一種亞單位疫苗免疫佐劑及應用的製作方法

2023-06-27 02:13:46 2

專利名稱：一種亞單位疫苗免疫佐劑及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物技術製藥工業中的基因工程生產免疫佐劑技術，特別是一種亞單位疫苗免疫佐劑及應用。
背景技術：
抗菌肽是生物在長期進化過程中為適應環境、求得生存而最早產生的免疫活性分子，具有選擇性效應和分子質量小、無抗原性等特點，被認為是天然免疫的重要介質，在宿主對抗病原入侵的免疫防禦中起著極其重要的作用，因此被形象地稱為「天然抗菌劑」或 「陽離子宿主防禦肽」，是病原體入侵的重要分子屏障。Tani研究發現，體外培養的小鼠脾細胞經人抗菌肽刺激後能增殖並增加細胞因子產物，而體內處理則引起IgG抗體免疫應答能力增強。若先天性免疫不足以消除感染，抗菌肽則通過信號傳遞途徑，起動並擴大宿主的特異性免疫反應，充當先天免疫和特異性免疫之間信號傳導的橋梁。抗菌肽可以作為免疫增強劑刺激機體的免疫。疫苗是防控禽霍亂(病原為多殺性巴氏桿菌)的最為有效的措施，我國目前用於禽霍亂的疫苗是弱毒菌苗和滅活菌苗，存在保持能力不佳，並可能潛在毒力反強等缺點，這使得基因工程亞單位疫苗逐漸成為禽霍亂疫苗研究的熱點。研製安全、高效並具有自主智慧財產權的禽霍亂基因工程亞單位疫苗的要求越來越迫切。但是基因工程疫苗在誘導機體免疫反應方面還存在一些不盡如人意之處，因此，研究人員試圖從多方面增強禽霍亂亞單位疫苗的免疫效果。免疫佐劑由於可以非特異性地通過物理的或者化學的方式與特意性免疫反應物質結合，從而誘導機體產生長期、高效的特異性免疫反應，提高機體的免疫保護力，同時能夠減少抗原的用量，節約疫苗免疫成本，因而被廣泛應用於生產和研究。很多研究表明，多肽可以被用於增強和提高抗原的免疫原性，或者減少抗原用量，這提示多肽可以作為一種強有力的佐劑應用於疫苗。囊素三肽(BS)作為法氏囊中第一個化學結構明確的生物活性分子，不僅對禽類具有免疫調節作用，而對哺乳動物及人類淋巴細胞也具有明顯的免疫學及生理學功能。天然囊素和人工合成囊素在體外均可誘導禽和哺乳動物的前體B淋巴細胞表型分化。抗菌肽 Protegrin-I是Cathlin家族中重要的一員，研究表明它是一種蛋白質多肽，具有廣譜抗菌性，在動物機體免疫上發揮著重要的作用。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種亞單位疫苗免疫佐劑及應用，該 亞單位疫苗免疫佐劑屬於抗菌肽囊素三肽融合肽，為新型基因工程免疫佐劑，可有效提高禽多殺性巴氏桿菌亞單位疫苗免疫效果，並提供酵母表達載體，並利於大規模、高效、快速生產，為防控雞的巴氏桿菌病的大規模流行提供高效亞單位疫苗佐劑。為了實現解決上述技術問題的目的，本發明採用了如下技術方案
本發明的一種亞單位疫苗免疫佐劑，該佐劑為抗菌肽囊素三肽融合肽，其胺基酸序列為SEQ. ID. NO. 1，核苷酸序列為SEQ ID NO. 2。亞單位疫苗免疫佐劑的真核表達載體可以選擇畢赤酵母表達系統的PPICZ α A。本發明的一種亞單位疫苗免疫佐劑，所述的胺基酸序列SEQ. ID. NO. 1是根據已在GeneBank中登錄的豬抗菌肽Protegrin-Ι胺基酸序列和囊素三肽序列進行的設計，即採用胺基酸序列「GGGGS」將豬抗菌肽Protegrin-I與3拷貝囊素三肽進行串聯，即得到 「PG-1-GGGGS-3BS」，即為胺基酸序列SEQ. ID. NO. 1。這樣設計是為了為不影響豬抗菌肽 Protegrin-I胺基酸序列和囊素三肽各自二級結構，及抗菌肽的天然活性。上述的3BS為3 拷貝囊素三肽，PG-I為豬抗菌肽Protegrin-I。本發明的一種亞單位疫苗免疫佐劑，所述的核苷酸序列SEQ. ID. NO. 2具體是以 PG-I- GGGGS -3BS的胺基酸序列為模板，參照畢赤酵母偏嗜密碼設計的PG-I- GGGGS -3BS 融合肽核苷酸序列。具體可以依據Invitrogen公司的真核表達載體pPICZ-α-A上的多克隆酶切位點，在基因前端加入xho 酶切位點，後端加入Xba I酶切位點，並在Xba I酶切位點前加入終止密碼子，來進行基因表達載體的構建。 本發明的一種亞單位疫苗免疫佐劑，其基因是根據PG-I- GGGGS -3BS的核苷酸序列設計三條引物，用重疊拼接延伸PCR (SOE-PCR)的方法擴增獲得。三條引物核苷酸序列為F1 SEQ. ID. NO. 3、F2 SEQ. ID. NO. 4、F3 SEQ. ID. NO. 5。本發明的一種亞單位疫苗免疫佐劑，酵母表達載體的構建是將PG-I- GGGGS -3BS 的基因片段和質粒PPICZ-α-A進行xho I , Xba I雙酶切，然後將基因片段插入酵母表達載體pPICZ- α -Α。酵母表達載體pPICZ- α -A和酵母菌株X_33可購自Invitrogen公司。本發明的一種亞單位疫苗免疫佐劑，酵母表達菌株和融合蛋白獲得方法是按照畢赤酵母表達系統使用說明書，將構建好的融合蛋白表達載體線性化後，電轉化酵母菌X-33， 通過酵母誘導表達，獲得融合蛋白。本發明的一種亞單位疫苗免疫佐劑，所述的胺基酸序列SEQ. ID. NO. 1具體序列為RGGRLCYCRRRFCVCVGRGGGGSKHGKHGKHG。本發明的一種亞單位疫苗免疫佐劑，所述的核苷酸序列SEQ ID N0. 2具體序列為 AGAGGTGGTAGATTGTGTTATTGTAGAAGAAGATTcTGTGTTTGTGTTGGTAGAGGTGGTGGTGGTTCTAAGCATGG TAAGCATGGTAAGCATGGT。本發明的一種亞單位疫苗免疫佐劑，所述的引物序列Fl SEQ. ID. NO. 3具體序列表為AGAGGTGGTAGATTGTGTTATTGTAGAAGAAGATTCTGTG。本發明的一種亞單位疫苗免疫佐劑，所述的引物序列F2 SEQ. ID. NO. 4具體序列表為AACCACCACCACCTCTACCAACACAAACACAGAATCTTC。本發明的一種亞單位疫苗免疫佐劑，所述的引物序列F3 SEQ. ID. NO. 5具體序列表為:GTGGTGGTTCTAAGCATGGTAAGCATGGTAAGCATGGT。本專利獲得的基因工程產品即為亞單位疫苗免疫佐劑，是用基因工程菌株製備的可溶性表達產物。本發明的一種亞單位疫苗免疫佐劑製備方法為基因工程表達。
本專利的亞單位疫苗免疫佐劑在製備禽類、豬亞單位疫苗中的應用，可製備的疫苗為禽或豬多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌外膜蛋白抗原亞單位疫苗。具體應用方法是將PG-I- GGGGS -3BS免疫佐劑與亞單位疫苗等量混合，進行肌肉或腹膜內注射免疫，三周後按照同樣方法第二次免疫。通過採用上述技術方案，本發明具有以下的有益效果
本發明應用PG-I- GGGGS -3BS融合肽作為分子佐劑，可以有效增強雞多殺性巴氏桿菌外膜蛋白H的免疫原性，將PG-I- GGGGS -3BS融合肽配合雞多殺性巴氏桿菌外膜蛋白H免疫BALB/c小鼠後，其體液免疫和細胞免疫都比單獨的禽或豬多殺性巴氏桿菌外膜蛋白H免疫效果好，並且未發現不良反應；目前研究亞單位疫苗佐劑一般採用原核表達載體，原核表達產物有可能形成包涵體，需變性，復性及純化，並且有內毒素和LPS等不容易去除。本發明在獲得PG-I- GGGGS -3BS融合肽時選擇真核酵母表達載體，其優點在於融合蛋白易於表達，純化，而且進行糖基化等修飾，易於實現大規模生產；酵母表達的融合蛋白具有真核細胞的修飾基因，與哺乳動物體內表達的PG-I結構相似，具有很好的生物學活性。


圖1是本發明的一種亞單位疫苗免疫佐劑SOE-PCR產物的電泳圖，其中右側為 DL2000核酸分子量標準，分子量從上到下依次為2000，1000，750，500，250，IOObp ；左側為 PG-I- GGGGS -3BS PCR 產物，約 140bp。圖2是本發明的亞單位疫苗免疫佐劑酵母表達產物的SDS-PAGE電泳圖，其中左側為低分子量蛋白質標準，分子量從上到下依次為99. 4，62. 0，43. 0，31. 2，20. 1，14. 4kD ；右側為PG-I- GGGGS -3BS表達產物，分子量大約3. 44 kD。圖3是本發明的亞單位疫苗免疫佐劑用於免疫的抗體水平檢測結果比較圖。圖4是本發明的亞單位疫苗免疫佐劑用於免疫的抗體亞型水平檢測結果比較圖。圖5是本發明的亞單位疫苗免疫佐劑用於免疫的細胞因子水平檢測結果比較圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步說明。1、PG-I- GGGGS -3BS融合肽核苷酸全序列的獲得
採用重疊延伸PCR (SOE)方法擴增PG-I- GGGGS -3BS融合肽全基因序列，用三條引物來擴增。三條引物為 Fl SEQ. ID. NO. 3，F2 SEQ. ID. NO. 4，F3 SEQ. ID. NO. 5。PCR 反應體系 50μ1 :10XPCR Buffer5PL，dNTP (2. 5mM) 2μ ，引物 Fl、F2、F3 各 μ , rTeq DNA聚合酶0. 5μ ，用去離子水補至50μ 。PCR 反應程序95°C預變性 5min，擴增條件為94°C 30 s，57°C 30s, 72 V 30s, 35循環，72 °C延伸lOmin。用大連Takara公司生產的核酸膠回收試劑盒回收140bp大小的核苷酸片段。其SOE-PCR產物的電泳圖，圖右側為DL2000核酸分子量標準，分子量從上到下依次為:2000，1000，750，500，250，IOObp ；左側為 PG-I- GGGGS -3BS PCR 產物，約 140bp。2、酵母表達載體pPICZ- α -A-PB的構建及表達根據酵母表達載體系統手冊完成， 將獲得的表達載體pPICZ- α -A-PB線性化後，電轉化酵母菌Χ-33，通過酵母誘導表達，獲得融合肽PG-I- GGGGS -3BS。其酵母表達產物的SDS-PAGE電泳圖，圖左側為低分子量蛋白質標準，分子量從上到下依次為=99.4,62. 0,43.0,31.2,20. 1,14. 4kD ；右側為PG-I- GGGGS -3BS表達產物，分子量大約3. 44 kD。3、動物免疫
用該PG-I- GGGGS -3BS融合肽與 雞多殺性巴氏桿菌外膜蛋白H聯合應用，免疫Babl/c 小鼠。將4周齡健康雌性BALB/c小鼠隨機分成3組，每組20隻。分別用PBS液(0. Iml),雞多殺性巴氏桿菌外膜蛋白H (50 μ g)，雞多殺性巴氏桿菌外膜蛋白H (50μ g)+PG-l- GGGGS -3BS融合肽(50μ g)進行腹膜內注射免疫，三周後按照同樣方法進行第二次免疫。分別於第二次免疫後的第7，14，21，28，35，42天隨機眼眶採血，分離血清，檢測血清總IgG抗體水平，並且於第二次免疫後的第7天，隨機眼眶採血，分離血清，檢測血清中抗體亞型、細胞因子(IL-4和IFN- γ );分離脾臟細胞檢測脾淋巴細胞增殖，做攻毒保護試驗來衡量融合肽對外膜蛋白H的免疫增強作用。攻毒保護試驗使用的菌株禽多殺性巴氏桿菌(CVCC474)購自中國微生物保藏中心，其LD5tl為474CFU，攻毒劑量用5 LD5004、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)結果
抗體及抗體亞型分析結果表明，外膜蛋白H+PG-1- GGGGS -3BS融合肽免疫組的抗體最早達到最高水平，並且水平顯著高於亞單位疫苗免疫組，具體結果見圖3 ;IgG抗體亞型檢測結果表明外膜蛋白H主要誘導產生IgGl產生，而外膜蛋白H+PG-1- GGGGS -3BS融合肽免疫組不僅能誘導產生高水平的IgGl，而且誘導IgG2a的能力強於外膜蛋白H單獨免疫組， 具體結果見圖4。5、血清中IL-4和IFN- γ的測定
應用定量ELISA對血清中的IL-4和IFN-Y進行定量分析，發現亞單位疫苗免疫組主要產生IL-4，PG-1- GGGGS -3BS融合肽免疫組的IL-4和IFN-γ分泌明顯高於亞單位疫苗免疫組，具體結果見圖5。6、四甲基偶氮唑藍法(MTT)
PBS對照組0D570平均值為0. 15 士 0. 021，外膜蛋白H免疫組0D570平均值為 0. 43 士0. 018，外膜蛋白 H+PG-1- GGGGS -3BS 融合肽免疫組 0D570 平均值為 0. 52 士0. 015。 這三組數據進行統計學分析，外膜蛋白H+PG-1- GGGGS -3BS融合肽免疫組與其它兩組差異顯著(ρ<0.05)。外膜蛋白H+PG-1- GGGGS -3BS融合肽免疫組淋巴細胞增殖強於單獨外膜蛋白H免疫組。7、攻毒試驗
攻毒實驗結果顯示PBS對照組死亡率為90%，外膜蛋白H免疫組死亡率為50%，外膜蛋白H+PG-1- GGGGS -3BS融合肽免疫組死亡率為5%。試驗結果說明PG-I- GGGGS -3BS融合肽對外膜蛋白H亞單位疫苗有一定的免疫增強作用。
權利要求
1.一種亞單位疫苗免疫佐劑，其特徵是該佐劑為抗菌肽與囊素三肽的融合肽，其胺基酸序列為SEQ. ID. NO. 1，核苷酸序列為=SEQ ID NO. 2。
2.根據權利要求1所述亞單位疫苗免疫佐劑，其特徵是所述的胺基酸序列SEQ. ID. NO. 1是根據已在GeneBank中登錄的豬抗菌肽Protegrin-I胺基酸序列和囊素三肽序列進行的設計，即採用胺基酸序列「GGGGS」將豬抗菌肽Protegrin-I與3拷貝囊素三肽進行串聯，即為「PG-1-GGGGS-3BS」，即為胺基酸序列SEQ. ID. NO. 1。
3.根據權利要求1所述亞單位疫苗免疫佐劑，其特徵是所述的核苷酸序列SEQ. ID. NO. 2是以PG-I- GGGGS _3S的胺基酸序列為模板，參照畢赤酵母偏嗜密碼設計的PG-I-GGGGS -3BS融合肽核苷酸序列。
4.根據權利要求1所述亞單位疫苗免疫佐劑，其特徵是免疫佐劑基因是根據PG-I-GGGGS -3BS的核苷酸序列設計三條引物，用重疊拼接延伸PCR(SOE-PCR)的方法擴增獲得， 三條引物核苷酸序列為F1 SEQ. ID. NO. 3，F2 SEQ. ID. NO. 4，F3 SEQ. ID. NO. 5。
5.根據權利要求4所述亞單位疫苗免疫佐劑，其特徵是所述的引物序列FlSEQ. ID. NO. 3 具體序列為AGAGGTGGTAGATTGTGTTATTGTAGAAGAAGATTCTGTG，引物序列 F2 SEQ. ID. NO. 4 具體序列為AACCACCACCACCTCTACCAACACAAACACAGAATCTTC，引物序列 F3 SEQ. ID. NO. 5 具體序列為GTGGTGGTTCTAAGCATGGTAAGCATGGTAAGCATGGT。
6.根據權利要求1所述亞單位疫苗免疫佐劑，其特徵是所述的胺基酸序列SEQ. ID. NOl.為RGGRLCYCRRRFCVCVGRGGGGSKHGKHGKHG，核苷酸序列 SEQ ID NO. 2 為AGAGGTG GTAGATTGTGTTATTGTAGAAGAAGATTCTGTGTTTGTGTTGGTAGAGGTGGTGGTGGTTCTAAGCATGGTAAGCAT GGTAAGCATGGT。
7.—種權利要求1所述亞單位疫苗免疫佐劑在製備禽類、豬亞單位疫苗中的應用，其特徵在於所述疫苗為禽或豬多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌外膜蛋白抗原亞單位疫苗
8.根據權利要求7所述應用，其特徵在於應用方法是將PG-I-GGGGS -3BS免疫佐劑與亞單位疫苗等量混合，進行肌肉或腹膜內注射免疫，三周後按照同樣方法第二次免疫。
全文摘要
本發明介紹了一種亞單位疫苗免疫佐劑及應用，該佐劑為抗菌肽囊素三肽融合肽，其胺基酸序列為SEQ.ID.NO.1，核苷酸序列為SEQIDNO.2。本發明應用PG-1-GGGGS-3BS融合肽作為分子佐劑，可以有效增強雞多殺性巴氏桿菌外膜蛋白H的免疫原性；使用PG-1-GGGGS-3BS融合肽作為分子佐劑時選擇真核酵母表達載體，融合蛋白易於表達，純化，且可以進行糖基化等修飾，易於實現大規模生產；酵母表達的融合蛋白具有真核細胞的修飾基因，與哺乳動物體內表達PG-1的結構相似，具有很好的生物學活性。
文檔編號A61K39/112GK102178950SQ201110116099
公開日2011年9月14日 申請日期2011年5月6日 優先權日2011年5月6日
發明者侯玉澤, 吉萍, 宮強, 張敏, 李翔, 牛明福, 王文輝, 秦翠麗 申請人:河南科技大學