六味生脈片劑的檢測方法

2023-06-14 21:46:41 1

專利名稱：六味生脈片劑的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種六味生脈片劑的檢測方法，屬於對藥品進行質量控制的技術領 域。
背景技術：
六味生脈片為丹參、人參、麥冬等中藥組成的複方製劑，具有補氣養陰，養血活血 的功效。藥理研究表明該製劑能延緩衰老，提高機體免疫功能等。適用於老年氣陰兩虛所 致的倦怠乏力，食欲不振，失眠多夢，心悸氣短等症。六味生脈片原藥品名稱為「益壽康泰片」，其質量標準收載於1993年版《四川省藥 品標準(中藥成方製劑)》中，最初由衛生部門批准為保健品，後在國家藥監局保健品整頓 行動中，本申請人對其質量控制標準進行了再研究，形成了現在執行的「六味生脈片質量標 準」，因其組方合理，用於補氣養陰、養血活血的功效明顯，且安全無明顯的毒副作用，最終 被國家藥監局批准為中藥保健藥品，並按中藥命名原則，依其組方及其功效將其藥品名稱 重新修訂為現在的「六味生脈片」。在產品生產過程的質量控制中，本申請人的研究人員發現，原「益壽康泰片」質量 標準所擬定的檢測方法中，對方中主要起補氣、養血活血的人參和當歸等藥材無專屬的鑑 別檢查方法，所採用的方法均是對含內酯化合物及含顯螢光化合物等一大類物質的鑑別檢 查，專屬性不強，不能對藥品質量及藥品真偽起到很好的控制和監查作用；還有，藥品組方 中列為君藥的丹參有效成份丹參酮II A的含量檢測方法，也不盡科學合理，所採用樣品前 處理方法是加熱回流提取，且加熱提取時間較長，需用1. 5小時左右，而丹參酮II A的熱不 穩定性，在長時間加熱條件下易發生降解，使其檢出值降低，不能有效反應藥品中有效成份 丹參酮II A的真實含量；而雙波長薄層掃描測定法也存在程序繁瑣，檢出結果易受薄層點 樣和展開過程中的人為操作因素及實驗材料薄層板的優劣等諸多因素的影響，導致結果誤 差較大，重現性差，使含量測定值不能反應產品藥效成份的真實值。因此，用該質量檢測方 法不能有效的控制產品質量，不能準確真實地反應產品的質量情況，對產品的質量沒有起 到有效的監控作用，從而影響了該產品的生產成本及臨床療效。

發明內容
本發明的目的，是提供一種六味生脈片劑的檢測方法。本發明針對上述現有六味 生脈片(即原益壽康泰片)的質量控制標準簡單，鑑別檢查專屬性不強，含量測定方法所得 結果誤差較大，含量測定值不能反應產品藥效成份的真實值，使產品質量不易控制的缺點， 對六味生脈片製劑的成分鑑別和含量測定進行了研究，擬定了 HPLC法以取代原雙波長薄 層掃描測定丹參酮II A的含量，以及在鑑別當中增加了人參所含人參皂苷的薄層鑑別和當 歸的薄層鑑別，提高了六味生脈片的質量控制標準，從而保證了該製劑的臨床療效。本發明所述的六味生脈片是這樣構成的處方丹參257g、人參32g、麥冬192g、 五味子97g、當歸97g、枸杞子160g;製法以上六味，除丹參外，枸杞子等五味，用70%乙
4醇回流提取三次，第一次加4倍量提取3小時，第二、三次各加3倍量，各提取2小時，合併 提取液，濾過，濾液回收乙醇，濃縮成相對密度為1.35 1.40(50°C )的稠膏；丹參用乙醇 回流提取三次，第一次加4倍量提取3小時，第二、三次各加3倍量，各提取2小時，合併提 取液，濾過，濾液回收乙醇，濃縮成相對密度為1. 35 1. 40 (500C )的稠膏；合併上述兩種 稠膏，在70°C 80°C、-0. OSMpa條件下減壓乾燥，粉碎，加入澱粉適量混勻，制粒，乾燥，加 硬脂酸鎂適量，壓製成1000片，包薄膜衣，即得。本發明所述的檢測方法，主要包括性狀、鑑別、檢查、含量測定項目；其中鑑別是對 該製劑中丹參所含丹參酮II A的薄層鑑別，人參所含人參皂苷的薄層鑑別，當歸的薄層鑑 別，含量測定是對製劑中丹參所含丹參酮II A的含量測定。丹參酮II A的鑑別是以丹參酮II A為對照品，以氯仿為展開劑的薄層鑑別法；人參皂苷的鑑別是以人參皂苷Rbl、Rgl、Re為對照品，以氯仿甲醇水= 13 7 2為展開劑的薄層色譜法；當歸的鑑別是以當歸對照藥材作為對照，以石油醚醋酸乙酯=9 1為展開劑 的薄層色譜法；所述鑑別包括以下項目(1)丹參酮II A的成分鑑別取本品，除去包衣，研細，加丙酮，回流提取，濾過，濾液作為供試品溶液，另取丹參 酮II A對照品，加無水乙醇製成對照品溶液；吸取上述兩種溶液，分別點於同一以羧甲基纖 維素鈉為粘合劑的矽膠G薄層板上，以氯仿為展開劑，展開，取出，晾乾，供試品色譜中，在 與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；(2)人參皂苷的成分鑑別取本品，除去包衣，研細，加乙醚，超聲提取，濾過，濾渣揮幹乙醚，加甲醇1，超聲提 取，濾過，濾液蒸乾，殘渣加氫氧化鈉溶液使溶解，通過已處理好的Dltll型大孔吸附樹脂柱， 用氫氧化鈉溶液洗脫，棄去鹼液，繼用水洗至洗脫液呈中性，棄去水液，再用乙醇溶液洗脫， 棄去乙醇溶液，最後用乙醇溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，蒸乾，殘渣加甲醇使溶解，取上清液 作為供試品溶液，另取人參皂苷Rbl、Rgl、Re為對照品，加甲醇製成混合溶液，作為對照品 溶液；吸取上述供試品溶液、對照品溶液，分別點於同一矽膠G薄層板上，以氯仿甲醇 水=13 7 2，10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾乾，噴以硫酸乙醇溶液， 烘至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；(3)當歸的鑑別取本品，除去包衣，研細，加乙醚，超聲提取，濾過，濾液揮幹，殘渣加醋酸乙酯使溶 解，作為供試品溶液；另取當歸對照藥材，加乙醚，超聲提取，濾過，濾液作為對照藥材溶液， 吸取上述供試品溶液、對照品溶液，分別點於同一矽膠G薄層板上，以石油醚醋酸乙酯= 9 1為展開劑，展開，取出，晾乾，置紫外燈光(365nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照藥 材色譜相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點。具體的鑑別的方法包括以下項目(1)丹參酮II A的成分鑑別取本品5片，除去包衣，研細，加丙酮10ml，回流提取2小時，濾過，濾液作為供試品 溶液，另取丹參酮II A對照品，加無水乙醇製成Iml含Img的溶液，作為對照品溶液；吸取上
5述兩種溶液各5 μ 1，分別點於同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的矽膠G薄層板上，以氯仿 為展開劑，展開，取出，晾乾，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的 斑點；(2)人參皂苷的成分鑑別取本品20片，除去包衣，研細，加乙醚30ml，超聲提取15分鐘，濾過，濾渣揮幹乙 醚，加甲醇30ml，超聲提取15分鐘，濾過，濾液蒸乾，殘渣加1 %氫氧化鈉溶液IOml使溶解， 通過已處理好的DlOl型大孔吸附樹脂柱(內徑1. 5cm，長12cm)，用氫氧化鈉溶液90ml 洗脫，棄去鹼液，繼用水洗至洗脫液呈中性，棄去水液，再用20%乙醇溶液70ml洗脫，棄去 20%乙醇溶液，最後用70%乙醇溶液IOOml洗脫，收集70m%乙醇洗脫液，蒸乾，殘渣加甲醇 Iml使溶解，取上清液作為供試品溶液，另取人參皂苷Rbl、Rgl、Re為對照品，加甲醇製成每 Iml各含Img的混合溶液，作為對照品溶液；吸取上述供試品溶液10 μ 1、對照品溶液4 μ 1， 分別點於同一矽膠G薄層板上，以氯仿甲醇水=I3 7 2，10°C以下放置的下層溶液 為展開劑，展開約17cm，取出，晾乾，噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C烘至斑點顯色清晰，供 試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；(3)當歸的鑑別取本品10片，除去包衣，研細，加乙醚20ml，超聲提取15分鐘，濾過，濾液揮幹，殘 渣加醋酸乙酯Iml使溶解，作為供試品溶液；另取當歸對照藥材0. 5g，加乙醚5ml，超聲提取 15分鐘，濾過，濾液作為對照藥材溶液，吸取上述供試品溶液10 μ 1、對照品溶液5 μ 1，分別 點於同一矽膠G薄層板上，以石油醚(60 90°C)醋酸乙酯=9 1為展開劑，展開，取 出，晾乾，置紫外燈光(365nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯 相同顏色的螢光斑點。丹參酮II A的含量測定是以丹參酮II A為對照品，以甲醇水=70 30為流動 相的高效液相色譜法。所述含量測定的方法丹參酮II A的含量測定用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，甲醇水=70 30為流動相，檢測波長為 270nm，理論板數按丹參酮II A峰計算應不低於7000 ；精密稱取丹參酮丹參酮II A對照品， 置棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取，置棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得對 照品溶液；取本品，除去包衣，精密稱定，研細，精密稱取，置具塞磨口棕色三角瓶中，精密加 入甲醇，稱定重量，超聲提取，放至室溫，用甲醇補足減失的重量，過濾，即得供試品溶液；分 別精密吸取對照品溶液與供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測定，即得，本品每片含丹參 以丹參酮II A計不得少於0. 30mg。更具體的含量測定的方法丹參酮II A的含量測定用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，甲醇水=70 30為流動相，檢測波長為 270nm,理論板數按丹參酮II A峰計算應不低於7000 ；精密稱取丹參酮丹參酮II A對照品 IOml，置50ml棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取2ml，置25ml棕色量瓶中，加甲醇 至刻度，搖勻，即得對照品溶液(每Iml中含丹參酮II Α16μ g)；取本品20片，除去包衣，精 密稱定，研細，精密稱取0. 7g，置具塞磨口棕色三角瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，超
6聲提取30分鐘，放至室溫，用甲醇補足減失的重量，過濾，即得供試品溶液；分別精密吸取 對照品溶液與供試品溶液各10μ 1，注入高效液相色譜儀，測定，即得，本品每片含丹參以丹 參酮II A計不得少於0. 30mg。為了確保本發明的成分鑑別和含量測定方法科學、合理、可行，本申請人對方法中 藥品成分的鑑別和含量測定方法進行了研究，具體試驗資料如下一 .人參皂苷的薄層鑑別研究由於人參主要含皂苷類等成分，故設計以人參皂苷Rbl、Rgl、Re為對照，對方中人 參進行鑑別。由於製法項下，藥材採用乙醇回流提取，提取出成分較多，故樣品的前處理較 麻煩。方法1 取本品IOg(相當於人參藥材lg)，置索氏提取器中用乙醚提取2小時，棄去 乙醚，殘渣揮幹乙醚，加水飽和正丁醇IOOml超聲提取1小時，濾過，正丁醇提取液用氫 氧化鈉水溶液洗至水相幾乎無色，然後再用蒸餾水洗至中性，KT醇揮幹，殘渣加甲醇Iml使 溶解，作為供試品溶液。方法2 取本品20片，除去糖衣，研細，加乙醚30ml，超聲處理15分 鍾，濾過，殘渣揮幹乙醚，加甲醇30ml，超聲處理15分鐘，濾過，濾液蒸乾，殘渣加1 %氫氧 化鈉溶液IOml使溶解，通過已處理好的DlOl型大孔樹脂柱(柱徑1. 50m，長12cm)，用 氫氧化鈉溶液90ml洗脫，棄去鹼液，繼用水洗至洗脫液呈中性，棄去水液，再用20%乙醇溶 液70ml洗脫，棄去20%乙醇溶液，最後用70%乙醇溶液IOOml洗脫，收集70%乙醇溶液， 蒸乾，殘渣加甲醇Iml使溶解，取上清液作為供試品溶液。吸附劑選用矽膠G板，展開劑選 用氯仿醋酸乙酯甲醇水=15 40 22 10，10°C以下放置的下層液及氯仿甲 醇水=13 7 2，10°C以下放置的下層液，顯色劑為10%硫酸乙醇溶液。方法1的提 取較複雜，因乳化嚴重，供試品中Rbl斑點極弱，方法2的供試品處理較易，且能檢出Rbl斑 點，故正文中採用方法2的前處理方法。由於本品製法項下，藥材採用95%乙醇，70%乙醇 提取，提取出成分較多，雖然按皂苷性質，對樣品進行前處理，但展開顯色後，目光下斑點較 少，但紫外光燈下螢光斑點很多，故檢測時，選擇日光下檢視，陰性無幹擾。二.當歸的薄層鑑別研究研究中曾擬對當歸中所含阿魏酸進行薄層鑑別，方法設計為取本品6.35g置索 氏提取器中，加乙醚加熱提取4-5小時，乙醚提取液蒸乾，殘渣加石油醚(60 90°C )浸漬 二次(15ml X 2，2分鐘)，傾去石油醚，殘渣加2ml無水乙醇氯仿=3 2使溶解，作為供 試品溶液。另取阿魏酸對照品，加甲醇製成每Iml含Img的溶液，作為對照品溶液，照薄層 色譜法試驗，吸取上述供試品溶液10μ 1，對照品溶液5μ 1，分別點於同一含羧甲基纖維素 鈉為粘合劑的矽膠G薄層板上，以苯甲醇冰醋酸=30 3 1為展開劑，展開，取出， 晾乾，氨氣燻後立即置紫外光燈(365nm)檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置 上，應顯相同顏色的螢光斑點。因幹擾多，色譜分離不好，由於當歸主要含揮髮油，內酯，阿 魏酸等成分，後設計以當歸藥材為對照，對方中當歸進行鑑別。樣品採用乙醚提取即可。吸 附劑採用矽膠G板，展開劑選用石油醚(60 90°C)醋酸乙酯=9 1及正己烷醋酸 乙酯=9 1，顯色劑選用紫外光燈(365nm)下檢視。供試品中，均檢出當歸斑點，陰性無幹 擾。三、丹參酮II A含量測定方法研究1.實驗所用儀器
7儀器名稱型號高效液相色譜儀WATERS600,486 檢測器色譜數據工作站Empower 軟體、Waters Bus、SAT/IN Moduel色譜柱NOVA-PAK(4. 6X250mm)，NOVA-PAK(3. 9X150mm)色譜柱大連依利特 Hypersil (4. 6 X 250mm)電子天平METTLE AE240(感量 0. lmg、0. Olmg) 2.實驗試劑與試藥試劑色譜純甲醇(Fisher scientific)，水為蒸餾水用前超聲脫氣，其餘均為分 析純。對照品丹參酮IIA(批號0766-200011)，中國藥品生物製品檢定所供試品040201、040202、040203(美大康中心實驗室提供)陰性樣品040204批(美大康中心實驗室提供)3.檢測方法的選擇3. IHPLC法的方法預試以HPLC法測定丹參酮IIA的含量，已成為檢定丹參中脂溶性成分丹參酮II A的 主流方法，本實驗借鑑《中國藥典》二 000年版一部丹參藥材項下HPLC含量測定方法，對六 味生脈片製成的供試品進行實驗，看藥典提供的色譜系統，樣品製備方法，是否能使被檢測 成分丹參酮IIA峰達到基線分離，峰形對稱，而陰性樣品以無幹擾。(1)色譜系統流動相甲醇水=90 30色譜柱大連依利特Hpersil柱 4. 6 X 300mm,檢測波長 270nm(2)對照品溶液的製備精密稱取丹參酮II A對照品0. 00235g,置於25ml棕色容 量瓶中，溶解定容，取2ml，置於IOml棕色容量瓶中。(3)供試品、陰性樣品液的製備精密稱取六味生脈片(040201)0. 6778g，陰性樣 品(040204)0. 6424g，參照《中國藥典》二 000版一部丹參藥材項方法製成供試品液與陰性 樣品液。(4)測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品、陰性樣品液各10ul，注入高效液 相色譜儀，測定，記錄色譜圖。從實驗色譜圖分析，六味生脈片供試品中與對照品丹參酮II A保留時間相同的位 置有丹參酮II A峰，基線分離好，丹參酮IIA峰形對稱，理論塔板數17000，但不足是被檢測 峰位置處陰性樣品也有吸收，說明上述色譜系統用於丹參酮II A的含量測定有成功的可 能，還須調整系統流動相的比例，來克服陰性樣品的幹擾。3. 2流動相的調整與確定流動相為甲醇水=90 30的條件下，陰性樣品有幹擾，為了消除幹擾的影響， 我們對流動相的比例作了調整，分別在甲醇水=70 30，甲醇水=80 30兩種流動 相下按HPLC方法預試實驗的方法，在大連依利特Hpersil柱(4.6X300mm)上作了兩次實
8驗，從實驗的色譜峰圖中可以看出，在大連依利特Hpersil柱(4.6X300)上，兩種流動相 都能使被檢測成分丹參酮IIA達基線分離，峰形對稱，但流動相甲醇水=80 30的色 譜數據反應出陰性樣品仍有一定幹擾，而流動相為甲醇水=70 30的條件下做出的實 驗，則顯示出陰性樣品已完全沒有幹擾，缺點書甲醇水=70 30作流動相在大連依利特 Hpersil柱(4.6X300mm)這樣的長柱一上，保留時間偏長。通過以上幾次實驗，申請人確定以甲醇水=70 30作HPLC法的流動相。3. 3分析柱的選擇及理論塔板數的確定由於用大連依利特Hpersi {柱(4. 6 X 300mm)確定的甲醇水=70 30作流動 相保留時間為37分鐘，保留時間太長，理論塔板數太高，實驗中考慮用Waters NOVA-PAK為 填充劑的3. 9X 150nm柱與4. 6 X 300mm色譜柱，按HPLC方法預試實驗的方法進行實驗，看 在更換填充劑、縮短柱長的條件下，在滿足分離條件的同時，能否將理論塔板數降下來，能 否將保留時間縮短，以達到檢測分板快速的目的。從兩次實驗的色譜峰圖可以看出，以Waters NOVA-PAK (3. 9 X 150ram)柱實 驗，被檢測峰低矮，峰形不對稱，理論塔板數為3200，不能滿足分離條件，而以Waters NOVA-PAK (4. 6 X 300mm)柱作實驗，從色譜圖看，被檢測峰基線分離好，峰形對稱，保留時間 為22分鐘，理論塔板數為7200。所以通過以上實驗確定，將系統適用性的理論塔板數定為不低於7000。4.檢測條件的選擇4.1溶劑的選擇丹參藥材中有效成分分為水溶性成分與脂溶性成分兩類，脂溶性成分主要為結晶 性蒽醌類化合物，有隱丹參酮，丹參酮I，丹參酮II A、丹參酮II B、丹參酮水溶性成分為丹參 素、原兒茶醛、原兒茶酸。丹參脂溶性成分的提取文獻材料與藥典一致以甲醇作溶劑。所以 本發明選取甲醇作溶劑。4. 2檢測波長的選擇精密稱取丹參酮II A對照品0. 00245g,置50ml量瓶中，甲醇溶解定容後，並稀釋 10倍，上普析Tu-1800spc，存250nm—290nm範圍內進行掃描，丹參酮IIA對照品的最大吸 收波為269. 3nm，從而驗證了中國藥典方法和本發明選取270nm作為檢測波長的一致性。4. 3對照品溶液的製備本方法選取溶劑與中國藥典一部丹參藥材項標準一致，用甲醇作溶劑，製成16ug/ ml的濃度(經預試該濃度下的吸收度A值符合藥典規定，峰面積響應值適中)。4. 4供試品溶液的製備根據溶劑的選擇確定以甲醇作為供試品液的提取溶劑，由於原試行質量標準，供 試品以索氏提取製備供試液的方法繁瑣，所以申請人重點考查了回流提取及超聲萃取製備 供試液的方法。4. 4. 1回流提取方式的考查以中試樣品040201作為供試品，去除糖衣後，研細，分別稱取4份約0. 7g的供試 品入具塞錐瓶中，加甲醇50ml分別水浴回流1、2、3、4小時，以下按本發明測定方法，實驗結 果見表1。表1
從表1數據看出，以甲醇作溶劑熱回流，丹參酮II A易於提出，1小時後丹參酮II A 已完全提出，隨回流時間的延長，由於丹參酮II A的熱不穩定性，反而使檢出值降低。4. 4. 2超聲萃取方式的考查以中試樣品040201作為供試品，去除糖衣後，研細，分別稱取4份約0. 7g的供試 品入具塞錐瓶中，加甲醇50ml分別於超聲儀上超聲30分、1小、1. 5小、2小時，以下按本發 明測定方法，實驗結果見表2。表2 從上表數據看出，用甲醇超聲萃取30分鐘能將丹參酮II A完全提出，考慮到超聲 萃取與熱回流兩種提取方式比較，超聲萃取更方便，提取時間更短；所以申請人確定以甲醇 萃取30分鐘作為供試品製備方法。2. 1.5線性關係的考查精密稱取丹參酮II A對照品0. 00278g，置50ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解並稀釋 至刻度，搖勻，作為對照品的儲備液。精密吸取對照品的儲備液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml，分別置IOml容量瓶中，加甲醇
稀釋定容。分別取5種不同稀釋濃度的丹參酮IIA對照品溶液各10ul，注入高效液相色譜儀 中，按上述色譜條件進行分析，在270nm測定峰面積，結果見表3。表 3 丹參酮II A濃度在0. 0556-0. 278ug範嘲內與響應值(峰面積)呈良好的線性關 系，回歸方程及相關係數:A = 1. 39199 C+0. 198867607，r = 0. 99999 (C為丹參酮II A的濃 度，單位g/ml，A為峰面積)，以濃度(μ g/ml)為橫坐標⑴，以峰面積為縱坐標⑴，繪製 標準曲線。
2. 1. 6精密度試 分別精密吸取對照品溶液(濃度為16. 68ug/ml)，與供試品溶 液(批號為040201)各10 μ 1，按上述色譜條件連續進樣5次，測定峰面積，結果見表4、表 5。表4 對照品精密度試驗結果表 由表4可見對照品連續進樣5次，峰面積平均值為1196305，RSD = . . 25%，表明 對照品精密度良好表5 六味生脈片樣品精密度試驗結果表 由表5可見樣品進樣5次，峰面積平均值為1055935，RSD = 0. 22%，表明樣品精
密度良好。2. 1. 7穩定性試驗取批號為040201的樣品，稱取0. 7001g，按供試品溶液的製備方法製備成供試液， 與對照品溶液(濃度為19. 28μ g/ml)各取10ul，對照品溶液按1小時的時間間隔連續進 樣，樣品溶液於1、2、4、8、16小時進樣，記錄色譜圖，考查對照品及樣品的穩定性，結果見表 6、表 7。表6 對照品穩定性試驗結果表 如表6所示，峰面積均值為1278303，RSD = 0. 14%，表明對照品在6小時內測定穩定。表7 六味生脈片樣品溶液穩定性試驗結果表
如表7所示，樣品峰面積的平均值為981107，RSD = 0. 1%，表明樣品在16小時內 穩定，在16小時內任一時間均可檢測。2. 1.8重現性試驗取批號為040202的六味生脈片樣品0. 7g共5份，按樣品分析方法進行測定，結果 見表8。表8 六味生脈片樣品重現性試驗結果表 如表8所示，該樣品含量的平均值為0. 146%, RSD = 0. 97%，表明本發明提供的 測定方法對六味生脈片的含量測定具有良好的重現性。2. 1.9加樣回收率試驗稱取混合均勻批號為040202的六味生脈片內容物5份，其含量為0. 146%。按加 入純品量與所取樣品含量之比1 1加入對照品，按樣品含量測定方法進行處理並測定，按 下述公式計算回收率，結果見表9計算式 表9 加樣回收率試驗結果表NO峰面積 (A)取樣量 (g)橙皮苷加 入量 Cmg)含橙皮苷 量 (mg)橙皮苷測得量 (mg)回收率 (%)平均回收率 (%)RSD (%)126422720.64579.660.901.834499.197.61.54227520680.65439.471.001.920795.5330273440.69639.761.102.101898.7430018970.69899.551.102.084196.7528904560.70229.821.002.006898.2如表9所示，該方法的平均加樣回收率為97.6%，RSD = 1. 54%，可以看出該方法 具有較好的可靠性。2. 1. 10兩種含量檢測方法檢測值之比為了比較兩種含量檢測方法之間存在的方法差異，申請人以中試樣品040204按 原質量標準中的雙波長薄層掃描法和新擬定的HPLC法進行多次含量測定，測定結果見表 10。表10 兩種檢測方法檢測結果
NO12345平均值相對偏差HPLC 法0. 136%0. 134%0. 135%0. 134%0. 133%0. 134%0. 85%雙波長TLC法0. 141%0. 130%0. 137%0. 132%0. 140%0. 136%3. 56%從表10可以看出，用擬定的HPLC法測定含量，經多次檢測，其相對偏差為0.85%; 而用原質量標準中的雙波長薄層掃描法多次檢測同一批產品含量，其相對偏差為3. 56%。 可見用原質量標準中的含量測定方法測定含量其重現性較差，而用HPLC法測定含量重同 性好，更為準確。同時用HPLC法測定同一批產品其測定結果略低於雙波長薄層掃描法測定結果。本檢測方法與原益壽康泰片的質量檢測方法相比，將原來鑑別檢查中專屬性不強 的顯色反應取消，增加了人參及當歸的專屬性鑑別，並將丹參中丹參酮II A的含量測定的 供試品製備方式，由加熱回流提取改為超聲提取，測定方法由雙波長薄層掃描提升為高效 液相色譜法。本發明的有效果益本發明的檢測方法，所採用的鑑別方法專屬性強、含量測定方法精密度高，重現性 好，回收率高，供試品前處理簡單，且超聲提取使有效成份不發生降解，所採用的HPLC法也 減小了原雙波長薄層掃描測定中人為因素和實驗材料對檢測結果帶來的誤差，從而使產品 藥效成份的測定值更接近真實值，提高了對六味生脈片質量控制的有效性和質量控制標 準，使其更能真實地反應產品的質量情況，提高了對六味生脈片產品質量的監控水準，從而 保證了該六味生脈片劑生產成本的穩定可控和臨床療效。
具體實施例方式本六味生脈片劑的檢測方法處方丹參257g、人參32g、麥冬192g、五味子97g、當歸97g、枸杞子160g。
製法以上六味，除丹參外，枸杞子等五味，用70%乙醇回流提取三次，第一次加4 倍量提取3小時，第二、三次各加3倍量，各提取2小時，合併提取液，濾過，濾液回收乙醇， 濃縮成相對密度為1.35 1.40 (50°C)的稠膏；丹參用乙醇回流提取三次，第一次加4倍量 提取3小時，第二、三次各加3倍量，各提取2小時，合併提取液，濾過，濾液回收乙醇，濃縮 成相對密度為1. 35々1. 40 (500C )的稠膏；合併上述兩種稠膏，在70°C 80°C、-0. 08Mpa 條件下減壓乾燥，粉碎，加入澱粉適量混勻，制粒，乾燥，加硬脂酸鎂適量，壓製成1000片， 包薄膜衣，即得。性狀本品為薄膜衣片，除去薄膜衣後顯棕色；氣微香，味微甘、苦。鑑別(1)取本品5片，除去薄膜衣，研細，加丙酮10ml，回流提取2小時，濾過，濾液作 為供試品溶液，另取丹參酮II A對照品，加無水乙醇製成Iml含Img的溶液，作為對照品溶 液；吸取上述兩種溶液各5 μ 1，分別點於同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的矽膠G薄層板 上，以氯仿為展開劑，展開，取出，晾乾，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相 同顏色的斑點。(2)取本品20片，除去薄膜衣，研細，加乙醚30ml，超聲提取15分鐘，濾過，濾渣揮 幹乙醚，加甲醇30ml，超聲提取15分鐘，濾過，濾液蒸乾，殘渣加氫氧化鈉溶液IOml使 溶解，通過已處理好的DlOl型大孔吸附樹脂柱(內徑1. 5cm，長12cm)，用氫氧化鈉溶液 90ml洗脫，棄去鹼液，繼用水洗至洗脫液呈中性，棄去水液，再用20%乙醇溶液70ml洗脫， 棄去20%乙醇溶液，最後用70%乙醇溶液IOOml洗脫，收集70m%乙醇洗脫液，蒸乾，殘渣加 甲醇Iml使溶解，取上清液作為供試品溶液，另取人參皂苷Rbl、Rgl、Re為對照品，加甲醇制 成每Iml各含Img的混合溶液，作為對照品溶液；吸取上述供試品溶液10 μ 1、對照品溶液 4μ1，分別點於同一矽膠G薄層板上，以氯仿甲醇水=I3 7 2，10°C以下放置的下 層溶液為展開劑，展開約17cm，取出，晾乾，噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C烘至斑點顯色清 晰，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。(3)取本品10片，除去薄膜衣，研細，加乙醚20ml，超聲提取15分鐘，濾過，濾液 揮幹，殘渣加醋酸乙酯Iml使溶解，作為供試品溶液；另取當歸對照藥材0. 5g，加乙醚5ml， 超聲提取15分鐘，濾過，濾液作為對照藥材溶液，吸取上述供試品溶液10 μ 1、對照品溶液 5口1，分別點於同一矽膠6薄層板上，以石油醚(60 90°0 醋酸乙酯=9 1為展開劑， 展開，取出，晾乾，置紫外燈光(365nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位 置上，顯相同顏色的螢光斑點。檢查按中國藥典2000年版一部片劑項下各項內容檢查。含量測定丹參酮II A的含量測定照高效液相色譜法(中國藥典一部附錄VID)測定用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，甲醇水=70 30為流動相，檢測波長為 270nm,理論板數按丹參酮II A峰計算應不低於7000 ；精密稱取丹參酮丹參酮II A對照品 IOml，置50ml棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取2ml，置25ml棕色量瓶中，加甲醇 至刻度，搖勻，即得對照品溶液(每Iml中含丹參酮II Α16μ g)；取本品20片，除去薄膜衣， 精密稱定，研細，精密稱取0. 7g，置具塞磨口棕色三角瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量， 超聲提取30分鐘，放至室溫，用甲醇補足減失的重量，過濾，即得供試品溶液；分別精密吸
14取對照品溶液與供試品溶液各10μ 1，注入高效液相色譜儀，測定，即得，本品每片含丹參以 丹參酮II A計不得少於0. 30mg。
權利要求
一種六味生脈片劑的檢測方法，所述六味生脈片劑由丹參257g、人參32g、麥冬192g、五味子97g、當歸97g、枸杞子160g和適當鋪料製備而成，該檢測方法包括性狀、檢查、鑑別和含量測定項目；其特徵在於所述鑑別是對該製劑中丹參所含丹參酮ⅡA的薄層鑑別，人參所含人參皂苷的薄層鑑別，當歸的薄層鑑別；所述含量測定是對製劑中丹參所含丹參酮ⅡA的含量測定丹參酮ⅡA的鑑別是以丹參酮ⅡA為對照品，以氯仿為展開劑的薄層鑑別法；人參皂苷的鑑別是以人參皂苷Rb1、Rg1、Re為對照品，以氯仿∶甲醇∶水＝13∶7∶2為展開劑的薄層色譜法；當歸的鑑別是以當歸對照藥材作為對照，以石油醚∶醋酸乙酯＝9∶1為展開劑的薄層色譜法；丹參酮ⅡA的含量測定是以丹參酮ⅡA為對照品，以甲醇∶水＝70∶30為流動相的高效液相色譜法。
2.根據權利要求1所述六味生脈片劑的檢測方法，其特徵在於具體的鑑別和含量測定包括(1)丹參酮IIA的成分鑑別取本品，除去包衣，研細，加丙酮，回流提取，濾過，濾液作為供試品溶液，另取丹參酮 II A對照品，加無水乙醇製成對照品溶液；吸取上述兩種溶液，分別點於同一以羧甲基纖維 素鈉為粘合劑的矽膠G薄層板上，以氯仿為展開劑，展開，取出，晾乾，供試品色譜中，在與 對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；(2)人參皂苷的成分鑑別取本品，除去包衣，研細，加乙醚，超聲提取，濾過，濾渣揮幹乙醚，加甲醇，超聲提取，濾 過，濾液蒸乾，殘渣加氫氧化鈉溶液使溶解，通過已處理好的Dltll型大孔吸附樹脂柱，用氫 氧化鈉溶液洗脫，棄去鹼液，繼用水洗至洗脫液呈中性，棄去水液，再用乙醇溶液洗脫，棄去 乙醇溶液，最後用乙醇溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，蒸乾，殘渣加甲醇使溶解，取上清液作為 供試品溶液，另取人參皂苷Rbl、RgU Re對照品，加甲醇製成混合溶液，作為對照品溶液； 吸取上述供試品溶液、對照品溶液，分別點於同一矽膠G薄層板上，以氯仿甲醇水= 13 7 2，10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾乾，噴以硫酸乙醇溶液，烘至 斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；(3)當歸的鑑別取本品，除去包衣，研細，加乙醚，超聲提取，濾過，濾液揮幹，殘渣加醋酸乙酯使溶解， 作為供試品溶液；另取當歸對照藥材，加乙醚，超聲提取，濾過，濾液作為對照藥材溶液，吸 取上述供試品溶液、對照藥材溶液，分別點於同一矽膠G薄層板上，以石油醚醋酸乙酯= 9 1為展開劑，展開，取出，晾乾，置365nm紫外光燈下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材 色譜相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點。(4)丹參酮IIA的含量測定用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，甲醇水=70 30為流動相，檢測波長為270nm， 理論板數按丹參酮II A峰計算應不低於7000 ；精密稱取丹參酮II A對照品，置棕色量瓶中， 加甲醇至刻度，搖勻，精密量取，置棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得對照品溶液；取本 品，除去包衣，精密稱定，研細，精密稱取，置具塞磨口棕色三角瓶中，精密加入甲醇，稱定重量，超聲提取，放至室溫，用甲醇補足減失的重量，過濾，即得供試品溶液；分別精密吸取對 照品溶液與供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測定，即得，本品每片含丹參以丹參酮II A 計不得少於0. 30mg。
3.根據權利要求2所述六味生脈片劑的檢測方法，其特徵在於更具體的鑑別和含量測定的方法包括(1)丹參酮IIA的成分鑑別取本品5片，除去包衣，研細，加丙酮10ml，回流提取2小時，濾過，濾液作為供試品溶 液，另取丹參酮II A對照品，加無水乙醇製成Iml含Img的溶液，作為對照品溶液；吸取上述 兩種溶液各5 μ 1，分別點於同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的矽膠G薄層板上，以氯仿為 展開劑，展開，取出，晾乾，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑佔.(2)人參皂苷的成分鑑別取本品20片，除去包衣，研細，加乙醚30ml，超聲提取15分鐘，濾過，濾渣揮幹乙醚，加 甲醇30ml，超聲提取15分鐘，濾過，濾液蒸乾，殘渣加氫氧化鈉溶液IOml使溶解，通過 已處理好的Dltll型大孔吸附樹脂柱，用氫氧化鈉溶液90ml洗脫，棄去鹼液，繼用水洗至 洗脫液呈中性，棄去水液，再用20%乙醇溶液70ml洗脫，棄去20%乙醇溶液，最後用70%乙 醇溶液IOOml洗脫，收集70%乙醇洗脫液，蒸乾，殘渣加甲醇Iml使溶解，取上清液作為供試 品溶液，另取人參皂苷Rbl、Rgl、Re對照品，加甲醇製成每Iml各含Img的混合溶液，作為對 照品溶液；吸取上述供試品溶液10μ 1、對照品溶液4μ 1，分別點於同一矽膠G薄層板上，以 氯仿甲醇水=13 7 2，10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開約17cm，取出，晾 幹，噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C烘至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照品色譜相應 的位置上，顯相同顏色的斑點；(3)當歸的鑑別取本品10片，除去薄膜衣，研細，加乙醚20ml，超聲提取15分鐘，濾過，濾液揮幹，殘渣 加醋酸乙酯Iml使溶解，作為供試品溶液；另取當歸對照藥材0. 5g，加乙醚5ml，超聲提取 15分鐘，濾過，濾液作為對照藥材溶液，吸取上述供試品溶液10 μ 1、對照品溶液5 μ 1，分別 點於同一矽膠G薄層板上，以沸點60 90°C石油醚醋酸乙酯=9 1為展開劑，展開，取 出，晾乾，置365nm紫外光燈下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相 同顏色的螢光斑點；(4)丹參酮IIA的含量測定用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，甲醇水=70 30為流動相，檢測波長為270nm， 理論板數按丹參酮II A峰計算應不低於7000 ；精密稱取丹參酮II A對照品10mg，置50ml棕 色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取2ml，置25ml棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即 得每Iml中含丹參酮II A16yg的對照品溶液；取本品20片，除去包衣，精密稱定，研細，精 密稱取0. 7g，置具塞磨口棕色三角瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，超聲提取30分鐘， 放至室溫，用甲醇補足減失的重量，過濾，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液與供 試品溶液各IOy 1，注入高效液相色譜儀，測定，即得，本品每片含丹參以丹參酮II A計不得 少於 0. 30mgo
全文摘要
本發明公開一種六味生脈片劑的檢測方法，該檢測方法包括性狀、檢查、鑑別和含量測定項目。它是針對現有六味生脈片(原益壽康泰片)的質量控制標準簡單，產品質量不易控制的缺點，對製劑的成分鑑別和含量測定進行了研究，擬定了HPLC法以取代原雙波長薄層掃描測定丹參酮ⅡA的含量，以及在鑑別當中增加了人參所含人參皂苷的薄層鑑別和當歸的薄層鑑別。所採用的方法專屬性強、精密度高，重現性好，回收率高，提高了六味生脈片的質量控制標準，從而保證了該製劑的臨床療效。
文檔編號A61P1/14GK101912522SQ201010241370
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月28日 優先權日2010年7月28日
發明者卿光明, 李彥, 鍾瑛 申請人:四川美大康藥業股份有限公司