抗按1 200稀釋後室溫避光共孵育，PBS洗滌，1 μ g/mL的DAPI細胞核染色，螢光鏡下觀察。二、結果(1)小鼠ES細胞的生長狀態小鼠ES細胞在12. 5d胎兒成纖維細胞飼養層上，形態較為一致，細胞集落為鳥巢狀(圖1)，集落向上突起明顯，生長速度快，用含2. 5mg/ml胰酶-0. 2mg/ml EDTA的細胞消化液消化後在按1 3消化傳代的情況下，ES細胞從細胞集落中分離出來，細胞呈單個、體積較小，在飼養層上生長的ES細胞集落2d傳代一次。經鹼性磷酸酶染液作用後，小鼠ES細胞集落鹼性磷酸酶染色呈強陽性，細胞集落呈棕紅色或紫紅色。小鼠ES細胞高水平表達幹細胞標記蛋白0ct4、NanOg及SSEA-I。結果顯示小鼠ES細胞保持良好的未分化生長狀態。(2)小鼠ES細胞擬胚體的形成小鼠ES細胞經含2. 5mg/ml胰酶的細胞消化液消化後，ES細胞集落保持完整、均為細胞克隆，在低粘附力的培養皿中，細胞克隆直接形成擬胚體，形成的擬胚體形態為圓球形，表面光滑晶亮(圖2)。ES細胞集落在低粘附力的細菌培養皿上接種後第ld，從培養皿上消化的飼養層細胞在低粘附力的細菌培養皿上能夠貼壁生長，在小鼠ES細胞擬胚體更換新的培養皿時貼壁的飼養層細胞被去除，製作形成的ES細胞擬胚體具有較高的細胞純度。伴隨著ES細胞擬胚體培養時間的延長，擬胚體組成細胞間連接逐步變得較為緻密，擬胚體間較易出現相互粘附形成更大的擬胚體集落，擬胚體的顏色逐步由淺變深。(3)小鼠ES細胞擬胚體的三胚層分化小鼠ES細胞擬胚體經過懸浮培養後在明膠包被的普通細胞培養皿中貼壁生長，貼壁的擬胚體呈現自發分化，經過免疫細胞化學檢測顯示，具有多能性的小鼠ES細胞製作的擬胚體能夠高效向機體三個胚層的組成細胞分化，分化形成表達α -actinin (Sarcomeric) 的中胚層心肌細胞、表達α-Fetoprotein(AFP)的內胚層肝細胞、表達Neurof ilament外胚層神經細胞。本實施例通過這種簡單的小鼠ES細胞擬胚體製作方法，ES細胞擬胚體在體外能夠分化成機體的三個胚層組成細胞，從而為利用小鼠ES細胞擬胚體製作技術誘導形成機體所有類型組成細胞乃至生殖細胞精子和卵子奠定堅實的基礎。
權利要求
1.改進的小鼠擬胚體製作方法，包括如下步驟(1)小鼠ES細胞的培養取12. 5d小鼠胎兒成纖維細胞用高糖DMEM培養液進行培養，待細胞鋪滿培養皿後，用含2. 5mg/ml胰酶-0. 2mg/ml EDTA的細胞消化液消化傳代培養，取鋪滿培養皿的胎兒成纖維細胞用10 μ g/ml的絲裂黴素作用2. 5h，用含2. 5mg/ml胰酶-0. 2mg/ml EDTA的細胞消化液消化後接種至0. 1 %明膠處理的培養皿上於培養箱中進行培養，取接種後第2d均勻鋪滿培養皿的細胞用作飼養層；小鼠ES細胞Rl細胞係為商品化細胞系，取第26代小鼠ES細胞 Rl細胞系接種到小鼠胎兒成纖維細胞飼養層上，添加含1000U/ml LIF的高糖DMEM培養液進行培養；(2)擬胚體的製作取小鼠ES細胞用PBS洗滌，加入含2. 5mg/ml胰酶的細胞消化液放置於培養箱消化 3min，用手輕輕震動拍打培養皿，收集脫落的牛iPS細胞集落，離心，PBS洗滌，再離心後用去除1000U/ml LIF的高糖DMEM培養液重懸，接種細胞至低貼附的細菌培養皿中培養箱中培養；(3)擬胚體的懸浮培養接種培養的第2d，從低貼附的細菌培養皿中連同擬胚體一起將細胞培養液轉移至離心管中，室溫靜止，待細胞集落形成的擬胚體自然沉澱到離心管底後，轉移擬胚體接種到新的低貼附的細菌培養皿中，補加去除1000U/ml LIF的高糖DMEM培養液於培養箱中培養；(4)擬胚體的貼壁培養擬胚體在低貼附的細菌培養皿中培養一周後，從低貼附的細菌培養皿中連同擬胚體一起將細胞培養液轉移至離心管中，室溫靜止，待細胞集落形成的擬胚體自然沉澱到離心管底後，轉移擬胚體接種到明膠包被的普通細胞培養皿中，補加去除1000U/ml LIF的高糖 DMEM培養液於培養箱中培養，一周後即可用於體外三胚層分化能力檢測。
全文摘要
本發明公開了改進的小鼠擬胚體製作方法，其步驟包括小鼠ES細胞的培養、擬胚體的製作、擬胚體的懸浮培養和擬胚體的貼壁培養。本發明採用含胰酶的細胞消化液將小鼠ES細胞消化為細胞集落，使得這些細胞集落中細胞完整地聚集在一起，並從飼養層細胞上脫離下來，而飼養層細胞則被消化成單個細胞，從而能夠直接製作高純度、高質量小鼠ES細胞擬胚體。
文檔編號C12N5/073GK102329770SQ20111028647
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月23日 優先權日2011年9月23日
發明者丁建平, 任春環, 劉亞, 劉洪瑜, 張子軍, 張運海, 方富貴, 曹鴻國, 李運生, 楊盼, 章孝榮, 蒲勇, 陶勇 申請人:安徽農業大學