一種基於流式細胞術的高通量篩選高產泰樂菌素菌株的方法與流程

2023-06-27 02:41:46 2

本發明涉及一種基於流式細胞術的高通量篩選高產泰樂菌素菌株的方法，屬於高通量篩選技術領域。

背景技術：

泰樂菌素(Tylosin)又稱泰樂星、泰勒黴素，是一種16元大環內酯類抗生素，它是一種禽、畜專用的高效無殘留的抗菌促生劑，廣泛應用於飼料、獸藥添加劑。泰勒菌素工業生產菌為弗氏鏈黴菌(Streptomyces fradiae)。泰樂菌素主要是由泰樂菌素A、脫碳黴糖泰樂菌素B、大菌素C和雷洛菌素D四種組分組成，其中A組分具有最強的生物活性。泰勒菌素生物合成過程十分複雜，具體明確的生物合成途徑尚未闡明。通過分子生物學和基因工程技術，改造泰樂菌素的生物合成基因簇仍在不斷探索之中。基於抗生素遺傳背景的分子育種手段過程複雜，費用大，成功率低。對於泰樂菌素的工業化生產，出發菌株必須滿足一定的優良特性。經典誘變使用理化方法誘導DNA突變，方法簡單，適用範圍廣。高通量篩選技術結合經典誘變簡化篩選過程，提高了篩選效率。

目前的經典誘變結合高通量篩選方法，由於經典誘變會存在大量死細胞而可能導致後續可培養無法實現，同時經典誘變後的菌株要進一步分離純化、擴大培養之後才能進行後續酶標板等高通量篩選而存在篩選周期長、前期工作量大等問題。

技術實現要素：

為了解決上述問題，本發明聯合經典誘變、流式細胞術、高通量孔板篩選、固液聯合培養，提供了一種基於流式細胞術的高通量篩選泰樂菌素高產菌株的方法。本發明基於流式細胞術對泰樂菌素高通量篩選，可在短時間內對大量有效菌株進行分析，從而分選目的活孢子，進而進行高通量培養檢測。

本發明的基於流式細胞術的高通量篩選泰樂菌素高產菌株的方法，主要包括步驟如下：

(1)獲得弗氏鏈黴菌的多個含量死孢子在內的待篩選的孢子；

(2)利用PI染料對步驟(1)的待篩選的孢子進行染色；

(3)使用流式細胞儀檢測孢子活性；

(4)利用流式細胞儀分選有活性孢子，直接將單個有活性的孢子分選到裝有固體培養基的高通量孔板中；

(5)待高通量孔板的固體培養基上培養4～5天，直接添加液體種子培養基繼續培養得到種子液；將培養好的種子液轉接入含有發酵培養基的新的高通量孔板中，發酵培養；

(6)配置一定濃度梯度的泰樂菌素標準品，用酶標儀檢測，得到泰樂菌素與290nm下的吸光值OD的關係；發酵培養結束後，取發酵液上清，在合適的濃度下用酶標儀測定290nm下的吸光值OD，進而得知待篩選菌株產泰樂菌素含量的相對高低；

(7)選取上一步得到的泰樂菌素含量相對較高的菌株多株，進行復篩。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(1)的待篩選孢子可以是不同活性的孢子，包括死孢子。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(1)的待篩選孢子是將弗氏鏈黴菌進行誘變後得到的。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(1)的待篩選的孢子中，死孢子含量達90％以上，優選地達95％以上更優選地達99％以上。

在本發明的一種實施方式中，所述誘變，可以是物理誘變或者化學誘變，比如常壓室溫等離子體(ARTP)誘變、紫外誘變、甲基磺酸乙酯(EMS)誘變、亞硝基胍(NTG)誘變、硫酸二乙酯(DES)誘變等等。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(2)的染色，具體是：將待篩選的孢子調整至濃度105～106個孢子/mL的懸浮液，將等體積懸浮液與10μg/mL PI染色劑混合，避光放置4℃冰箱孵育20min。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(3)和步驟(4)具體是：以沒有標記任何螢光素的樣品為陰性對照、將完全無活性的與PI染色劑結合的樣品設置為陽性對照，確定陰性與陽性孢子群體；取染色後的弗氏鏈黴菌孢子懸浮液，重新過濾，稀釋一定倍數，上流式細胞儀分析，用FL3通道((610±15)nm)檢測，以FCS-Width為橫坐標，SSC-Log-Height為縱坐標，SSC閾值為0.02，螢光通道電壓為500，將無螢光區域最集中部分設門分選至裝有固體培養基的高通量孔板中，每孔分選設定為單個孢子。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(4)中，裝有固體培養基的高通量孔板中固體培養基的體積為50μL/孔。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(5)中，是培養至長出可見孢子後添加液體種子培養基。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(5)中液體種子培養基的添加量為150μL/孔。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(5)中發酵培養液的添加量為900μL/孔。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(6)，在線性濃度範圍內，目標物濃度越大，OD值越大。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(6)的一定濃度梯度是指0～330μg/mL。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(6)，是繪製泰樂菌素與290nm下的吸光值OD的標準曲線；發酵培養結束後，發酵上清液用HCl稀釋至合適濃度，測定290nm下的吸光值OD，將吸光值OD代入標準曲線，得到相應的泰樂菌素含量。

在本發明的一種實施方式中，所述高通量孔板可以是96深孔板、96淺孔板、48深孔板、24深孔板、12深孔板等任意一種具有高通量篩選作用的培養器皿。優選地，裝有固體培養基的高通量孔板為96淺孔板，裝有發酵培養基的高通量孔板為48深孔板。

本發明的有益效果：

本發明方法結合了常壓室溫等離子體(ARTP)、PI染色法、流式細胞術分析分選法、酶標儀檢測、固液結合的培養方法和高通量篩選技術，對分選有活性弗氏鏈黴菌孢子培養提供了一種精確快速的方法。本發明方法基於流式細胞儀能夠在短時間內對單孢子檢測，從而建立龐大的分析目標群體，流式細胞術高通量的分選培養減少了在平板上生長的過程，不漏篩每個孢子，分選速度和篩選效率得以提高。此外，利用固液結合的培養方法直接提高了單個弗氏鏈黴菌孢子的生長率，解決了單個孢子在液體培養基中生長困難的問題。

具體實施方式

培養基：

(1)固體培養基(g/L)：蔗糖10g，大豆蛋白腖1g，酵母粉1g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 1g，瓊脂20g，pH調節至7.2。

(2)種子培養基(g/L)：豆餅粉5g，酵母粉5g，玉米漿6g，輕質CaCO33g，豆油4mL，pH調節至7.18。

(3)發酵培養基(g/L)：魚粉10.5g，玉米粉17g，玉米澱粉10.5g，甜菜鹼0.37g，NaCl 0.1g，KCl 0.9g，(NH4)2HPO 4g，NiSO43g，MgSO4·7H2O 0.1g，CaCO31.9g。

螢光染料配製：稱取0.01g PI，用PBS(pH 7.4)緩衝溶液定容至10mL。梯度稀釋至10μg/mL。4℃避光保存。

PI染料對弗氏鏈黴菌孢子染色：

取等體積弗氏鏈黴菌孢子懸液和10μg/mLPI染料混合，避光放置4℃冰箱染色20min。

流式細胞儀檢測：

取染色後的弗氏鏈黴菌孢子懸浮液，重新過濾，稀釋一定倍數，上流式細胞儀(MoFlo XDP)分析。根據染色劑發射螢光選擇合適通道檢測。所得數據用Summit 5.4軟體分析。

實施例1 ARTP或其他物理、化學誘變獲得不同活性孢子：

出發菌株弗氏鏈黴菌斜面菌種在29℃條件下，培養6天，直至孢子成熟，斜面菌落乳白色。刮取適量成熟斜面孢子於裝有2mL PBS緩衝液的試管中，震蕩器震勻製成菌懸液後，無菌濾紙過濾。吸取10μL合適濃度的菌懸液均勻塗布於無菌的載片表面，將載片置於載臺上，用ARTP誘變儀進行誘變。條件：入射功率為100W、氦氣流量為10SLM、分別照射一定時間獲得不同活性的孢子。其他物理、化學誘變也可獲得不同活性的孢子。

實施例2 PI染料對弗氏鏈黴菌孢子染色：

樣品誘變處理完畢後，用無菌鑷子將載片放至裝有PBS(pH 7.4)緩衝溶液的EP管中，充分振蕩1min，將附著在載片上的菌體被徹底洗脫到液PBS中。濾紙過濾，5000×g離心5min，棄去上清，加入PBS重懸。重複此操作步驟2～3次，得到純淨的弗氏鏈黴菌孢子懸液。用PBS將純淨的弗氏鏈黴菌孢子懸液稀釋至濃度105～106個孢子/mL。取等體積弗氏鏈黴菌孢子懸液和10μg/mLPI染料混合，放置4℃冰箱避光孵育20min。

實施例3 流式細胞儀檢測與分選：

檢測要建立對照試驗除去非特異性結合即背景。沒有標記任何螢光素的樣品為陰性對照，代表細胞背景螢光信號。通過陰性對照調節基本電壓，設定陰性與陽性群體界限。將完全無活性，與PI染色劑結合的樣品設置為陽性對照，確定陰性與陽性孢子群體。固定條件後進行樣品檢測。取染色後的弗氏鏈黴菌孢子懸浮液，重新過濾，稀釋一定倍數，上流式細胞儀(MoFlo XDP)分析。所得數據用Summit 5.4軟體分析。根據PI發射紅色螢光波長，用FL3通道((610±15)nm)檢測。通過調節FSC、SSC、螢光通道坐標參數，電壓以及閾值參數，首先初步獲得分析對象的群體位置。對群體位置大致設門，再次調節FSC、SSC閾值，電壓參數，將大部分的背景噪音去除。最終確定以FCS-Width為橫坐標，SSC-Log-Height為縱坐標，SSC閾值為0.02，螢光通道電壓為500為最佳分析參數。從軟體圖示中，可以看出，由於PI不能透過活細胞細胞膜，有活性弗氏鏈黴菌孢子未能被染色，無螢光信號顯示。弗氏鏈黴菌無活性孢子被PI染色後，發出紅色螢光信號。從而可以進一步分選出有活性的弗氏鏈黴菌孢子。將無螢光區域最集中部分設門分選至96孔板固體培養基中(每孔50μL)。每孔分選設定為單個孢子。

實施例4 酶標儀檢測

根據泰勒菌素在290nm處有最大光吸收這一特點，選擇酶標儀檢測泰樂菌素OD值作為初篩方法。配置一定濃度梯度的標準品，用酶標儀檢測，製得標準曲線方程y＝0.0116x+0.0414，R2＝0.9998。x為標準品濃度(μg/mL)，y為OD290nm，標準品濃度範圍為0～330μg/mL。裝有培養液48孔板4000r/min離心15min，取上清用0.1mol/L HCl稀釋一定倍數，取200μL稀釋液於96酶標板，用酶標儀測定290nm可見光下的吸光值OD。

實施例5 高產菌株的培養及篩選

經過流式細胞儀直接將單個弗氏鏈黴菌孢子分選至96淺孔板中(培養基裝量180μL)。由於弗氏鏈黴菌孢子體積過小，直接在液體培養基中生長率只有15％左右。為解決此問題，對培養方案進行改進。待裝有50μL的96孔板固體培養基上長出可見孢子之後(約4～5d)，吸取種子培養液150μL於此孔板固體培養基上。種子培養液在750r/min，29℃的孔板搖床上培養2d。經此改進後的培養方案，弗氏鏈黴菌在孔板固體培養基上生長率可達93％左右。以5％(v/v)的接種量，將96孔板中的種子液平行轉接至48孔板(裝有發酵培養液900μL)中，750r/min，29℃發酵培養6d。剩餘96孔板中的種子液用40％甘油保存於4℃冰箱。利用酶標儀高通量初篩檢測。整個過程中以出發菌株作為對照，根據與對照菌株OD值的比較，選擇誘變效果明顯的誘變菌株進行搖瓶復篩實驗。

搖瓶復篩結果顯示，本發明方法準確性很高，能夠從眾多孢子中篩選得到泰勒菌素產量相對較高的菌株。

此外，發明人還對比了本發明的基於流式細胞術與孔板高通量篩選的方法，和傳統誘變與孔板高通量篩選直接結合的方法，發現本發明的方法篩選效果極好，不會漏篩具有活性的孢子，分選速度和篩選效率顯著提高。

雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其並非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和範圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護範圍應該以權利要求書所界定的為準。