一種人腫瘤標誌物-Tim17多肽及其用途的製作方法

2023-06-14 21:29:36 1

專利名稱：一種人腫瘤標誌物-Tim17多肽及其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬生物技術和醫學領域。具體涉及一種新的人腫瘤標誌物_Timl7多肽(translocase of inner mitochondrial membrane 17)，編碼Timl7的多核苷酸序列和經重組技術產生該蛋白的方法。本發明還涉及Tim17蛋白及其編碼序列的用途，如用於腫瘤的預防，早期檢測，預後的判斷，以及含Timl7蛋白拮抗劑(如抗體和反義核酸，RNAi等)的藥物組合物。
背景技術：
生物標誌物(biomarker)是指能被客觀測量的，指示正常生理或病理過程，或是機體對於藥物反應的物理、化學、生物指標。腫瘤研究的最關鍵的問題之一，就是尋找早期檢測，診斷分型，治療監測和預後，以及作為藥物靶標的標誌物。細胞從正常狀態轉變為腫瘤的過程中，細胞內蛋白表達譜會發生一系列變化。腫瘤標誌物就是在腫瘤發生和發展過程中，由腫瘤細胞合成釋放或宿主對腫瘤反應性釋放的一類物質。它們具有一定的特異性與靈敏度，可以用作診斷與治療中的監測指標。 目前，已被用於臨床的腫瘤標誌物還相當缺乏。各國的標誌物審核標準略有不同。我國在腫瘤標誌物應用方面主要還是參照美國等西方發達國家的標準。以美國為例，每年ASC0(American Society of Clinical Oncology)都會對腫瘤臨床所用的生物標誌物提出指導性建議。如2007年能用於乳腺癌的標誌物包括ER/PR，HER2，uPA/PAIl，和多參數基因表達分析方法(0ncotype DM， MammaPrint等)，並提供了詳細的建議使用條件和範圍。其餘的如Ki67， Cyclin D， Cyclin E， p27， p21，蛋白質組分析等因證據不充分，不被建議使用(參見ASC0網頁)。可以看到，在承認這些標誌物在改善病人診斷，治療中的作用同時，目前腫瘤病人的發病率和致死率仍總體上呈上升趨勢。這一現象要求更多更好的腫瘤標誌物的發現和臨床應用。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的人腫瘤標誌物Tim17的多肽SEQ ID N0:1，核酸(RNA)SEQ ID NO :5，及其片斷，類似物，衍生物。 本發明的另一個目的是提供編碼上述RNA，多肽的脫氧核酸序列(DNA)SEQ ID NO :6。 本發明的另一個目的是提供上述RNA和多肽的製備方法，以及該RNA，多肽和其編碼序列的用途。 所述的RNA可以通過PCR的方式產生。具體的說，可以用SEQ ID NO :3中的引物對，通過聚合酶鏈反映，獲得序列為SEQ ID NO :5的RNA產物。所述多肽可以通過化學合成的方式生產。該RNA和多肽均可幫助檢測腫瘤的存在。 本發明經過廣泛而深入的研究，發現了新的可作為腫瘤標誌物的基因。該基因的表達產物，包括RNA SEQ ID N0:4和蛋白SEQ ID NO :2，在正常細胞和組織中幾乎檢測不到，在腫瘤細胞和組織中卻有很高的表達。並且表達量與腫瘤的級別，分化程度，以及病人的預 後都呈明顯正相關。研究結果表明Timl7是一特異的腫瘤標誌物。在此基礎上完成了本發 明。 具體的說，本發明通過系統地比較來自同一個病人的，不同惡性程度的乳腺癌細 胞系，獲得了一系列的差異表達蛋白質。Timml7A是其中的一個新的腫瘤特異表達的蛋白。 其一個多肽，SEQ ID N0:1，被穩定同位素標記的質譜法特異檢出在腫瘤中具有高於正常細 胞4. 8倍的表達水平。通過定量RT-PCR的方法，結果顯示腫瘤中Timml7A的RNA表達也明 顯高於正常對照的水平。同時，通過抗體驗證發現，Timl7(包括A，B兩個亞型，抗體不區分 這兩個亞型)的蛋白也在腫瘤中呈上升趨勢(圖1A，B)。更進一步，通過免疫組化的方法， 本發明對43例正常和乳腺癌腫瘤病人的組織進行試驗(圖1C，表l)，結果顯示，正常乳腺 組織中未見有Timl7蛋白的表達，而早期乳腺疾病(Hyperplasia,乳腺增生)中則顯示有 Timl7的表達；在早期乳腺癌病人中(DCIS，原位導管瘤)達到表達高峰。上述實驗證據表 明Timl7具有作為早期檢測乳腺癌標誌物的潛在作用。 為了驗證上述實驗結果，本發明進行了資料庫數據發掘的工作。在0ncomine (麗w. on固ine. org)資料庫中，存放著大量腫瘤病例的RNA微陣列晶片數據。本發明對Timml7A 基因進行搜索和數據整理，其中，乳腺癌和正常組織的比較結果顯示，乳腺癌中Timml7A的 表達水平明顯高於正常對照(圖2);在乳腺癌的級別，分化程度和Timml7A的表達相關分 析中，顯示了明顯正相關(圖3)。更有意義的是，在病人預後和Timml7A的表達相關分析 中，也顯示了明顯正相關(圖4);同時Timl7的另一個亞型，Timml7B基因，也顯示了上述 這些結果。上述結果表明，Timl7的兩個亞型均能成為潛在的腫瘤發現(早期檢測)，診斷 (分級別)，預後的標誌物。 為了觀察Tim17的腫瘤高表達現象是否僅僅局限於乳腺癌，本發明對Oncomine數 據庫裡的其他腫瘤也進行了類似的數據挖掘分析。結果顯示，在肺癌，肝癌，腸癌，膀胱癌， 前列腺癌，淋巴癌中，均存在該種腫瘤中高表達的現象(圖5)。分析結果證實，Timl7是一 個廣譜的腫瘤標誌物。 本發明根據Timl7在腫瘤中的過表達，進行抑制它的表達是否能抑制腫瘤的生長 檢驗設計合成了針對Tim17的shRNA，並將它克隆到可誘導表達的慢病毒(lenti-viral) 載體中。結果顯示，抑制Timl7的表達可顯著抑制腫瘤的生長。所述結果進一步證實Tim17 能作為腫瘤治療的靶標。


圖1Timl7在乳腺癌細胞系和組織中的表達， 其中，A :用Timl7A的特異引物進行的定量反轉錄-PCR，結果以對照基因GAPDH進 行標準化表示，圖中16N，HME為正常乳腺上皮細胞，其餘為乳腺癌細胞；B :乳腺細胞中用免 疫印記法檢測Timl7蛋白，細胞標識如A ;C :組織中用免疫組化檢測Timl7蛋白，圖為正常， 原位癌，和侵襲性癌的示例；上正常；中原位導管癌；下侵襲性癌。 圖2TI匪17A RNA在正常對照和乳腺癌腫瘤病人組織中的表達差異(數據挖掘結
果)，其中，Class l:Normal(7例)；Class 2 :Breast Carcinoma(45例)。 圖3TI匪17A表達水平與乳腺癌病人預後呈顯著正相關(數據挖掘結果)，
4
其中，A :數據集l，Class 1 :生存(121例)，Class 2 :死亡(38例)；B :數據集2， Class 1 :無疾病(180例)，Class 2 :復發(93例)。 圖4TI匪17A表達水平與乳腺癌級別和分化程度呈顯著正相關(數據挖掘結果)，
其中，A :數據集1， Class 1 :grade 1 (68例)，Class 2 :grade 2 (126例)，Class 3 :grade 3 (55例)；B :數據集2， Class 1 :grade 1 (67例)，Class 2 :grade 2 (128例)， Class 3 :grade 3 (54例);C :數據集3， Class 1 :高分化(30例)，Class 2 :中分化(83 例)，Class 3 :低分化(83例)。 圖5TI匪17A許多腫瘤中都有過表達，是一個廣譜的標誌物(0ncomine數據分析結
果)。其中，A :膀胱癌;B :腸癌;C :肝癌;D :肺癌;E :前列腺癌。
具體實施例方式
在本發明的第一方面，提供了新穎的分離出的差異表達的Timl7多肽，它包含具 有SEQ ID N0:1胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性多肽、或其活性衍生物。
實施例1 :獲得差異表達的Timl7多肽 從一個病人分離得到的乳腺癌細胞系，包括正常(16N)，腫瘤(NT)，和轉移瘤 (MT2)，用D3_Leu (Cambridge Isotope公司)穩定同位素培養標記腫瘤細胞。正常和轉移瘤 細胞用含D。-Leu的培養液培養。將三個細胞系的蛋白質用裂解液(8M urea，2. 5Mthiourea， 65mM DTT，4% (w/v)CHAPS,0. 5% (v/v)Biolytes pH 3-10，proteaseinhibitor cocktail) 抽提，定量(RC DC Protein Assay Kit,Biorad公司)。等量的蛋白質混合成正常腫瘤組 和腫瘤轉移瘤組，然後以一維SDS凝膠電泳分離。凝膠經染色後，每一凝膠條切割成大小 相似的8個條帶。每一條帶經脫色，幹膠，膠內酶切，提肽等步驟，再用液相色譜分離多肽。 分離的多肽由LTQ-Orbitrap(ThermoElectron公司)質譜儀進行鑑定。鑑定獲得1200多 個蛋白的定量信息。其中70多個被確定為顯著差異表達的蛋白。除去已知的腫瘤標誌物， 在餘下的新標誌物中，確定差異表達顯著的TI匪17A(Tim17蛋白兩個亞型中的一個)，其為 具有重要線粒體功能的蛋白。所獲得的定量信息的多肽為GKEDPWNSITSGALTGAILAAR。在腫 瘤中，它的表達比正常細胞高4. 8倍。經多次的質譜鑑定均得到相同的結果。
在本發明的第二方面，提供了編碼分離的所述多肽的多核苷酸。SEQ ID NO :4。實 施例2 :從乳腺癌細胞系中獲得編碼TI匪17A的全長基因 用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取21T乳腺癌細胞系(來源於NT或MT2兩 禾中細胞)中的總RNA，用PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa公司)將 總RNA反轉錄成cDNA。以合成的cDNA為模板，設計含酶切位點的TI匪17A克隆基因正向引 物(已經除去原TI匪17A的起始密碼子ATG)5'-CA GAA TTC TGG AGG AGT ACGCGC GAG-3' 和反向引物5' -GACCTCGAGCTACTGATATTGTCGATA-3'，用熱啟動Taq DNA聚合酶(TaKaRa公 司)進行PCR反應，反應條件為98度預變性2分鐘，然後95度10秒，55度退火15秒，72 度40秒進行延伸反應，反映30個循環。將PCR產物和pcDNA3. 0-HA-FLAG空載體分別進行 EcoRI和Xhol雙酶切、連接以及DH5 a細菌的轉化實驗，得到TI匪17A基因轉化的陽性克 隆，待DNA測序確定基因序列無誤後得到pcDNA3. 0-HA-FLAG-TI匪-17A載體。
在本發明的第三方面，提供了模擬、促進、拮抗人Timl7活性的化合物，以及抑制 人Timl7的表達的化合物。較佳地，該化合物是人Timl7編碼序列或其片斷的小分子幹擾RNA。將所述的小分子shRNA克隆到pLVTHM載體中成pLVTHM-sTimml7A.將該載體同包裝 質粒共轉入包裝細胞293T以產生病毒。用病毒感染待測腫瘤細胞，發現待測腫瘤細胞的生 長明顯減慢。 實施例3 :TI匪17A小分子幹擾RNA抑制腫瘤的生長 按照shRNA的設計規則，設計三個序列的23鹼基shRNA。將其中具有較好的抑制基 因表達效果的序列克隆到pLVTHM(Trono實驗室，Switzerland)載體的Mlul和Clal位點。 產生的載體命名為pLVTHM-sTimml7A。為了產生可誘導的shRNA表達細胞系，pLVPT-tTR/ KRAB-Red載體(Trono實驗室，Switzerland)轉入293T細胞。同時，兩個包裝載體PMD. G(VSV. G) ， CMV-DR891被共轉入293T細胞。轉染的293T細胞繼續生長48小時後，收集細 胞的上清。過濾去除細胞，將上清感染MDA-231乳腺癌細胞。被感染的MDA-231細胞經48 小時培養後，用流式細胞儀分選獲得帶紅色螢光的表達KRAB抑制因子的細胞。獲得穩定 表達KRAB的MDA-231-KRAB細胞株。將構建的pLVTHM-sTimml7A載體與PMD. G(VSV. G)， CMV-DR891包裝載體共轉入293T細胞以產生shRNA的表達載體病毒顆粒。用上述產生穩 定細胞株同樣的方法，以病毒感染MDA-231-KRAB細胞株，從而產生可被D0X(Sigma公司) 誘導表達shRNA的MDA-231-KRAB-sTimml7A細胞株。所述細胞在1 P g/ml的D0X下，表達 shRNA，抑制TI匪17A基因的表達。 在這一基礎上，將MDA-231-KRAB-sTimml7A細胞株以50000/孔的密度，接種於96 孔細胞培養皿中的10個孔。其中5個孔培養在有D0X培養液中，另5個孔培養在無D0X的 培養液中。72小時後，用MTT (Sigma公司)法測量細胞生長狀況。結果顯示，有DOX的培養 液培養的MDA-231-KRAB-sTimml7A細胞與無D0X的細胞相比有50%的生長抑制。
在本發明的第四方面，提供了含有上述小分子幹擾RNA的載體和病毒。載體和病 毒的產生過程已在實施例3中詳述。 在本發明的第五方面，提供了檢測樣品中是否存在Tim17的方法。它包括抽提組 織中的RNA，反轉錄成cDNA。用設計合成的引物序列(SEQ ID NO :3)進行定量PCR擴增。 另一檢測蛋白質水平的方法是抽提組織中的蛋白質，用特異抗體進行免疫印記反應。或，
對石蠟包埋的組織，用特異抗體進行免疫組化試驗。還提供了檢測腫瘤的方法，包括對樣
品進行上述的定量PCR試驗，免疫印記試驗或免疫組化試驗，結果高於本底水平的個體患
有腫瘤或腫瘤易感性高於正常人群。 實施例4 :定量PCR檢測TI匪17A的RNA 按照質譜鑑別出的蛋白相應序列和NCBI網站上的基因序列信息(accession number :NM 006335. 1)，用primer3軟體(http://frodo.wi.mit. edu/primer3/input. htm) 設計TI匪17A引物。獲得的上遊引物序列，從5'到3'為atccctggaactccatcaca，下遊引 物序列為tgcagaggcaaatcttgtca。引物設計時使擴增產物跨過基因組序列的2號內含子， 從而降低基因組DNA影響結果的可能性。定量PCR的內參為GAPDH基因。所用的GAPDH基 因的上遊弓l物為cgagatccctccaaaatcaa，下遊弓l物為ttcacacccatgacgaacat。 用Trizol 提取總RNA，經分光光度計(260nm/280nm)測RNA的濃度和純度。用3 y g總RNA和oligo dT弓l物經PrimeScript 1st strand cDNASynthesis Kit進行反轉錄(TaKaRa)。在25 ii 1 定量PCR反應體系中，加入75ng cDNA模板，lXSY服Premix Ex Taq(Perfect Real Time; TaKaRa)和各200nM的引物。用iQ5定量PCR儀(Bio-rad公司)進行擴增反應。反應程序為95t:初始變性10秒，兩步法進行40個循環，95°C ， 5秒變性，6(TC退火，延伸20秒。用 iQ5 (Bio-Rad) v2. 0版本軟體在相對定量模式下進行數據定量分析。圖1A是定量PCR實驗 的一個結果。用細胞系RNA，發現正常細胞16N，HME表達很低的TI匪17A RNA，而腫瘤細胞， 如NT， MT2， T47D表達量顯著高於正常細胞。
實施例5 :免疫印跡和免疫組化檢測Timl7蛋白 應用Timl7的抗體(兔抗人TI匪17A/TI匪17B抗體，PTGLAB公司)，在細胞和組織 中進行免疫印跡和免疫組化實驗。在免疫印跡中，用6-15%梯度SDS-PAGE凝膠分離大約 30ii g總蛋白，然後轉移到PVDF膜(Amersham Bioscience公司)上。用含5XBSA的TBST 緩衝液(137mM NaCl，20mM Tris-HCl pH7. 6，0. 1% Tween 20)封閉PVDF膜，與Timl7抗體 室溫孵育一小時或者4度孵育過夜，洗滌，HRP偶聯的二抗孵育。洗好的膜加上超敏化學發 光液(Amersham Bioscience)顯影，經LAS-3000成像系統成像(Fuji, Japan)。經Multi Gauge V3.0(Fuji公司，Japan)軟體對免疫印跡的條帶定量。圖IB為免疫印跡實驗在細胞 系中的結果。Actin B抗體(鼠抗人Actin B抗體，PTGLAB公司)作文上樣的對照。實驗 表明，在正常乳腺上皮細胞，16N和HME中，Timl7處於很低的表達水平，而在乳腺癌細胞，NT 和MT2中，Timl7的表達水平顯著增高。 在免疫組化實驗中，經福馬林固定和石蠟包埋的組織晶片購自US Biomax公司 (CA， U. S. A. Catalog :TMA_BR480)。切片經脫蠟和水化後，經0. 01M檸檬酸鹽緩衝液(pH = 6.0)水煮復原抗原。與l : 100稀釋的抗Timl7的一抗4度過夜孵育。再由抗兔的HRP聚 合體檢測系統檢測，Olympus BX51顯微鏡系統成像。由兩個研究員對染好的組織晶片進行 評分，至少10%的乳房上皮細胞被染上色的晶片算作陽性晶片。數據用Fisher Exact方法 進行統計學顯著性檢驗P〈0.05。圖1C示例了正常，原位導管癌，和侵襲性癌的免疫組化 染色。結果顯示，所有5個正常組織中都不表達Timl7蛋白，而Timl7蛋白最早在早期乳腺 疾病，乳腺增生中有部分表達；到早期腫瘤原位導管癌時達到了表達高峰(檢測的腫瘤中 100%表達，6/6)。結果顯示，Timl7能作為乳腺癌預防和早期檢測的標誌物。
在本發明的第六方面，提供了本發明多肽和編碼序列的用途。用途包括用多肽免 疫動物獲得針對多肽的抗體，再通過抗體檢測蛋白的表達。可以通過血液，組織，及其他體 液(如乳腺吸液，nipple aspirate)進行檢測。編碼序列的作用包括通過其設計引物，探 針，及siRNA， shRNA等用於檢測DNA， RNA的表達，突變，和由於抑制基因表達達到抑制腫瘤 生長的治療效果。所述用途在實施例3、4、5中有所描述。 在本發明的第七方面，提供了一種藥物組合，它含有安全有效量的本發明的人 Timl7拮抗劑以及藥學上可接受的載體。優選的拮抗劑是小分子幹擾RNA序列。這些藥物 組合物可治療腫瘤。具體的是，用pLVTHM載體構建成的pLVTHM-sTimml7A，以及用其產生的 缺陷病毒。這些結果在實施例3中有所描述。 在本發明的其他方面由於本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易 見的。 表1是Timl7在人正常和腫瘤組織中的表達。
表l
7Aged (range)Tim 17 Staining (pos/total)P V3lU6 e
Normal15-260/5-
Hyperplasia22-725/90.062937
LCISa40-622/40.166666
DCISb30-496/60.002164
ICC31-6710/190.047101 其中，'，小口十原位癌Lobular carcinoma in situ ;b導管原位癌Ductal carcinoma
in site ; c浸潤性癌Infiltrating carcinoma ;d年齡；P值以Fisher Exact統計計算。 —種人腫瘤標誌物_Timl7多肽及其用途序列表 SEQUENCE LISTING 〈110>復旦大學 —種人腫瘤標誌物_Timl7多肽及其用途 〈130〉11 〈160>6 〈170>Patentln version 3. 1 〈210>1 〈211>22 〈212>PRT 人體 〈400〉 1 Gly Lys Glu Asp
1 Ala lie Leu Ala
20 〈210>2 171 〈212〉PRT 〈213〉人體 〈400>2 Met Glu Glu Tyr 1 5 Cys Gly Gly Ala
20 Ala lie Lys Gly
35 Arg Gly Ser Leu
50
Pro
5 Ala
Trp Asn Ser Arg
lie Thr Ser Gly Ala Leu Thr Gly 10 15
Ala Arg Glu Pro Cys Pro Trp Arg lie Val Asp Asp
10 15 Phe Thr Met Gly Thr lie Gly Gly Gly lie Phe Gin
25 30 Phe Arg Asn Ser Pro Val Gly Val Asn His Arg Leu
40 45 Thr Ala lie Lys Thr Arg Ala Pro Gin Leu Gly Gly 55 60
8
Ser Phe Ala Val Trp Gly Gly Leu Phe Ser Metlie Asp Cys Ser Met6570 7580Val Gin Val Arg Gly Lys Glu Asp Pro Trp AsnSer lie Thr Ser Gly8590 95Ala Leu Thr Gly Ala lie Leu Ala Ala Arg Asn Gly Pro Val Ala Met
100 105 110
Val Gly Ser Ala Ala Met Gly Gly lie Leu LeuAla Leu lie Glu Gly115 120 125Ala Gly lie Leu Leu Thr Arg Phe Ala Ser AlaGin Phe Pro Asn Gly130 135 140Pro Gin Phe Ala Glu Asp Pro Ser Gin Leu ProSer Thr Gin Leu Pro145 150 155160Ser Ser Pro Phe Gly Asp Tyr Arg Gin Tyr Gin165 170〈210>3〈211>40〈212>DNA〈213〉人體〈400>3atccctggaa ctccatcacatgc3gaggca朋tcttgtca〈210>4〈211>1644〈212>DNA〈213〉人體〈400>4agtcaagatg gaggagtacg cgcgagagcc ttgcccatggcgaattgtgg atgactgtgg60tggggccttt acgatgggta ccattggtgg tggtatctttc朋gc朋tca朋ggttttcgc朋ttctcca gtgggagt朋3cc3C3gact 3cgagggagtttgacagcte tt朋朋cc3g180ggctccacag ttaggaggta gctttgcagt ttggggagggctgttttcca tgattgactgtegtetggtt c朋gtc3gag g朋3gg朋g3 tccctgg朋ctccatcacaa gtggtgcctt300朋cgggagcc 3tectggcag c朋g3朋tgg accagtggccatggttgggt cagccgcaat360gggtggcatt ctcctagctt teattgaagg agctggtatcttgttgacaa gatttgcctctgcacagttt cccaatggtc ctcagtttgc agaagacccctcccagttgc cttcaactcagttaccttcc tcaccttttg gagactetcg acaatetcagtaggacttct ttcctaggat
40
9
ttcttt朋ca g朋cgagttg tggttcgaga 3ggatttcag 33gatc朋gt tecagtctgttttt朋朋cc ateggtggga cagctetggc c朋teggcte teaagagaca tttegcacttttttctettt朋agg朋c朋gcgggg朋gg gtgctea朋g at朋tecgtt tetttettcacacttg朋tt gcatttgtga tc朋33te朋tgttte朋tc gcte朋gg朋朋tec3gt朋gtgcttga朋g3tg朋ggac c朋朋ggcc3朋朋3C3gtg朋3tetgatc atcatctctt840
gcggacttct ctgcctggtt ttgtgtgttc tgttattcaa acaateaaaa gctggtggaacttactcttt cttttaagat aagttgtaga cttcgatgtt tcatgctcat gtacttcaaateatgcatgt tttetegtte gtccctcatc acttgaagtg acttctgaga attetgcaga
gtc朋catggtetegtttecactctcttcccaacttgcttgg3卿gtttccaagtcctccacttcagaagatgttegttgtectgte朋actgattgtg
〈210〉5〈211〉155〈212〉PRT〈213〉人體〈400〉5Ala Thr1
Cys Ala
atcatttcac
tttegggcteccaateteccagtgtttctttgcate皿cgcaggtcattt
cacacgtttetttggateat
Elgtg卿tgC
ctgagtcttgcaattctetegtetgcttgaatgtettttgtcctgatettttgcctecattcttttggccttgggaattt
tttetggatttgtcttggttattcctgatctg朋g朋ttc
gggtctggtt
gg朋gtg3C3
ctgtggg腿caatgccatetcgactgtgg
Cys
Ala Cys35
Cys Ala
50Ala Gly65
Thr Cys
Cys20Gly
Gly
Thr
Ala
Cys Cys Thr5
Ala Ala Gly
Gly Gly Ala40
Cys Ala Ala55
Gly Gly Cys70
Gly Cys Cys
Gly10Thr25Gly
Gly
Cys
Gly
g朋ggatetg gtea朋tgttttgaggatet tggatec朋3
3tC3g3朋tt tC3CC3g朋3
atggagagtg tectggcacttgtectgttt tgaatgtgtt
gggCCtgg朋￡l￡ltgg￡ltg￡lg
tgtggcccte teggaggcattggag朋c朋agccatgtggcatetggteg gcattteatt
GlyGlyCysAla
85
Gly Cys Ala Thr Thr Cys100
Ala75Cys90Thr Cys105
Ala Ala Cys15
Gly Thr Gly30
Cys Ala Thr45
Ala Ala Thr60
Thr Gly Gly
Ala Ala Thr95
Cys Thr Ala110
Thr
Cys
Ala
Gly
Thr80Gly
Gly
Cys Cys Ala ThrCys Thr Thr AlaCysGly
Thr
Thr Gly GlyAla Cys CysGly Gly GlyGly Thr Gly
Gly
Cys Thr Thr Thr
600660720780
■960102010801140120012601320138014401500156016201644
Ala Ala Thr Thr Gly Ala Ala GlyGly Ala GlyCys Thr Gly Gly Thr115120125Ala Thr Cys Thr Thr Gly Thr ThrGly Ala CysAla Ala Gly Ala Thr130135140Thr Thr Gly Cys Cys Thr Cys ThrGly Cys Ala145150 155〈210>6〈211>516〈212>DNA〈213〉人體〈400>6￡ltgg￡lgg￡lgtacgcgcgaga gccttgcccatggcgaattgtggatgactgtggtggggcc60tttacgatgggtaccattgg tggtggtatctttcaagcaatcaaaggttttcgcaattct120ccagtgggagte朋ccac3g 3ctecgaggg3gtttg3C3gcagggctcca180C￡lgtt￡lgg￡lggtagctttgc agtttggggagggctgttttccatgattgactgtegtatg240gttcaagtcagaggaaagga agatccctggaactccatcacaagtggtgcctteacggga300gccatactggC3gC33g朋3 tgg3CC3gtggccatggttgggtcagccgcaatgggtggc360attctcctagctttaattga aggagctggtatcttgttgacaagatttgcctctgcacag420tttcccaatggtcctcagtt tgcagaagacccctcccagttgccttcaactcagttacct480tcctcaccttttggagacte tcgac朋tet51權利要求
一種人腫瘤標誌物Tim17多肽，其特徵在於，該多肽包含SEQ ID NO1的胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性多肽、或其活性衍生物；其編碼核酸具有SEQ ID NO5的序列。
2. —種Timl7蛋白，其特徵在於，該蛋白具有SEQ ID NO :2的胺基酸序列。
3. —種分離的多核苷酸，其特徵在於，所述的多核苷酸具有SEQ ID N0:4的序列，其編碼權利要求2的蛋白。
4. 一種DNA，其特徵在於，具有SEQ ID NO :6的結構，其編碼權利要求1的RNA及多肽。
5. —種化合物，其特徵在於，該化合物為拮抗人Timl7活性拮抗劑，它含有權利要求1的人Timl7編碼序列或其片斷的小分子幹擾RNA。
6. —種藥物組合物，其特徵在於，它含有安全有效量的權利要求5的化合物及藥學上可接受的載體。
7. —種能與權利要求1或權利要求2所述的Timl7蛋白特異性結合的抗體。
8. —種檢測樣品中Timl7的方法，其特徵在於，它包括抽提組織中的RNA，反轉錄成cDNA，用SEQ ID NO :3的引物序列定量PCR擴增；或，抽提組織中的蛋白質，用特異抗體進行免疫印記反應，檢測蛋白質水平；或，對石蠟包埋的組織，用特異抗體進行免疫組化試驗。
9. 權利要求l的Timl7多肽及其編碼序列在製備檢測腫瘤標誌物或腫瘤治療靶標中的用途。
10. 權利要求2的蛋白及其編碼序列在製備檢測腫瘤標誌物或腫瘤治療靶標中的用途。
11. 按權利要求9或10的用途，其中所述的腫瘤是乳腺癌、肺癌、肝癌、腸癌、膀胱癌、前列腺癌或淋巴癌。
12. 按權利要求9或10的用途，其中所述的腫瘤是乳腺癌。
全文摘要
本發明屬生物技術和醫學領域，涉及新的人腫瘤標誌物-Tim17多肽，編碼Tim17的多核苷酸序列和經重組技術產生該蛋白的方法。本發明還涉及Tim17蛋白及其編碼序列的用途，以及含Tim17蛋白拮抗劑的藥物組合物。經實驗顯示，所述的Tim17多肽及其編碼序列及該基因的表達產物，在正常細胞和組織中幾乎檢測不到，在腫瘤細胞和組織中卻有很高的表達，並且表達量與腫瘤的級別，分化程度以及預後均呈明顯正相關。結果表明Tim17為一特異的腫瘤標誌物。能作為乳腺癌、肺癌、肝癌、腸癌、膀胱癌、前列腺癌或淋巴癌的預防和早期檢測的標誌物或腫瘤治療的靶標。
文檔編號A61K48/00GK101768214SQ200910174168
公開日2010年7月7日 申請日期2009年9月29日 優先權日2008年10月6日
發明者喬萌, 張揚, 徐曉恩, 施前 申請人:復旦大學