抗反饋抑制發酵方法及其在生產抗生素中的應用的製作方法

2023-06-15 04:11:21 3

專利名稱：抗反饋抑制發酵方法及其在生產抗生素中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗反饋抑制發酵方法，本發明更尤其涉及利用抗反饋抑制發酵來生產抗生素的方法。所述方法解決了發酵生產過程中的反饋抑制作用，即通過排除反饋抑制使發酵末端產物得到更多地累積。
背景技術：
生命體不斷地從外界吸收營養物質，然後進行一系列的分解與合成反應(即總稱的代謝作用)，以獲得建造自身的物質和能量。代謝過程中幾乎所有的生化反應都是通過酶的催化而實現。激活作用常見於分解代謝途徑中前體對參與後面反應的酶進行激活，促使它們反應速度加快。抑制作用常見於合成代謝的末端產物對合成反應的關鍵酶進行反饋抑制，以減慢或中止生物合成。在工業發酵中，生物合成代謝的末端產物往往正是所生產的產品。如果該末端產物對其合成過程中的關鍵酶有抑制作用，那麼反饋抑制就會成了限制產量的一個重要因素。
抗生素產業是發酵工業的一大組成部分。但是反饋抑制機理一般不被人們所重視。其原因是抗生素被分泌在細胞體外，而無法和其合成過程中的關鍵酶接觸，因為那些酶皆存在於細胞內。從空間上說抗生素體作為末端產物在細胞外累積不易對細胞內的生物合成造成化學性的反饋抑制。那麼從廣義上反饋抑制如物理性反饋抑制是否影響抗生素的生產，發明人為此進行了深入的研究，結果出人意料地發現，抗反饋抑制能夠顯著提高抗生素的產量，基於該發現，完成了本發明。

發明內容
因此，本發明的目的是提供抗反饋抑制發酵方法，該方法包括在生物發酵過程中，加入有效量的可吸附發酵末端產物的樹脂。
本發明更尤其提供了抗生素的製備方法，該方法包括在分泌所述抗生素的微生物的發酵過程中，添加有效量的可吸附所述抗生素的樹脂，使得消除由所述抗生素的積累引起的導致抗生素產生量下降的反饋抑制。
有效量例如是0.05-20％(樹脂體積/發酵體積)，優選0.1-5％(樹脂體積/發酵體積)，更優選約1-3％(樹脂體積/發酵體積)。該量可以分一次或多次添加。
所述生物包括所有可發酵的微生物，例如青黴菌，絳紅小單孢菌，頭孢菌，鏈黴菌，鏈絲菌，枯草桿菌，小單孢菌，地中海擬無枝酸菌等。
所述發酵末端產物例如包括抗感染的青黴素，紅黴素，頭孢菌素，慶大黴素，萬古黴素，鏈黴素，氯黴素，卡那黴素，林可黴素，利福黴素等，以及抗腫瘤的正定黴素，爭光黴素等。
所述發酵過程包括在發酵的初期和/或中期和/或後期。
所述樹脂是抗反饋抑制載體，它是能夠吸附目的抗生素或生物製品的樹脂。吸附樹脂包括強酸性陽離子樹脂(如帶磺酸基的苯乙烯陽離子樹脂)，弱酸性陽離子樹脂(如羧酸型弱酸性樹脂)，強鹼性陰離子樹脂(如帶有季銨基團的酚醛樹脂)，弱鹼性陰離子樹脂(如環氧型樹脂)。這些樹脂是已知的，並且可以從市場上購買到。
例如，聚苯乙烯陽離子吸附樹商品有Dowex-50，Amberlite，DiaionSK-1，732樹脂等。
強酸性陽離子樹脂如苯乙烯陽離子交換樹脂可用於慶大黴素，卡那黴素，新黴素，萬古黴素等，弱酸性陽離子交換樹脂如羧酸型樹脂可用於鏈黴素、利福黴素等。強鹼性陰離子交換樹脂例如可用於頭黴素，弱鹼性陰離子樹脂如環氧型樹脂例如可用於頭孢菌素C。
特定抗生素選擇何種樹脂一般根據其酸鹼性及強弱來決定，這對本領域的技術人員來說是容易決定的。但是所用樹脂必須是物理和化學性安定的，並不對發酵本身產生負面作用。
吸附樹脂可以分一次或多次(例如2-10次，優選3-5次)在發酵的初期和/或中期和/或後期添加。每次的添加量可以是任選的。添加的具體時間取決於具體的微生物，發酵條件(溫度、pH、總發酵時間等)等因素。例如和優選在總發酵時間進行到2/10-4/10時，添加吸附樹脂總量的1/4-1/2，在總發酵時間進行到4/10-6/10時，添加吸附樹脂總量的另外1/4-1/2，在總反應時間進行到6/10-8/10時，添加吸附樹脂總量的最後1/4-1/2。
本發明的方法適用於所有微生物分泌的生物活性物質的製備。
為了簡便起見，以下以慶大黴素為例來說明本發明的具體實施方式
，應該指出的是，其它抗生素的生產可以類似地進行。
慶大黴素是一個控制感染的有效藥物，尤其對綠膿桿菌，腸道桿菌和金葡菌感染的療效顯著。慶大黴素是由絳紅小單孢菌生產的抗生素。它是一個多組分的氨基苷類抗生素，帶有很強的正電荷。本發明中發現了慶大黴素和絳紅小單孢菌的結合速度極快並形成物理性的反饋抑制。本發明首次展示對該種反饋抑制的解決辦法。
本發明的目的在於提高慶大黴素的產量，具體地講是通過採用新的發酵工藝排除物理性反饋抑制提高慶大黴素的發酵單位。
本發明目的通過如下措施來實現1、慶大黴素效價測量測量慶大黴素的生物效價的標準菌種為短小芽孢桿菌。將已知效價的慶大黴素標準溶液和被檢品溶液，在短小芽孢桿菌生長的培養基上進行對照培養，產生透明的抑菌圈。比較標品和被檢品抑菌圈的大小，利用兩劑量法計算，求出慶大黴素抗菌效價。
2、反饋抑制的表現(1)慶大黴素的生產累積量和發酵時間的關係本發明中使用的菌種是絳紅小單孢菌(Micromonosporapurpurea菌株NRRL2953)ATCC15835，該菌保藏在美國典型培養物保藏中心(American Type CultureCollection，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110)。將絳紅小單孢菌在如下的培養基中生長玉米粉11克/升，澱粉25克/升，豆餅粉32克/升，硝酸鉀0.01克/升，碳酸鈣5克/升，硫酸銨0.25克/升，蛋白腖4.5克/升，氯化鈷15毫克/升，pH7.2。培養溫度35℃。從24小時後沒隔12小時取發酵液測量慶大黴素的發酵單位，全部發酵時間為90小時。
圖1顯示慶大黴素的發酵單位和時間的對數成直線關係，即隨著發酵時間的延續，慶大黴素的積累速度在減小。該結果說明慶大黴素的生產隨著發酵時間的增加而受到抑制。
(2)慶大黴素的反饋抑制為了分析是否是慶大黴素本身抑制了慶大黴素的生產速度，在發酵途中(24小時)向培養液中添加慶大黴素(最終濃度750單位/毫升)，觀測慶大黴素的生產速度是否有變化。結果展示添加組的慶大黴素積累和無添加組形成非平行關係(圖1)。
以上結果明確地說明在慶大黴素發酵過程中存在生產抑制現象，而這種抑制是來源於慶大黴素本身，即慶大黴素的反饋抑制。
3、抗反饋抑制發酵綜合上述結果，慶大黴素在絳紅小單孢菌周圍的積累，對絳紅小單孢菌形成了一個不利於向體外分泌新合成的慶大黴素的物理性環境。
針對這一物理性質的反饋抑制，採取了物理方法加以排除。抗反饋抑制發酵如下。絳紅小單孢菌的培養基組成可以為玉米粉5-15克/升，澱粉10-50克/升，酵母粉或黃豆粉25-40克/升，硝酸鉀0.01-0.45克/升，碳酸鈣2.5-7.5克/升，硫酸銨0.1-3.5克/升，蛋白腖3.5-7.5克/升，氯化鈷5-50毫克/升，pH6.8-7.6。培養溫度35-37℃。在發酵進行到24，36，72小時的時候，分別加入0.05-5％(樹脂體積/發酵體積)可吸附慶大黴素的苯乙烯陽離子交換樹脂(商品名Dowex-50)。在不同的樹脂加入量中，0.5％(樹脂體積/發酵體積)的效果為佳，如圖2所示，增加了20％左右的發酵效率。同類樹脂，商品名Amberlite，DiaionSK-1和732樹脂發揮了同樣的效果。
4、慶大黴素的純化常規的慶大黴素純化方式是向發酵液中加入硫酸使pH降為.5進行酸化處理，溶解絳紅小單孢菌以便釋放出慶大黴素。在1小時後用氫氧化鈉中和到pH6，8，加入1.5％(樹脂體積/發酵體積)苯乙烯陽離子交換樹脂吸附慶大黴素，然後過濾分離出樹脂。因本發明在慶大黴素發酵過程中，已經使樹脂(商品名Dowex-50，Amberlite，DiaionSK-1和732樹脂)和慶大黴素結合，不需用硫酸對發酵液進行pH1.5的強酸化處理，在慶大黴素的純化過程中節省了大量的酸和鹼，有利於環保和降低成本。本發明可直接從發酵液中過濾分離出吸附了慶大黴素的樹脂，或者只需加入少量的硫酸調節pH為3.5至7.0使發酵液的粘度降低以利於過濾分離樹脂。得到的樹脂經氯化氨(0.4摩爾)和低濃度氨水(0.1摩爾)衝洗，最後用高濃度氨水(1摩爾)解離。
本發明之抗反饋抑制發酵法可以在其他抗生素或分泌型生物製品的製造中應用。其改變處為添加能夠吸附目的抗生素或生物製品的樹脂。但是所用樹脂必須是物理和化學性安定的，不對發酵本身產生負面作用。


圖1慶大黴素在發酵中的反饋抑制表現圖中X軸為發酵時間(小時)，以對數形式表示；Y軸為慶大黴素發酵效價(單位/毫升)。
「□」表示常規的慶大黴素發酵；「○」表示在24小時添加慶大黴素(750單位/毫升)後出現的嚴重反饋抑制發酵情景。
圖2抗反饋抑制發酵圖中X軸為發酵時間(小時)，以對數形式表示；Y軸為慶大黴素發酵效價(單位/毫升)。
「□」表示常規的慶大黴素發酵；「○」表示添加樹脂(Dowex-50)後的抗反饋抑制發酵。添加時間為24，48和72小時，添加量每次0.5％(體積/體積)。
具體實施例方式
下面列舉實施例，對本發明進一步說明，應該清楚的是，這些實施例僅用於例證的目的，不限制本發明的範圍。
實施例1慶大黴素抑制發酵。培養基含有玉米粉11克/升，澱粉25克/升，豆餅粉32克/升，硝酸鉀0.01克/升，碳酸鈣5克/升，硫酸銨0.25克/升，蛋白腖4.5克/升，氯化鈷15毫克/升，pH7.2。培養溫度35℃。發酵體積10升。在24小時加入750萬單位慶大黴素，繼續發酵66小時。
實施例2物理性抗反饋抑制發酵。絳紅小單孢菌的培養基組成為玉米粉11克/升，澱粉25克/升，豆餅粉32克/升，硝酸鉀0.01克/升，碳酸鈣5克/升，硫酸銨0.25克/升，蛋白腖4.5克/升，氯化鈷15毫克/升，pH7.2。培養溫度35℃。發酵體積10升。當發酵進行到24，36，72小時的時候，分別加入5毫升的苯乙烯陽離子交換樹脂(商品名Dowex-50)。全部發酵時間為90小時，結果如圖2所示。
實施例3物理性抗反饋抑制發酵。同實施例2，不同之處是當發酵進行到24，36，72小時的時侯，分別加入50毫升的樹脂(商品名Dowex-50)。獲得了與實施例2類似的結果。
實施例4物理性抗反饋抑制發酵。同實施例2，不同之處是當發酵進行到24，36，72小時的時侯，分別加入500毫升的樹脂(商品名Dowex-50)。獲得了與實施例2類似的結果。
實施例5物理性抗反饋抑制發酵。同實施例2，不同之處是當發酵進行到24，36，72小時的時侯，分別加入50毫升的樹脂(商品名Amberlite)。獲得了與實施例2類似的結果。
實施例6物理性抗反饋抑制發酵。同實施例3，不同之處是當發酵進行到24，36，72小時的時侯，分別加入50毫升的樹脂(商品名DiaionSK-1)。獲得了與實施例2類似的結果。
實施例7物理性抗反饋抑制發酵。同實施例3，不同之處是當發酵進行到24，36，72小時的時侯，分別加入50毫升的樹脂(商品名732樹脂)。獲得了與實施例2類似的結果。
實施例8慶大黴素的純化。向實施例1-7的培養液中加入硫酸使pH降為4.5，過濾分離出樹脂。得到的吸附了慶大黴素的樹脂經氯化氨(0.4摩爾)和低濃度氨水(0.1摩爾)衝洗，最後用高濃度氨水(1摩爾)解離。
實施例9慶大黴素的純化。同實施例8，不同之處是不向發酵後的培養液中加入硫酸，並保持培養液在中性附近(pH6.5-7.5)，過濾分離出樹脂。
比較例1慶大黴素常規發酵。培養基含有玉米粉11克/升，澱粉25克/升，豆餅粉32克/升，硝酸鉀0.01克/升，碳酸鈣5克/升，硫酸銨0.25克/升，蛋白腖4.5克/升，氯化鈷15毫克/升，pH7.2。培養溫度35℃。發酵體積10升。發酵時間90小時。
比較例2慶大黴素的常規純化。向比較例1的培養液中加入硫酸使pH降為1.5，1小時後加氫氧化鈉中和到pH6.8並加入150毫升的732樹脂。4小時後過濾分離出樹脂。得到的吸附了慶大黴素的樹脂經氯化氨(0.4摩爾)和低濃度氨水(0.1摩爾)衝洗，最後用高濃度氨水(1摩爾)解離。結果如圖2所示，比本發明實施例的發酵效率低大約20％。
實施例10頭黴素C的抗反饋抑制發酵。鏈絲菌NRRL3802的培養基包括燕麥粉20g/L，番茄醬20g/L，水，種子接種量5體積％。發酵時間為72小時。培養溫度25℃。總發酵體積為10L。在發酵進行到20、40和60小時時分別添加5ml強陰離子酚醛樹脂。吸附了頭黴素C的樹脂用5％氯化鈉洗脫。
比較例3與實施例10類似地進行，只是不添加酚醛樹脂。
結果表明，實施例10的產量比比較例3高15％。
實施例11在含碳源、氮源和硫源的培養基中培養頂孢頭孢菌，分兩組進行，一組在發酵過程中添加基於發酵體積的1％的環氧型弱陰離子交換樹脂，另一組不添加。結果在發酵過程中添加了樹脂的頭孢菌素C產量比不添加的頭孢菌素C產量高18％。
實施例12利福黴素的抗反饋抑制發酵。發酵培養Amycolatopsismediterranei。培養基包括葡萄糖10％，黃豆餅粉1.0％，蛋白腖1.0％，魚粉0.5％，KNO30.8％，KH2PO40.015％，氯化鈷1ug/ml，CaCO30.5％。發酵溫度28℃，發酵時間140小時。在發酵進行到30、60、90和120小時時，分別添加基於發酵體積的0.3體積％的羧酸型陽離子交換樹脂。吸附了利福黴素的樹脂用95∶5甲醇-水解吸。
比較例4與實施例12類似地進行，只是在發酵過程中不添加樹脂。結果實施例12比比較例4產量提高23％。
權利要求
1.抗反饋抑制發酵方法，該方法包括在生物發酵過程中，加入有效量的可吸附發酵末端產物的樹脂。
2.利用抗反饋發酵來製備抗生素的方法，該方法包括在分泌所述抗生素的微生物的發酵過程中，添加有效量的可吸附所述抗生素的樹脂，使得消除由所述抗生素的積累引起的導致抗生素產生量下降的反饋抑制。
3.根據權利要求2的方法，其中有效量是0.05-20％(樹脂體積/發酵體積)，優選0.1-5％(樹脂體積/發酵體積)，更優選約1-3％(樹脂體積/發酵體積)。
4.根據權利要求2的方法，所述微生物為青黴菌，絳紅小單孢菌，頭孢菌，鏈黴菌，鏈絲菌，枯草桿菌，小單孢菌，或地中海擬無枝酸菌。
5.根據權利要求2的方法，其中所述抗生素為抗感染的青黴素，紅黴素，頭孢菌素，慶大黴素，萬古黴素，鏈黴素，氯黴素，卡那黴素，林可黴素或利福黴素，或抗腫瘤的正定黴素或爭光黴素。
6.根據權利要求2的方法，所述發酵過程包括在發酵的初期和/或中期和/或後期。
7.根據權利要求2的方法，其中所述樹脂包括強酸性陽離子樹脂(如帶磺酸基的苯乙烯陽離子樹脂)，弱酸性陽離子樹脂(如羧酸型弱酸性樹脂)，強鹼性陰離子樹脂(如酚醛樹脂)，或弱鹼性陰離子樹脂(如環氧型樹脂)。
8.根據權利要求2的方法，其中所述樹脂可以分一次或多次(例如2-10次，優選3-5次)在發酵的初期和/或中期和/或後期添加，每次的添加量可以是任選的。
9.根據權利要求2的方法，其中在總發酵時間進行到2/10-4/10時，添加吸附樹脂總量的1/4-1/2，在總發酵時間進行到4/10-6/10時，添加吸附樹脂總量的另外1/4-1/2，在總反應時間進行到6/10-8/10時，添加吸附樹脂總量的最後1/4-1/2。
10.慶大黴素發酵生產方法，該方法特徵在於在發酵過程中加入陽離子交換樹脂，使陽離子交換樹脂和已分泌的慶大黴素結合，從而消除已產生的慶大黴素引起的反饋抑制，以及特徵在於直接從發酵液中過濾分離出吸附了慶大黴素的樹脂，或者只需加入少量的硫酸調節pH為3.5至7.0使發酵液的粘度降低以利於過濾分離樹脂，因此在純化慶大黴素時不需用硫酸對發酵液進行強酸化處理。
全文摘要
本發明涉及抗反饋抑制發酵方法，該方法包括在生物發酵過程中，加入有效量的可吸附發酵末端產物的樹脂。本發明更尤其提供了抗生素的製備方法，該方法包括在分泌所述抗生素的微生物的發酵過程中，添加有效量的可吸附所述抗生素的樹脂，使得消除由所述抗生素的積累引起的導致抗生素產生量下降的反饋抑制。
文檔編號C12P1/04GK1560262SQ20041003939
公開日2005年1月5日 申請日期2004年2月17日 優先權日2004年2月17日
發明者竇德獻 申請人:竇德獻