一種提取魚類粘孢子蟲基因組dna方法
2023-06-27 03:28:06 1
專利名稱：一種提取魚類粘孢子蟲基因組dna方法
技術領域：
本發明涉及一種提取魚類粘孢子蟲基因組DNA方法。
背景技術：
粘孢子蟲指粘孢子綱(Myxosporea)的一大類原蟲，是在海水及淡水魚類寄生蟲 中種類最多、最為常見的一類孢子蟲。粘孢子蟲在發育過程中，無例外地產生種種形狀和不 同大小的孢子，故稱為粘孢子蟲。國內外，粘孢子蟲病的流行相當普遍和嚴重，至今仍未有比較有效的控制方法。常 見的防治方法多採用生石灰和石灰氮作器具消毒。在中國各養魚地區，流行著多種粘孢子 蟲病，例如鰱碘孢蟲流行於浙江杭州地區以及江蘇、湖北、湖南等省，它侵入白鰱的神經系 統和感覺器官，使病魚體瘦，尾巴上翹，上下打轉，不久即死亡；餅型碘泡蟲常大量侵襲草魚 苗的內臟組織和鰓，主要是腸道，嚴重危害草魚苗的生產，這種病在中國以廣東最為嚴重; 流行於廣東和廣西的「埋坎病」，其主要病原體是野鯉碘泡蟲。常出現在鯉、鯽魚皮膚上的鯪 單極蟲，往往使魚體布滿白色點狀或塊狀孢囊，嚴重影響魚的生長發育，甚至引起死亡。每一種粘孢子蟲在寄主中有它的寄生部位。在淡水魚類中，鰓、腸和膽囊是最常被 侵襲的器官；海洋魚類的膽囊和膀胱往往寄生1種或多種粘孢子蟲。當粘孢子蟲感染魚體 時會形成滋養體，滋養體繼續發育，胞核反覆多次分裂，形成幾個孢母體(sporonts)。孢母 體繼續生長發育，其胞核也進行幾次分裂，形成6 18個子核，最後形成孢子。滋養體繼續 生長，形成的孢子數目也隨之增多。在滋養體周圍的寄主組織，因不斷受刺激而發生退化和 改變，產生一層膜將滋養體包圍，出現肉眼可見的白色粘孢子蟲孢囊。粘孢子蟲的生活史還不完全清楚。對整個生活周期中核的變化、感染方法以及有 無中間寄主等方面，也存在著較多的爭論。有研究表明MyxoboIus cerebral is、Ceratomyxa shasta的孢子不能直接感染鮭魚，需要顫蚓科的蠕蟲作為中間宿主，但是也存在魚與魚之 間能夠直接感染的粘孢子蟲種類，如Enteromyxum等。從魚類宿主中分離粘孢子蟲孢子並提取純化基因組DNA是對粘孢子蟲分類鑑定 研究的基礎；同時也是防治孢子蟲感染的重要研究基礎和發展方向。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種提取粘孢子蟲基因組DNA方法。本發明提供的提取粘孢子蟲基因組DNA方法，包括如下步驟1)將粘孢子蟲孢子研磨成粉，加入提取液混勻，得到混合液；2)向步驟1)的混合液中加入氯仿異戊醇混合液混勻、離心，收集上清液；3)向步驟2、得到的上清液中加入氯仿異戊醇混合液混勻，離心，收集上清液；4)向步驟幻得到的上清液中加入異丙醇混勻，靜置，收集沉澱；5)將步驟4)得到的沉澱依次進行漂洗、乾燥、溶解、RNA消化，得到消化產物；6)將步驟幻得到的消化產物依次用酚氯仿異戊醇混合液和氯仿異戊醇混合液進行抽提，離心、收集上清液；7)向步驟6)得到的上清液中加入3MNaAc水溶液和無水乙醇混勻，靜置，離心，收 集沉澱，得到DNA。步驟1)中，所述提取液與所述粘孢子蟲孢子的配比為(10ml-50ml) (1. 5g_2g)， 所述提取液與所述粘孢子蟲孢子的配比具體為(10ml、40ml或50ml) (1. 5g、1. 8g或2g)；步驟2)中，所述步驟1)的混合液和所述氯仿異戊醇混合液的體積比為 1 (1-2)，所述步驟1)的混合液和所述氯仿異戊醇混合液的體積比具體為1 1、1 1.5 或1 2，步驟3)中，所述步驟2)的上清液和所述氯仿異戊醇混合液的體積比為 1 (1-2)，所述步驟幻的上清液和所述氯仿異戊醇混合液的體積比具體為1 1、1 1.5 或1 2，步驟4)中，所述步驟3)得到的上清液和所述異丙醇的體積比為(1-3) (1-2)； 所述步驟幻得到的上清液和所述異丙醇的體積比具體為1 1、3 2或3 1;所述異丙 醇的溫度為-20°C ；步驟幻中，所述漂洗為依次用75% (體積百分含量)乙醇水溶液、75% (體積百 分含量)乙醇水溶液和無水乙醇進行漂洗；所述溶解的方法為用TE緩衝液溶解所述沉澱得到溶液A，TE緩衝液由溶質和溶劑組成，所述溶質為Tris鹼、EDTA，所述溶劑為水，所述Tris 鹼在所述TE緩衝液中的濃度為10mM，所述EDTA在所述TE緩衝液中的濃度為ImM，用鹽酸 調PH值至8.0。所述消化的方法為向所述溶液A中加入RNaseA得到消化產物，RNaseA加入量為 20mg/l 溶液 A ；步驟6)包括如下步驟A)將步驟幻得到的消化產物和是其1倍-3倍體積的酚氯仿異戊醇混合液混勻， 離心，收集上清液A，所述將步驟幻得到的消化產物和是其1倍-3倍體積的酚氯仿異戊醇混合液具體 為將步驟幻得到的消化產物和是其1倍、2倍或3倍體積的酚氯仿異戊醇混合液；B)將步驟A得到的上清液A和是其1倍-3倍體積的氯仿異戊醇混合液混勻，離 心，收集上清液，所述將步驟A)得到的上清液A和是其1倍-3倍體積的氯仿異戊醇混合液具體為 將步驟A)得到的上清液A和是其1倍、2倍或3倍體積的氯仿異戊醇混合液；步驟7)中，所述步驟6)得到的上清液、所述3MNaAc水溶液和所述無水乙醇的體 積比為1 (0.05-0.2) (2-3)，具體為 1 (0·005、0· 1 或 0.2) (2、2.5 或 3)。步驟1)中，所述提取液由溶質和溶劑組成，所述溶質為NaCl、EDTA、SDS、Tris，所 述溶劑為水，所述iTris在所述提取液中的濃度為0. 1M-0. 5M，所述NaCl在所述提取液中的 濃度為0. 4M-0. 6M，所述EDTA在所述提取液中的濃度為0. 005M-0. 015M，；所述SDS在所述 提取液中的濃度為10g/l-20g/l ；所述Tri s在所述提取液中的濃度具體為0. 1M、0. 2M或0. 5M，所述NaCl在所述提 取液中的濃度具體為0. 4M、0. 5M或0. 6M，所述EDTA在所述提取液中的濃度具體為0. 005M、0.0說或0.01511;所述SDS在所述提取液中的濃度具體為10g/l、15g/l或20g/l ；所述提取液的PH值為7. 5 ；步驟2、、步驟幻和步驟6)中，所述氯仿異戊醇混合液均由氯仿和異戊醇組成，所 述氯仿和異戊醇的體積比均為M 1 ；步驟4)中，所述靜置時間為20min-40min，所述靜置時間具體為20min、30min或 40min ；所述靜置的溫度為-20°C -4°C，所述靜置的溫度具體為-20°C、0°C或4°C ；步驟5)中，所述消化的溫度為35°C _38°C，所述消化的溫度具體為35°C、37°C或 38°C，所述消化的時間為0. 5h-l. 5h，所述消化時間具體為0. 5hUh或1.證；步驟6)中，所述離心的溫度為0°C -4°C，所述離心的溫度具體為0°C、1°C或4°C， 所述離心的離心力為10000g-13000g，所述離心的離心力具體為10000g、12000g或13000g， 所述離心的時間為5min-15min，所述離心的時間具體為5min、IOmin或15min ；所述酚氯仿異戊醇混合液由酚、氯仿和異戊醇組成，所述酚、氯仿和異戊醇的體積 比為25 24 1 ；所述酚氯仿異戊醇混合液的PH值為8.0 ；步驟7)中，所述離心的溫度為0°C -4°C，所述離心的溫度具體為0°C、1°C或4°C， 所述離心的離心力為10000g-13000g，所述離心的離心力具體為10000g、12000g或13000g， 所述離心的時間為5min-15min，所述離心的時間具體為5min、IOmin或15min。步驟1)中，所述研磨為在液氮中研磨；步驟2)和步驟3)中，所述離心的溫度均為0°C -4°C，所述離心的溫度均具體 為0 °C、1°C或4 °C，所述離心的離心力均為IOOOOg-13000g，所述離心的離心力均具體為 IOOOOg, 12000g或13000g,所述離心的時間均為5min_15min，所述離心的時間均具體為 5min、IOmin 或 15min ；步驟7)中，所述靜置時間為20min-60min，所述靜置時間具體為20min、30min或 60min ；所述靜置溫度為_70°C _20°C，所述靜置溫度具體為-70°C、0°C、20°C。所述粘孢子蟲為單極蟲屬、吉陶單極蟲CThelohanellus kitauei)。本發明的另一個目的是提供一種分離粘孢子蟲孢子的方法。本發明提供的分離粘孢子蟲孢子的方法，包括如下步驟a)用PBS緩衝液衝洗粘孢子蟲孢子囊，得到粘孢子蟲孢子溶液；b)將步驟a)得到的粘孢子蟲孢子溶液離心、收集沉澱；c)向步驟b)得到的沉澱中加入PBS緩衝液和SDS水溶液，混合，離心，收集沉澱；d)向步驟c)得到的沉澱中加入PBS緩衝液和SDS水溶液，混合，離心，收集沉澱， 即為粘孢子蟲孢子。步驟b)中，所述離心的離心力為5000g-8000g，具體為5000g、6000g或8000g，所 述離心的時間為5min-15min，具體為5min、10min或15min， 步驟c)和步驟d)中，所述PBS緩衝液與所述SDS水溶液的體積比為10 0.5。步驟a)、c)和d)中，所述PBS緩衝液按照如下方法配製將NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4 和水混合得到PBS緩衝液，NaCl在PBS緩衝液中的濃度為8g/l，Na2HPO4在PBS緩衝液的濃 度為2. 2g/l，Na2HPO4在PBS緩衝液的濃度為0. 4g/l ；所述PBS緩衝液的PH值均為7. 0 ；步驟c)和d)中，所述混合的溫度均為M°d8°C，所述混合的溫度均具體為
7M °C、25 °C或觀°C，所述混合的時間均為5min-l5min，所述混合的時間均具體為5min、 IOmin或15min，所述混合的方式均為顛倒混合；所述SDS水溶液的濃度均為200g/l。步驟c)和d)中，所述離心的離心力均為6000g-10000g，所述離心的離心力均具 體為6000g、8000g或10000g，所述離心的時間均為5min_15min，所述離心的時間均具體為 5min、IOmin 或 15min。所述粘孢子蟲為單極蟲屬、吉陶單極蟲(Thelohanellus kitauei)。所述的方法在粘孢子蟲分類鑑定中的應用也是本發明保護的範圍。本發明的實驗證明，用本方法提取的基因組，經過檢測，基因組DNA的純度高，不 含有宿主的基因，而且提取量多，因此可以用來鑑定粘孢子蟲孢子。
圖1為DM3粘孢子蟲基因組樣品PCR擴增結果圖2為尾孢蟲屬孢子形態特徵圖3為碘泡蟲屬孢子形態特徵圖4為單極蟲屬孢子形態特徵圖5為染色後單極蟲屬孢子形態特徵
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、提取粘孢子蟲基因組DNA方法一一、粘孢子蟲基因組DNA提取1、從感染粘孢子蟲宿主分離孢子囊粘孢子蟲的感染和孢子囊的生長部位具有很高的特異性，因此在取樣時只取同一 部位生長的孢子囊。從感染粘孢子蟲的死的鯽魚(Cyprinus carpio)腸道部位中解剖分離出6個粘孢 子蟲孢子囊，分別編號為DM1-DM6。 2、從孢子囊中分離粘孢子蟲孢子顆粒用滅菌的PH值為7. 0的PBS小心將孢子顆粒從1個孢子囊(DMl)中衝洗出，操作 中儘量細緻，防止孢子囊壁的組織細胞混入孢子顆粒中，即得到含有粘孢子蟲孢子的樣品。將樣品轉移至50ml離心管4°C保存。PBS緩衝液按照如下方法配製將NaCl、Na2HP04、NaH2PO4和水混合，NaCl在PBS緩 衝液中的濃度為8g/l，Na2HPO4在PBS緩衝液的濃度為2. 2g/l，Na2HPO4在PBS緩衝液的濃 度為 0. 4g/l。3、去除粘孢子蟲混有的宿主細胞將得到的含有粘孢子蟲孢子的樣品以6000 X g離心lOmin，小心倒掉上清液；向沉 澱中加入IOml滅菌PH值為7. 0的PBS，再加入0. 5ml濃度為200g/l的SDS水溶液，至其終 濃度達到10g/l，在25°C處理IOmin期間顛倒混勻，再以8000X g離心IOmin小心倒掉上清液；向離心管中加入滅菌PBS，重懸孢子，再重複SDS處理操作兩次；操作過程中不斷進行鏡 檢，觀察孢子沉澱情況及孢子純度，將得到的粘孢子蟲孢子沉澱置於_20°C保存。4、應用液氮研磨的方法提取基因組DNA取上述2. Og粘孢子蟲孢子沉澱在液氮中迅速研磨成粉；加入IOmL提取液，快速 振蕩混勻；加入等體積的的氯仿異戊醇混合液(氯仿異戊醇的體積比為M 1)混勻，以 ( ，^， (^，離心川！^!!。上清液再用等體積的氯仿異戊醇混合液(氯仿異戊醇的體積比 為對1)抽提一次。以4°C，12，000g，離心lOmin。取上清液，加入2/3倍體積的_20°C預 冷的異丙醇沉澱，混勻，靜置約30min。用毛細玻棒挑出絮狀沉澱，用75%乙醇反覆漂洗數 次，再用無水乙醇漂洗1次，吹乾，重懸於500ulTE中，加入1μ lRNaseA(10mg/mL)，37°C下 處理lh，得到的消化產物和是其1倍體積酚氯仿異戊醇混合液(pH8. 0，酚氯仿、異戊醇的體 積比為25 24 1)混合，以4°C，12，000g，離心lOmin。取上清液A，將上清液A和是其1 倍體積的氯仿異戊醇混合液(氯仿異戊醇的體積比為M 1混勻，以41，12，00(^，離心 IOmin0取上清液，加入1/10倍體積的3MNaAc水溶液，2. 5倍體積的無水乙醇，_70°C靜置沉 澱30min。沉澱用75%乙醇漂洗，風乾，溶於200ulTE中，得到DNA樣品，命名為DM1，_20°C 保存。DNA提取液由溶質和溶劑組成，所述溶質為NaCl、EDTA、SDS、Tris，所述溶劑為水， 所述Tris在所述提取液中的濃度為0. 2M，所述NaCl在所述提取液中的濃度為0. 5M，所述 EDTA在所述提取液中的濃度為0. OlM ；所述SDS在所述提取液中的濃度為15g/l ；DNA提取 液的PH值為7.5。TE緩衝液由溶質和溶劑組成，所述溶質為Tris鹼、EDTA，所述溶劑為水，所述Tris 鹼在所述Tris鹼中的濃度為10mM，所述EDTA在所述TE緩衝液中的濃度為ImM，用鹽酸調 PH值至8. O。方法二一、粘孢子蟲基因組DNA提取1、從感染粘孢子蟲宿主分離孢子囊粘孢子蟲的感染和孢子囊的生長部位具有很高的特異性，因此在取樣時只取同一 部位生長的孢子囊。從感染粘孢子蟲的死的鯽魚(Cyprinus carpio)腸道部位中分離出粘孢子蟲孢子囊。2、從孢子囊中分離粘孢子蟲孢子顆粒用滅菌的PH值為7. 0的PBS小心將孢子顆粒從1個孢子囊中衝洗出，操作中儘量 細緻，防止孢子囊壁的組織細胞混入孢子顆粒中，即得到含有粘孢子蟲孢子的樣品。將樣品轉移至50ml離心管4°C保存。PBS緩衝液按照如下方法配製將NaCl、Na2HP04、NaH2PO4和水混合，NaCl在PBS緩 衝液中的濃度為8g/l，Na2HPO4在PBS緩衝液的濃度為2. 2g/l，Na2HPO4在PBS緩衝液的濃 度為 0. 4g/l。3、去除粘孢子蟲混有的宿主細胞將得到的含有粘孢子蟲孢子的樣品以5000Xg離心5min，小心倒掉上清液；向沉 澱中加入IOml滅菌PBS，再加入0. 5ml濃度為200g/l的SDS水溶液，至其終濃度達到IOg/L，在24°C處理5min期間顛倒混勻，再以6000Xg離心5min小心倒掉上清液；向離心管中 加入滅菌PBS，重懸孢子，再重複SDS處理操作兩次；操作過程中不斷進行鏡檢，觀察孢子沉 澱情況及孢子純度，將得到的粘孢子蟲孢子沉澱置於_20°C保存。4、應用液氮研磨的方法提取基因組DNA取上述1. 5g粘孢子蟲孢子沉澱在液氮中迅速研磨成粉；加入40mL提取液，快速 振蕩混勻；加入1.5倍體積氯仿異戊醇混合液(氯仿異戊醇的體積比為M 1)混勻，以 !^ ， (^，離心日！^!!。上清液再用1.5倍體積的氯仿異戊醇混合液(氯仿異戊醇的體 積比為M 1)抽提一次。以0°C，10，000g，離心5min。取上清液，加入等體積的_20°C預 冷的異丙醇沉澱，混勻，靜置約20min。用毛細玻棒挑出絮狀沉澱，用75%乙醇反覆漂洗數 次，再用無水乙醇漂洗1次，吹乾，重懸於500ulTE中，加入1 μ IRNaseA (10mg/mL)，下處 理0. ！。得到的消化產物和是其2倍體積酚氯仿異戊醇混合液(pH8.0，酚氯仿、異戊醇的 體積比為25 24 1)混合，以0°C，10，000g，離心5min。取上清液A，將上清液A和是其 2倍體積的氯仿異戊醇混合液(氯仿異戊醇的體積比為M 1混勻，以0°C，10，000g，離心 5min。取上清液，加入0. 005倍體積的3MNaAc水溶液，2倍體積的無水乙醇，0°C靜置沉澱 20min。沉澱用75%乙醇漂洗，風乾，溶於200ulTE中，得到DNA樣品，命名為DMl，-20°C保 存。DNA提取液由溶質和溶劑組成，所述溶質為NaCl、EDTA、SDS、Tris，所述溶劑為水， 所述Tris在所述提取液中的濃度為0. 1M，所述NaCl在所述提取液中的濃度為0. 4M，所述 EDTA在所述提取液中的濃度為0. 005M ；所述SDS在所述提取液中的濃度為10g/l ；DNA提取 液的PH值為7.5。TE緩衝液由溶質和溶劑組成，所述溶質為Tris鹼、EDTA，所述溶劑為水，所述Tris 鹼在所述Tris鹼中的濃度為10mM，所述EDTA在所述TE緩衝液中的濃度為ImM，用鹽酸調 PH值至8. O。方法三一、粘孢子蟲基因組DNA提取1、從感染粘孢子蟲宿主分離孢子囊粘孢子蟲的感染和孢子囊的生長部位具有很高的特異性，因此在取樣時只取同一 部位生長的孢子囊。從感染粘孢子蟲的死的鯽魚(Cyprinus carpio)腸道部位中分離出粘孢子蟲孢子果。2、從孢子囊中分離粘孢子蟲孢子顆粒用滅菌的PH值為7. 0的PBS小心將孢子顆粒從1個孢子囊中衝洗出，操作中儘量 細緻，防止孢子囊壁的組織細胞混入孢子顆粒中，即得到含有粘孢子蟲孢子的樣品。將樣品轉移至50ml離心管4°C保存。PBS緩衝液按照如下方法配製將NaCl、Na2HP04、NaH2PO4和水混合，NaCl在PBS緩 衝液中的濃度為8g/l，Na2HPO4在PBS緩衝液的濃度為2. 2g/l，Na2HPO4在PBS緩衝液的濃 度為 0. 4g/l。3、去除粘孢子蟲混有的宿主細胞將得到的含有粘孢子蟲孢子的樣品以SOOOXg離心15min，小心倒掉上清液；向沉澱中加入IOml滅菌PBS，再加入0. 5ml濃度為200g/l的SDS水溶液，至其終濃度達到IOg/ 1，在處理15min期間顛倒混勻，再以IOOOOXg離心15min小心倒掉上清液；向離心管 中加入滅菌PBS，重懸孢子，再重複SDS處理操作兩次；操作過程中不斷進行鏡檢，觀察孢子 沉澱情況及孢子純度，將得到的粘孢子蟲孢子沉澱置於_20°C保存。4、應用液氮研磨的方法提取基因組DNA取上述1.8g粘孢子蟲孢子沉澱在液氮中迅速研磨成粉；加入50mL提取液，快速振 蕩混勻；加入2倍體積的氯仿異戊醇混合液(氯仿異戊醇的體積比為M 1)混勻，以1°C， 13，000g，離心15min。上清液再用2倍體積的氯仿異戊醇混合液(氯仿異戊醇的體積比為 24 1)抽提一次。以l°C，13，000g，離心15min。取上清液，加入1/3倍體積的_20°C預冷 的異丙醇沉澱，混勻，靜置約40min。用毛細玻棒挑出絮狀沉澱，用75%乙醇反覆漂洗數次， 再用無水乙醇漂洗1次，吹乾，重懸於500ulTE中，加入1 μ IRNaseA (10mg/mL)，38°C下處理 1. 5h，得到的消化產物和是其3倍體積酚氯仿異戊醇混合液(pH8. 0，酚氯仿、異戊醇的體積 比為25 24 1)混合，以l°C，13，000g，離心15min。取上清液A，將上清液A和是其3 倍體積的氯仿異戊醇混合液(氯仿異戊醇的體積比為M 1混勻，以11，13，00(^，離心 15min。取上清液，加入0. 2倍體積的3MNaAc水溶液，3倍體積的無水乙醇，20°C靜置沉澱 60min。沉澱用75%乙醇漂洗，風乾，溶於200ulTE中，得到DNA樣品，命名為DMl，-20°C保 存。DNA提取液由溶質和溶劑組成，所述溶質為NaCl、EDTA、SDS、Tris，所述溶劑為水， 所述Tris在所述提取液中的濃度為0. 5M，所述NaCl在所述提取液中的濃度為0. 6M，所述 EDTA在所述提取液中的濃度為0. 015M ；所述SDS在所述提取液中的濃度為20g/l ；用鹽酸 調節PH值為7. 5 ；TE緩衝液由溶質和溶劑組成，所述溶質為Tris鹼、EDTA，所述溶劑為水，所述Tris 鹼在所述Tris鹼中的濃度為10mM，所述EDTA在所述TE緩衝液中的濃度為ImM，用鹽酸調 PH值至8.0。檢測上述方法一提取DM2、DM3、DM4、DM5和DM6這5個孢囊中孢子的DNA。二、檢測結果1、檢測DNA的含量用紫外分光法測定方法一提取DM1、DM2、DM3、DM4、DM5和DM6的DNA的純度和含 量。當DNA樣品中含有蛋白質、酚或其他小分子汙染物時，會影響DNA吸光度的準確測定。 通過檢測同一樣品的0擬60、0D280和0D230，計算其比值來測定樣品的純度。結果為方法一提取DMl、DM2、DM3、DM4、DM5 和 DM6 的 DNA 的 0D260/0D280 均為 1.8( > 1.9，表明有RNA汙染；< 1.6，表明有蛋白質、酚等汙染)；對於方法一提取DM1、DM2、DM3、DM4、DM5和DM6的DNA樣品，通過測定^Onm的
光吸收值即可算出含量(將樣品放入儀器中即可直接讀出濃度和純度的相關數值，Thermo Scientific NanoDrop公司Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白測定儀)，實驗重複三次，結 果取平均值。結果如表1所示表1目前獲得DNA樣品量
權利要求
1.一種提取粘孢子蟲基因組DNA方法，包括如下步驟1)將權利要求6-9中任一所述方法得到的粘孢子蟲孢子研磨成粉，加入提取液混勻， 得到混合液；2)向步驟1)的混合液中加入氯仿異戊醇混合液混勻、離心，收集上清液；3)向步驟幻得到的上清液中加入氯仿異戊醇混合液混勻，離心，收集上清液；4)向步驟幻得到的上清液中加入異丙醇混勻，靜置，收集沉澱；5)將步驟4)得到的沉澱依次進行漂洗、乾燥、溶解、RNA消化，得到消化產物；6)將步驟幻得到的消化產物依次用酚氯仿異戊醇混合液和氯仿異戊醇混合液進行抽 提，離心、收集上清液；7)向步驟6)得到的上清液中加入3MNaAc水溶液和無水乙醇混勻，靜置，離心，收集沉 澱，得到DNA。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟1)中，所述提取液與所述粘孢子蟲孢子的配比為(10ml-50ml) (1.5g-2g)，所述 提取液與所述粘孢子蟲孢子的配比具體為(10ml、40ml或50ml) (1. 5g、l. 8g或2g)；步驟幻中，所述步驟1)的混合液和所述氯仿異戊醇混合液的體積比為1 (1-2)，所 述步驟1)的混合液和所述氯仿異戊醇混合液的體積比具體為1 1、1 1.5或1 2;步驟幻中，所述步驟幻的上清液和所述氯仿異戊醇混合液的體積比為1 (1-2)，所 述步驟幻的上清液和所述氯仿異戊醇混合液的體積比具體為1 1、1 1.5或1 2;步驟4)中，所述步驟幻得到的上清液和所述異丙醇的體積比為(1-3) (1-2)；所述 步驟幻得到的上清液和所述異丙醇的體積比具體為1 1、3 2或3 1;所述異丙醇的 溫度為"200C ；步驟幻中，所述漂洗為依次用75% (體積百分含量)乙醇水溶液、75% (體積百分含 量)乙醇水溶液和無水乙醇進行漂洗；所述溶解的方法為用TE緩衝液溶解所述沉澱得到溶液A，所述消化的方法為向所述溶液A中加入RNaseA得到消化產物，所述RNaseA加入量為 20mg/l 溶液 A ；步驟6)包括如下步驟:A)將步驟幻得到的消化產物和是其1倍-3倍體積的酚氯仿 異戊醇混合液混勻，離心，收集上清液A，所述將步驟幻得到的消化產物和是其1倍-3倍體積的酚氯仿異戊醇混合液具體為將 步驟幻得到的消化產物和是其1倍、2倍或3倍體積的酚氯仿異戊醇混合液；B)將步驟A得到的上清液A和是其1倍-3倍體積的氯仿異戊醇混合液混勻，離心，收 集上清液，所述將步驟A)得到的上清液A和是其1倍-3倍體積的氯仿異戊醇混合液具體為將步 驟A)得到的上清液A和是其1倍、2倍或3倍體積的氯仿異戊醇混合液；步驟7)中，所述步驟6)得到的上清液、所述3MNaAc水溶液和所述無水乙醇的體積比 為1 (0.05-0.2) 0-3)，具體為 1 (0. 005、0. 1 或 0. 2) (2、2.5 或 3)。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於步驟1)中，所述提取液由溶質和溶劑組成，所述溶質為NaCl、EDTA、SDS、Tris，所述溶 劑為水，所述Tris在所述提取液中的濃度為0. 1M-0. 5M，所述NaCl在所述提取液中的濃度為0. 4M-0. 6M，所述EDTA在所述提取液中的濃度為0. 005M-0. 015M，所述SDS在所述提取液 中的濃度為10g/l-20g/l ；所述Tri s在所述提取液中的濃度具體為0. 1M、0. 2M或0. 5M，所述NaCl在所述提取 液中的濃度具體為0. 4M、0. 5M或0. 6M，所述EDTA在所述提取液中的濃度具體為0. 005M、 0.0說或0.01511;所述SDS在所述提取液中的濃度具體為10g/l、15g/l或20g/l ； 所述提取液的PH值為7.5;步驟幻、步驟幻和步驟6)中，所述氯仿異戊醇混合液均由氯仿和異戊醇組成，所述氯 仿和異戊醇的體積比均為M 1 ；步驟4)中，所述靜置時間為20min-40min，所述靜置時間具體為20min、30min或 40min ；所述靜置的溫度為_20°C -4°C，所述靜置的溫度具體為-20°C、0°C或4°C ； 步驟5)中，所述消化的溫度為35°C _38°C，所述消化的溫度具體為35°C、37°C或38°C， 所述消化的時間為0. 5h-l. 5h，所述消化時間具體為0. 5hUh或1.證；步驟6)中，所述離心的溫度均為0°C _41，所述離心的溫度均具體為01、11或 4°C，所述離心的離心力均為10000g-13000g，所述離心的離心力均具體為10000g、12000g 或13000g，所述離心的時間均為5min-15min，所述離心的時間均具體為5min、10min或 15min ；所述酚氯仿異戊醇混合液由酚、氯仿和異戊醇組成，所述酚、氯仿和異戊醇的體積比為 25 24 1 ；所述酚氯仿異戊醇混合液的PH值為8.0 ；步驟7)中，所述離心的溫度為0°C -4 0C，所述離心的溫度具體為0°C、1°C或4°C，所述 離心的離心力為10000g-13000g，所述離心的離心力具體為10000g、12000g或13000g，所述 離心的時間為5min-15min，所述離心的時間具體為5min、IOmin或15min。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特徵在於 步驟1)中，所述研磨為在液氮中研磨；步驟2)和步驟3)中，所述離心的溫度均為0°C -4°C，所述離心的溫度均具體為0°C、 1°C或4°C，所述離心的離心力均為10000g-13000g，所述離心的離心力均具體為10000g、 12000g或13000g，所述離心的時間均為5min-15min，所述離心的時間均具體為5min、IOmin 或 15min ；步驟7)中，所述靜置時間為20min-60min，所述靜置時間具體為20min、30min或 60min ；所述靜置溫度為_70°C _20°C，所述靜置溫度具體為-70°C、0°C、20°C。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特徵在於所述粘孢子蟲為單極蟲屬、吉陶單極蟲(Thelohanellus kitauei)。
6.一種分離粘孢子蟲孢子的方法，包括如下步驟a)用PBS緩衝液衝洗粘孢子蟲孢子囊，得到粘孢子蟲孢子溶液；b)將步驟a)得到的粘孢子蟲孢子溶液離心、收集沉澱；c)向步驟b)得到的沉澱中加入PBS緩衝液和SDS水溶液，混合，離心，收集沉澱；d)向步驟c)得到的沉澱中加入PBS緩衝液和SDS水溶液，混合，離心，收集沉澱，即為 粘孢子蟲孢子。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於步驟b)中，所述離心的離心力為5000g-8000g，所述離心的離心力具體為5000g、6000g 或8000g，所述離心的時間為5min-15min，所述離心的時間具體為5min、IOmin或15min，步驟c)和步驟d)中，所述PBS緩衝液與所述SDS水溶液的體積比為10 0.5。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其特徵在於步驟a)、c)和d)中，所述PBS緩衝液按照如下方法配製將NaCl、Na2HPO4, NaH2PO4和 水混合得到PBS緩衝液，NaCl在PBS緩衝液中的濃度為8g/l，Na2HPO4在PBS緩衝液的濃度 為2. 2g/l，Na2HPO4在PBS緩衝液的濃度為0. 4g/l，所述PBS緩衝液的PH值均為7. 0 ；步驟c)和d)中，所述混合的溫度均為M°d8°C，所述混合的溫度均具體為M°C、 25°〇或^°C，所述混合的時間均為5min-15min，所述混合的時間均具體為5min、10min或 15min，所述混合的方式均為顛倒混合；所述SDS水溶液的濃度均為200g/l。
9.根據權利要求6-8中任一所述的方法，其特徵在於步驟c)和d)中，所述離心的離心力均為6000g-10000g，所述離心的離心力均具體為 6000g、8000g或lOOOOg，所述離心的時間均為5min_15min，所述離心的時間均具體為5min、 IOmin 或 15min ；所述粘孢子蟲為單極蟲屬、吉陶單極蟲(Thelohanellus kitauei)。
10.權利要求1-9中任一所述的方法在粘孢子蟲分類鑑定中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種提取魚類粘孢子蟲基因組DNA方法。本發明提供的分離粘孢子蟲孢子的方法，包括如下步驟a)從感染粘孢子蟲宿主中分離粘孢子蟲孢子囊；b)用濃度為10g/l的PBS衝洗步驟a)得到的粘孢子蟲孢子囊，得到粘孢子蟲孢子溶液；c)將步驟b)得到的粘孢子蟲孢子溶液離心、收集沉澱；d)向步驟c)得到的沉澱中加入濃度為10g/l的PBS和10g/l SDS，混合，離心，收集沉澱。本發明的實驗證明，用本方法提取的基因組，基因組DNA的純度高，不含有宿主的基因，而且提取量多。而且本方法可以用於鑑定粘孢子蟲孢子。
文檔編號C12N15/30GK102115740SQ201010576458
公開日2011年7月6日 申請日期2010年12月1日 優先權日2010年12月1日
發明者何夙旭, 劉玉春, 周志剛, 姚斌, 張宇婷, 楊培龍, 白東青, 霍鳳敏 申請人:中國農業科學院飼料研究所