一種含血清的角膜上皮細胞培養液的製作方法
2023-06-26 21:10:06
本發明涉及生物醫學領域，尤其涉及一種含血清的角膜上皮細胞培養液。
背景技術：
角膜由外而內依次包括：上皮層、前彈力層(bowman膜)、基質層、後彈力層(decemet膜)和內皮層。角膜上皮層厚約50～60μm，佔整個角膜厚度的10%，角膜上皮細胞間以橋粒相互連接，構成緻密堅固的質膜，成為角膜的第一道屏障。角膜上皮層具有保護眼球，穩定淚膜，維持角膜透明性等功能，是一種不斷自我更新的組織。角膜上皮細胞的體外培養對研究角膜的生理學、病理學、免疫學以及分子生物學都是極為重要的手段，常用於細胞代謝產物、病毒感染、各種生長因子和藥物對細胞生長的影響的研究。角膜上皮細胞的培養成功也為多種眼部疾病如眼表淚液病、無虹膜、化學和熱燒傷、輻射損害、stevens-johnson症候群、眼瘢痕性天皰瘡等的移植治療開拓了廣闊前景。另外，近年來隨著體外器官培養技術的發展，利用體外培養的角膜上皮細胞來構建三維角膜模型，從而應用到體外化學品的眼刺激潛在危害性的評估，與其他的體外替代眼刺激評估方法相比，基於體外細胞培養構建的3d重組角膜上皮模型的眼刺激風險評價表現出特有的優勢，首先體外構建的3d角膜模型更類似於人體角膜上皮的細胞三維結構，不僅可以更為真實的反映人體對化學物的響應，準確給出化學物刺激性的預測，而且化合物篩選的種類也具有更寬的應用範疇，不僅適用於化妝品原料的危害評價，還可以用於不同劑型的化妝品成品的危害評估。目前，角膜上皮細胞是構建體外三維角膜上皮組織模型最理想的種子細胞，構建的三維角膜模型的生物學特性更能反映真實的角膜組織。然而由於分化後的角膜上皮細胞體外生長的生命周期很短，只能傳2～3代，獲得的細胞數量少，花費較高，限制了角膜組織的研究和組織工程化角膜的構建。因此如何改進體外培養技術，培養出分裂增殖能力強、能不斷分裂生長的角膜上皮細胞，以補充細胞的不斷更新，成為獲得角膜上皮種子細胞的首要任務。
現如今，角膜上皮細胞的體外培養方法有組織塊法和細胞懸液法。組織塊法是直接將取到的角膜緣剪成大小均勻的組織塊，上皮面朝下培養在載體膜表面，培養的角膜緣上皮細胞就會向外遷移擴增，最後形成一個組織薄片，它的優點在於培養出的細胞可以較好的保持其自身生物學特性，細胞生長旺盛；缺點在於培養過程中雜質細胞尤其是成纖維細胞的汙染率較高。細胞懸液法是將取自角膜緣的組織經過消化酶如胰酶、dispaseⅱ酶等消化成單個細胞，配成細胞懸液，然後以3t3作為滋養層的技術來進行的，但由於滋養細胞的存在幹擾檢測試驗結果的分析。而且，許多研究者相信3t3細胞和人細胞共同培養有可能引起突變或異種蛋白對人角質形成細胞（keratinocyte,kc）的轉染，強調在移植手術中儘量不用滋養層培養上皮細胞。為了避免使用滋養層，人們開發了多種方法：如培養皿表面塗細胞基質成份；不同濃度的鈣和各種生物提取物的添加；促分裂物和微量元素的添加。
角膜上皮細胞的培養基包括含血清培養基和無血清培養基，對於無血清培養基，研究發現，儘管在無血清體系中添加多種類型的細胞生長因子如egf、胰島素、牛垂體提取液、氫化潑尼松、轉鐵蛋白和霍亂毒素，但是遠遠不能滿足血清中複雜的營養成份以及其比例，特別是對於原代角膜上皮細胞，在無飼養層無血清的條件下很難培養成功，對於傳代細胞，無血清培養體系培養時生長緩慢，原有的幹細胞特性下降，容易出現老化現象，很難大量擴增。細胞在體外的生長和增殖的環境應接近體內的生理環境，培養條件越接近組織賴以生存的自然環境，培養出的細胞就越近似於正常組織細胞。因此來自動物血液的血清是體外培養各類細胞的主要營養物質，血清為機體細胞提供了基本的營養成分、各種激素、生長因子和所需的結合蛋白。因此血清是角膜上皮體外培養中使用最廣泛的天然培養基，大部分角膜上皮細胞的體外培養都要使用血清。1991年，kruse等的研究結果亦證實，角膜緣上皮細胞的增殖能力受血清的影響，具有血清濃度依賴性。血清的濃度對細胞的增殖也有較大的影響，一般在細胞培養液中添加5%～20%的血清。在角膜上皮細胞的原代培養中，在不添加其他營養物質和促細胞生長因子時，血清濃度過低時將很難促進細胞貼壁和增殖。然而又有研究發現，血清影響角膜上皮細胞的增殖分化，細胞傳代培養過程出，細胞增殖率顯著性地降低，主要原因是血清促進了細胞分化，從而抑制了細胞的增殖，例如2009年ma等比較了含胎牛血清與不含胎牛血清的低鈣培養基對小鼠角膜上皮細胞生長與分化的影響，發現胎牛血清可抑制小鼠角膜上皮細胞增生。
技術實現要素：
在本發明實施例提供了一種含血清的角膜上皮細胞培養液，主要針對無血清培養體系下，角膜上皮細胞生長緩慢、原有的幹細胞特性下降、容易出現老化現象、很難大量擴增和含10%血清的無滋養層培養方法培養角膜上皮細胞時出現細胞復層化等一系列問題，本發明實施例提供的含血清的角膜上皮細胞培養液通過添加血清、細胞生長所需的營養因子及細胞增殖分化的調節因子，既滿足了原代角膜上皮細胞高密度增殖角膜上皮細胞的需要，又避免了上皮細胞傳代培養中過度分化而導致的細胞增殖抑制現象，有效的平衡了體外角膜上皮細胞的增殖及分化速度，降低了細胞的倍增時間，從而滿足大規模的組織工程模型構建的需求。
為達到上述目的，本發明實施例採用如下技術方案：
本發明實施例提供一種含血清的角膜上皮細胞培養液，含血清的角膜上皮細胞培養液包括培養液1和培養液2。
本發明提供一種用於角膜上皮細胞培養的含血清培養基體系，培養液1為在基礎培養基的基礎上，添加濃度為10%-20%的胎牛血清，以及濃度為1-10μm的細胞增殖分化調節因子維甲酸和甘醇酸。
本發明提供一種用於角膜上皮細胞培養的含血清培養基體系，培養液1用於培養原代角膜上皮細胞。
本發明提供一種用於角膜上皮細胞培養的含血清培養基體系，培養液2為在基礎培養基的基礎上，添加濃度為1%-5%的胎牛血清，濃度為1-5μm細胞增殖分化調節因子維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632和cacl2；濃度為5-15μg/ml的胰島素和轉鐵蛋白；濃度為5-20ng/ml的表皮生長因子egf、胰島素生長因子igf-i、轉化生長因子tgfβ、牛垂體提取物（bpe）、貼壁因子纖連蛋白。
本發明提供一種用於角膜上皮細胞培養的含血清培養基體系，培養液2用於培養傳代角膜上皮細胞，從而保證角膜上皮細胞高密度地增殖，保持幹細胞特性，同時避免細胞過度分化。
本發明提供一種用於角膜上皮細胞培養的含血清培養基體系，基礎培養液均是k-sfm或mcdb153或體積比為1∶3的f12和dmem混合培養液。
優選的，培養液1中胎牛血清濃度為10%，培養液2中胎牛血清濃度為2.5%。
優選的，培養液1中細胞增殖分化的調節因子維甲酸和甘醇酸的濃度為5μm。
優選的，培養液2中細胞增殖分化的調節因子維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632和cacl2的濃度為5μm。優選的，培養液2中表皮生長因子egf、胰島素生長因子igf-i、轉化生長因子tgfβ、bpe和貼壁因子纖連蛋白的濃度為10ng/ml。
優選的，培養液2中胰島素和轉鐵蛋白的濃度為10μg/ml。
本發明進一步提供一種含血清的角膜上皮細胞培養基體系的配製方法，包括以下步驟：
培養液1的配製方法：
在k-sfm或mcdb153或體積比為1∶3混合的f12和dmem三種培養液中的任意一種中，添加濃度為1-10μm的細胞增殖分化調節因子維甲酸和甘醇酸，再再添加濃度為5%~20%的胎牛血清後形成的。
培養液2的配製方法：
在k-sfm或mcdb153或體積比為1∶3混合的f12和dmem三種培養液中的任意一種中，添加濃度為1-5μm的細胞增殖分化調節因子維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632和cacl2，濃度為5-15μg/ml的胰島素和轉鐵蛋白，以及濃度為5-20ng/ml的表皮生長因子egf、胰島素生長因子igf-i、轉化生長因子tgfβ、bpe和貼壁因子纖連蛋白，再添加濃度為0.5%~5%的胎牛血清後形成的。
本發明提供的的含血清培養基體系的主要特色在於：
（1）開發兩個系列的含血清角膜上皮細胞的培養液
基於原代角膜上皮細胞在無血清培養體系中很難培養成功和傳代細胞在高濃度血清體系下復層化等問題，開發含低濃度血清和高濃度血清兩個系列的含血清培養基體系，用於角膜上皮細胞的體外擴增培養，從而滿足角膜上皮細胞在體外的大規模培養的需求。
（2）不同濃度血清和細胞營養因子的協同營養作用
在兩個系列的含血清培養體系中，通過調整血清含量和細胞營養因子含量，從而實現血清和其他細胞營養因子協同作用，為細胞生長提供營養，促進角膜上皮細胞的生長及增殖。；
（3）補充多種細胞增殖分化的調節劑
本發明採用這兩種細胞增殖分化調節因子的共協同作用來實現細胞增殖分化的調節，從而使得細胞保持原有的特性，避免過度分化。
附圖說明
圖1為本發明實施例提供的不同培養體系培養原代角膜上皮細胞時，細胞數的變化情況比較；
圖2為本發明實施例提供的不同培養基體系下培養角膜上皮細胞時傳代細胞代次的比較結果。
具體實施方式
下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行詳細地描述。
需要說明的是，本發明實施例中使用的k-sfm、f12/dmem、mcdb153均購自gibco公司，胰島素、轉鐵蛋白、表皮生長因子egf、胰島素生長因子igf-i、轉化生長因子tgfβ、貼壁因子纖連蛋白、cacl2、甘醇酸、維甲酸以及rock抑制劑y27632均購自sigma公司，牛垂體提取物（bpe）為本公司自行提取的。
實施例1
本發明實施例提供一種含血清的角膜上皮細胞培養液，含血清的角膜上皮細胞培養液包括培養液1和培養液2；
其中，培養液1包括基礎培養基、濃度為10%-20%的胎牛血清，以及濃度為1-10μm的細胞增殖分化調節因子維甲酸和甘醇酸，培養液1用於培養原代角膜上皮細胞；
培養液2包括基礎培養基、濃度為1%-5%的胎牛血清，濃度為1-5μm的細胞增殖分化的調節因子維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632和cacl2，濃度為5-15μg/ml的胰島素和轉鐵蛋白，以及濃度為5-20ng/ml的表皮生長因子egf、胰島素生長因子igf-i、轉化生長因子tgfβ、牛垂體提取物bpe和貼壁因子纖連蛋白，培養液2用於培養經過培養液1培養後的傳代角膜上皮細胞。
需要說明的是，基礎培養液為k-sfm培養液或者mcdb153培養液或者f12/dmem培養液，其中，f12/dmem培養液是f12培養液和dmem培養液以體積比1:3的比例混合的。
示例性的，在第一種可能的實現方式中，本發明實施例提供的含血清的角膜上皮細胞培養液可以包括：
培養液1的配製：
以體積比為1:3的f12/dmem混合液作為基礎培養基，配製1l含高濃度血清、細胞增殖分化調節因子的培養體系，具體配製過程如下：
（1）在超淨工作檯中用無菌去離子水配製10mm的甘醇酸和維甲酸的母液；
（2）將購自gibco的f12/dmem（1:3）粉末培養基倒入裝有800ml去離子水的2l燒杯中，然後將燒杯置於攪拌機上，攪拌2h待溶解後，用0.22μm的過濾器過濾除菌，得基礎培養液；
（3）在超淨工作檯中向上述步驟2所得基礎培養液中添加步驟1甘醇酸和維甲酸的母液，使得甘醇酸和維甲酸的濃度為1μm；
（4）最後，在超淨工作檯中添加濃度為10%的胎牛血清，密封好後放置於4℃冰箱中備用。
培養液2的配製：
以mcdb153作為基礎培養基配製1l含低濃度血清、多種細胞營養因子和細胞增殖分化調節因子的培養體系，具體配製過程如下：
（1）在超淨工作檯中用無菌去離子水配製各種細胞營養因子和細胞增殖分化調節因子的母液，其中胰島素和轉鐵蛋白的母液濃度均為10mg/ml，表皮生長因子egf、胰島素生長因子igf-i、轉化生長因子tgfβ、bpe和貼壁因子纖連蛋白的母液濃度均為10mg/ml，細胞增殖分化調節因子維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632和cacl2的母液濃度為10mm；
（2）將購自gibco的mcdb153粉末培養基倒入裝有800ml去離子水的2l燒杯中，然後將燒杯置於攪拌機上，攪拌2h待溶解後，用0.22μm的過濾器過濾除菌，得基礎培養液；
（3）在超淨工作檯中向上述步驟2所得基礎培養液中添加步驟1所得細胞營養因子和增殖分化調節因子母液，使得維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632的濃度為2.5μm；cacl2的濃度為1μm；胰島素和轉鐵蛋白濃度為15μg/ml；表皮生長因子egf、胰島素生長因子igf-i、轉化生長因子tgfβ、bpe和貼壁因子纖連蛋白的濃度為20ng/ml，攪拌均勻；
（4）最後，在超淨工作檯中添加濃度為1%的胎牛血清，密封好後放置於4℃冰箱中備用。
示例性的，在第二種可能的實現方式中，本發明實施例提供的含血清的角膜上皮細胞培養液可以包括：
培養液1的配製：
以k-sfm作為基礎培養基，配製1l含高濃度血清、細胞增殖分化調節因子的培養體系，具體配製過程如下：
（1）先在超淨工作檯中用無菌去離子水配製10mm的維甲酸和甘醇酸的母液；
（2）將購自gibco的k-sfm粉末培養基倒入裝有800ml去離子水的2l燒杯中，然後將燒杯置於攪拌機上，攪拌2h待溶解後，用0.22μm的過濾器過濾除菌，得基礎培養液；
（3）在超淨工作檯中向在上述步驟2所得基礎培養液中添加步驟1維甲酸和甘醇酸的母液，使得維甲酸和甘醇酸的濃度為10μm；
（4）最後，在超淨工作檯添加濃度為20%的胎牛血清，密封好後放置於4℃冰箱中備用。
培養液2的配製：
以mcdb153作為基礎培養基配製1l含低濃度血清、多種細胞營養因子和細胞增殖分化調節因子的培養體系，具體配製過程如下：
（1）在超淨工作檯中用無菌去離子水配製各種細胞營養因子和細胞增殖分化調節因子的母液，其中胰島素和轉鐵蛋白的母液濃度均為10mg/ml，表皮生長因子egf、胰島素生長因子igf-i、轉化生長因子tgfβ、bpe和貼壁因子纖連蛋白的母液濃度均為10mg/ml，細胞增殖分化調節因子維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632和cacl2的母液濃度為10mm；
（2）將購自gibco的mcdb153粉末培養基倒入裝有800ml去離子水的2l燒杯中，然後將燒杯置於攪拌機上，攪拌2h待溶解後，用0.22μm的過濾器過濾除菌，得基礎培養液；
（3）在超淨工作檯中向在上述步驟2所得基礎培養液中添加步驟1所得細胞營養因子和增殖分化調節因子母液，使得維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632的濃度為1μm；cacl2的濃度為2.5μm；胰島素和轉鐵蛋白濃度為5μg/ml；表皮生長因子egf、胰島素生長因子igf-i、轉化生長因子tgfβ、bpe和貼壁因子纖連蛋白的濃度為5ng/ml，攪拌混勻；
（4）最後，在超淨工作檯中添加濃度為5%的胎牛血清，密封好後放置於4℃冰箱中備用。
示例性的，在第三種可能的實現方式中，本發明實施例提供的含血清的角膜上皮細胞培養液可以包括：
培養液1的配製：
以mcdb153作為基礎培養基，配製1l含高濃度血清、細胞增殖分化調節因子的培養體系，具體配製過程如下：
（1）先在超淨工作檯中用無菌去離子水配製10mm的甘醇酸和維甲酸的母液；
（2）在超淨工作檯中向將購自gibco的mcdb153粉末培養基倒入裝有800ml去離子水的2l燒杯中，然後將燒杯置於攪拌機上，攪拌2h待所有成份溶解後，用0.22μm的過濾器過濾除菌，得基礎培養液；
（3）在超淨工作檯中向上述步驟2所得基礎培養液中添加步驟1維甲酸和甘醇酸的母液，使得維甲酸、甘醇酸濃度為5μm；
（4）最後，在超淨工作檯中添加濃度為15%的胎牛血清，密封好後放置於4℃冰箱中備用。
培養液2的配製：
以f12/dmem（1:3）作為基礎培養基配製1l含低濃度血清、多種細胞營養因子和細胞增殖分化調節因子的培養體系，具體配製過程如下：
（1）在超淨工作檯中用無菌去離子水配製各種細胞營養因子和細胞增殖分化調節因子的母液，其中胰島素和轉鐵蛋白的母液濃度均為10mg/ml，表皮生長因子egf、胰島素生長因子igf-i、轉化生長因子tgfβ和貼壁因子纖連蛋白的母液濃度均為10mg/ml，細胞增殖分化調節因子維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632和cacl2的母液濃度為10mm；
（2）將購自gibco的f12/dmem（1:3）粉末培養基倒入裝有800ml去離子水的2l燒杯中，然後將燒杯置於攪拌機上，攪拌2h待溶解後，用0.22μm的過濾器過濾除菌，得基礎培養液；
（3）在超淨工作檯中向上述步驟2所得基礎培養液中添加步驟1所得細胞營養因子和增殖分化調節因子母液，使得維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632的濃度為5μm；cacl2的濃度為5μm；胰島素和轉鐵蛋白的濃度為10μg/ml；表皮生長因子egf、胰島素生長因子igf-i、轉化生長因子tgfβ、bpe和貼壁因子纖連蛋白的濃度為10ng/ml，攪拌混勻；
（4）最後，在超淨工作檯中添加濃度為2.5%的胎牛血清，密封好後放置於4℃冰箱中備用。
需要補充的是，採用上述實施例任一實現方式中培養液，其中培養液1用於培養原代角膜上皮細胞，培養液2用於經過培養液1培養後的傳代角膜上皮細胞的培養。即將第二代的角膜上皮細胞從培養液1轉入培養液2中進行培養。
實施例2
採用無血清培養基、含10%血清培養基和本發明的培養液培養原代角膜上皮細胞的比較研究：
實驗操作方法：
在超淨工作檯上將獲得的兔眼球用pbs衝洗2～3次，沿角膜緣取下完整角膜，用dmem/f12培養液衝洗1～2次；在50mm培養皿中加1ml的4mg/mldispaseⅱ，將上述處理過的兔眼角膜上皮面朝下置於消化液中，培養箱中消化15min後翻轉角膜片，然後分離上皮層。pbs輕輕衝洗上皮層後，置於0.25%胰蛋白酶中，37℃消化約20min，終止消化，吹打成單細胞懸液，離心棄掉上清後，分別用加了多種營養因子的無血清培養基、只含10%血清的培養基和本發明提供的培養液1重懸細胞，然後按照3e4個/孔的細胞密度接種與6孔板中，置於37℃，5%co2培養箱培養，每2d更換1次培養液。培養至第6天時觀察細胞狀態，培養過程中每隔2天消化細胞形成細胞懸液，進行細胞計數分析。
實驗結果顯示，無血清體系下培養的原代角膜上皮細胞增殖速度很慢，而本發明的培養液1與含10%血清的培養基培養的原代角膜上皮細胞增殖速度很快，從第2天開始時，細胞呈現指數形式增殖（如圖1所示）。
實施例3
採用含10%血清的培養基與本發明提供的培養液培養角膜上皮細胞的比較研究：
實驗操作方法：
在超淨工作檯上將獲得的兔眼球用pbs衝洗2～3次，沿角膜緣取下完整角膜，用dmem/f12培養液衝洗1～2次；在50mm培養皿中加1ml的4mg/mldispaseⅱ，將上述處理過的兔眼角膜上皮面朝下置於消化液中，培養箱中消化15min後翻轉角膜片，然後分離上皮層。pbs輕輕衝洗上皮層後，置於0.25%胰蛋白酶中，37℃消化約20min，終止消化，吹打成單細胞懸液，離心棄掉上清後，分別接種於含10%血清培養基體系和本發明提供的培養液中，置於37℃，5%co2培養箱培養，每2d更換1次培養液，培養至細胞融合度達到80%-90%時，用胰蛋白酶消化進行傳代培養，其中，原代培養時採用本發明提供的的培養液1，從第二代開始，採用本發明提供的培養液2進行傳代培養，而另一組的原代和傳代培養角膜上皮細胞的過程中均使用含10%血清的培養基培養。記錄細胞最多的傳代代數，並分析細胞狀態。
結果顯示，採用含10%血清的培養基體系培養原代細胞時，與本發明提供的培養液培養時的細胞增殖速度相似，細胞狀態均良好；但在傳代培養過程中，當傳代培養至第5代時，含10%血清培養基體系的細胞增殖速度逐漸降低，細胞形態逐漸出現分支狀，開始分化，而由於本發明提供的角膜上皮細胞已經轉入了培養液2中進行培養，因此角膜上皮細胞傳代至14代時細胞才開始出現分支狀，增殖速度下降（如圖2所示）。
本發明實施例提供一種含血清的角膜上皮細胞培養液，含血清的角膜上皮細胞培養液包括培養液1和培養液2；其中，培養液1包括基礎培養基、濃度為10%-20%的胎牛血清，以及濃度為1-10μm的細胞增殖分化調節因子維甲酸和甘醇酸，培養液1用於培養原代角膜上皮細胞；培養液2包括基礎培養基、濃度為1%-5%的胎牛血清，濃度為1-5μm的細胞增殖分化的調節因子維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632和cacl2，濃度為5-15μg/ml的胰島素和轉鐵蛋白，以及濃度為5-20ng/ml的表皮生長因子egf、胰島素生長因子igf-i、轉化生長因子tgfβ、牛垂體提取物bpe和貼壁因子纖連蛋白，培養液2用於培養經過培養液1培養後的傳代角膜上皮細胞。含血清的角膜上皮細胞培養液主要針對無血清培養體系下，角膜上皮細胞生長緩慢、原有的幹細胞特性下降、容易出現老化現象、很難大量擴增和含10%血清的無滋養層培養方法培養角膜上皮細胞時出現細胞復層化等一系列問題，能夠通過添加血清、細胞生長因子及細胞增殖分化的調節因子，既滿足了原代角膜上皮細胞高密度增殖的需要，又避免了上皮細胞傳代培養中過度分化而導致的細胞增殖抑制現象，有效的平衡了體外角膜上皮細胞的增殖及分化速度，降低了細胞的倍增時間，從而滿足大規模的組織工程模型構建的需求。
以上所述，僅為本申請的具體實施方式，但本申請的保護範圍並不局限於此，任何在本申請揭露的技術範圍內的變化或替換，都應涵蓋在本申請的保護範圍之內。因此，本申請的保護範圍應以所述權利要求的保護範圍為準。