一種生產具有雌核發育特徵扇貝和快速建立扇貝純系的方法
2023-06-15 00:03:51
專利名稱：一種生產具有雌核發育特徵扇貝和快速建立扇貝純系的方法
技術領域：
本發明涉及貝類制種技術，具體涉及一種生產有雌核發育特徵扇貝和快速建立扇貝純系的方法。
背景技術：
雌核發育在貝類育種中有著廣泛的應用前景，首先能快速獲得貝類純系，人工雌核發育的遺傳基礎主要來自母本，因此其後裔具有很高的純合性，經過幾次雌核發育，其子代就可以作為純系用於育種和雜交種的生產。在組合育種時，由於後代不斷分離，要獲得一個穩定的品種常需時間很長，利用雜種子一代或雜種子二代進行雌核發育，只需二、三代就可獲得穩定的品系，大大減少了育種的時間。並且具有雌核發育特點的貝類對研究生物的遺傳結構分析，基因定位，遺傳圖譜的構建，功能基因克隆，以及開展貝類性別的遺傳控制和基礎遺傳學研究等等都有非常重要的意義。
一般的魚類、兩棲類和貝類人工雌核發育是用γ射線、x射線或紫外線照射精子，破壞精子的遺傳物質，用這樣的精子使卵子受精，使進入卵子的精子遺傳失活，卵在人工條件如理化刺激下等條件下得以雌核發育成二倍體個體。由於使精子染色體失活的處理，往往會導致基因突變並出現胚胎早期的死亡和後代的存活率低現象。用這些方法生產具有雌核發育特點的貝類不能滿足貝類的遺傳學研究以及貝類育種和生產需要，並且目前研究中未見成功培育出具有雌核發育特點二倍體成體扇貝的報導。
發明內容
本發明的目的是提供快速大量生產具有雌核發育特點扇貝的一種方法，以滿足貝類的遺傳學研究以及貝類育種和生產需要。
本發明的方法是在人工養殖條件下，選取個體健康，性腺發育成熟的不同物種的扇貝如櫛孔扇貝、華貴櫛孔扇貝、海灣扇貝、蝦夷扇貝等，首先調整不同種雌雄親本扇貝的成熟周期，使其同步成熟用於雜交，再通過陰乾刺激親貝產生精子和卵子，迅速將異種之間的精卵分別受精，可得到3％-20％的具有雌核發育特點的幼蟲個體，在22℃-23℃養殖條件下培養幼蟲，當子代培育至殼高2-3cm後即可進行染色體分析和基因位點的純合度分析，再通過流式細胞儀進行染色體活體篩選，選擇染色體核型分析結果中具有38條染色體的生長正常的稚貝，並進一步通過10個微衛星(SSR)位點(如表1)檢測技術和AFLP基因的多態性分析檢測扇貝純合度，驗證得到90％-100％的具有雌核發育特點的扇貝。作為生產具有雌核發育特徵扇貝的方法的應用是快速大量生產扇貝純系。
本方法具有簡單、快速和高效的特點，雜交後代中具有雌核發育特點的子代個體數量多，便於進一步進行育種和遺傳學研究。本發明獲得的純系的方法會縮短扇貝育種的時間，方便扇貝的遺傳學研究，對於快速選育生長優勢和抗逆品種具有重要意義。
具體實施例方式
本發明的方法是先選取個體健康，性腺發育成熟的不同物種的扇貝，例如，櫛孔扇貝、華貴櫛孔扇貝、海灣扇貝或蝦夷扇貝等，調整不同種雌雄親本扇貝的成熟周期，使其同步成熟用於雜交，親貝雜交前在14℃-18℃的暫養，管理條件同一般扇貝育種。在雜交前選擇生長良好，性腺發育同步的不同品種的扇貝個體，經陰乾刺激半小時後分別放入不同的乾淨的養殖容器中，注意防止其他貝類的精子、卵子或受精卵混入，控制海水溫度17℃-20℃，使雌雄親貝分別產生卵子或精子，然後迅速將不同種的精子和卵子分別混合受精，受精後將卵子表面多餘的精子洗去，水溫18℃-20℃條件下孵化受精卵，22℃-23℃培養孵化後的扇貝幼蟲。此時可得到3％-20％具有雌核發育特點的雜交扇貝幼蟲，並從中篩選出具有雌核發育特點的個體。
不同的扇貝種間雜交、同種間的正交和反交，以及不同的環境條件和人工操作會對雜交子代中具有雌核發育特點的個體比例有影響。從不同品種扇貝雜交後代的幼蟲中篩選出具有雌核發育特點的個體的方法當扇貝雜交子代生長到殼高2-3cm時，進行扇貝遺傳純度分析，活體取少量扇貝鰓絲進行染色體核形分析通過流式細胞儀進行染色體活體篩選進行核型分析，選擇具有38條染色體的生長正常的成貝，並進一步進行櫛孔扇貝的10個微衛星(SSR)位點(位點引物序列見表1)的基因純合度分析，和AFLP基因的多態性分析發現最終可得到90％-100％具有雌核發育特點的扇貝。
對扇貝不同物種間雜交，生產具有雌核發育特點的子代個體後，可以快速建立扇貝純系，其方法是通過對不同扇貝物種A♀和物種B♂雜交後代篩選，培育具有雌核發育特點的子代個體A1，A1成熟後進一步以A1♀與物種B♂進行雜交，得到同源染色體更加純合的A2群體；進一步以A2♀與A2♂進行交配繁育，其子代即可建成純系或近等位基因系。也可使A2♀與B♂進一步雜交，產生同源染色體更加純合的A3，以A3♀與A3♂進行交配繁育得到其子代，即建成純系或近等位基因系。
步驟1♀A x ♂BA1步驟2♀A1 x ♂BA2步驟3(可進一步進行雜交)♀A2 x ♂BA3生產純系 ♀A2 x ♂A2→A2 或 ♀A3 x ♂A3→A3實施例1在人工控制條件下，以雌性櫛孔扇貝和雄性的華貴扇貝雜交，後代中產生了18％具有雌核發育特點的子代幼體，這些子代幼體中30％～70％能正常生長，通過流式細胞儀進行染色體活體篩選，選取具有38對染色體的個體進行培養。這些具有38對染色體的扇貝進一步養大2～3cm以上後，通過10對微衛星SSR檢測，發現100％子代扇貝具有雌核發育特點；再用雜交產生的具有雌核發育特點的扇貝雌貝進一步與華貴扇貝進行雜交，對其雜交子代通過流式細胞儀進行染色體活體篩選，選取具有38對染色體的個體進行培養，當養至2～3cm以上後通過10對微衛星SSR檢測位點純合情況發現，雜交後扇貝的等位基因純和程度更高，再將這些扇貝養殖到性成熟後，雌雄個體進行雜交，其子代既為櫛孔扇貝純系。
在人工控制條件下，以雌性櫛孔扇貝和雄性的蝦夷扇貝雜交，在後代中產生了20％具有雌核發育特點的子代幼體，這些子代幼體中40％～80％能正常生長，通過流式細胞儀進行染色體活體篩選，選取具有38對染色體的個體進行培養。這些具有38對染色體的扇貝進一步養大2～3cm以上後通過10對微衛星SSR檢測，發現100％子代扇貝具有雌核發育特點；再用雜交產生的具有雌核發育特點的扇貝雌貝進一步與蝦夷扇貝進行雜交，對其雜交子代通過流式細胞儀進行染色體活體篩選，選取具有38對染色體的個體進行培養，當養至2～3cm以上後通過10對微衛星SSR檢測位點純合情況發現，雜交後扇貝的等位基因純和程度更高，再將這些扇貝養殖到性成熟後，雌雄個體進行雜交，其子代既為櫛孔扇貝純系。
實施例2在人工控制條件下，以雌性櫛孔扇貝和雄性的蝦夷扇貝雜交，在後代中產生了20％具有雌核發育特點的子代幼體，這些子代幼體中40％～80％能正常生長，通過流式細胞儀進行染色體活體篩選，選取具有38對染色體的個體進行培養。這些具有38對染色體的扇貝進一步養大2～3cm以上後通過10對微衛星SSR檢測，發現100％子代扇貝具有雌核發育特點；再用雜交產生的具有雌核發育特點的扇貝雌貝進一步與蝦夷扇貝進行雜交，對其雜交子代通過流式細胞儀進行染色體活體篩選，選取具有38對染色體的個體進行培養，當養至2～3cm以上後通過10對微衛星SSR檢測位點純合情況發現，雜交後扇貝的等位基因純和程度更高，再將這些扇貝養殖到性成熟後，雌雄個體進行雜交，其子代既為櫛孔扇貝純系。
表1 用於櫛孔扇貝種質資源分析的標準微衛星標記
權利要求
1一種生產具有雌核發育特徵扇貝的方法，其特徵是在人工養殖條件下，選取個體健康，性腺發育成熟的不同物種的扇貝，首先調整不同種雌雄親本扇貝的成熟周期，使其同步成熟用於雜交，再通過陰乾刺激親貝產生精子和卵子，迅速將異種之間的精卵分別受精，得到3％-20％的具有雌核發育特點的幼蟲個體，在22℃-23℃養殖條件下培養幼蟲，當子代培育至殼高2-3cm後即可進行染色體分析和基因位點的純合度分析，再通過流式細胞儀進行染色體活體篩選，選擇染色體核型分析結果中具有38條染色體的生長正常的稚貝，並進一步通過10個微衛星位點檢測技術和AFLP基因的多態性分析檢測扇貝純合度，驗證得到90％-100％的具有雌核發育特點的扇貝。
2一種生產具有雌核發育特徵扇貝的方法，其特徵在於作為生產具有雌核發育特徵扇貝的方法的應用是快速大量生產扇貝純系。
3一種快速建立扇貝純系的方法，其特徵是用不同扇貝物種進行雜交，獲得具有雌核發育特點的子代個體來獲得純系，即通過對不同扇貝物種A♀和物種B♂雜交後代篩選，培育具有雌核發育特點的子代個體A1，A1成熟後進一步以A1♀與物種B♂進行雜交，得到同源染色體更加純合的A2群體；進一步以A2♀與A2♂進行交配繁育，其子代即可建成純系或近等位基因系。
4如權利要求2所述的一種快速建立扇貝純系的方法，其特徵是使A2♀與B♂進一步雜交，產生同源染色體更加純合的A3，以A3♀與A3♂進行交配繁育得到其子代，即建成純系或近等位基因系。
5如權利要求1所述的一種生產具有雌核發育特徵扇貝的方法，其特徵是上述不同物種的扇貝是櫛孔扇貝、華貴櫛孔扇貝、海灣扇貝、蝦夷扇貝。
全文摘要
一種生產具有雌核發育特徵扇貝和快速建立扇貝純系的方法。選取個體健康，性腺發育成熟的不同物種的扇貝，調整雌雄親本扇貝的成熟周期，使其同步成熟，再通過陰乾刺激親貝產生精子和卵子，將異種精卵受精，得到3％－20％的具有雌核發育特點的幼蟲，子代培育至殼高2－3cm後通過流式細胞儀進行染色體活體篩選38條染色體的生長正常的稚貝，驗證得到90％－100％的具有雌核發育特點的扇貝。作為本方法的應用可快速大量生產扇貝純系。本方法具有快速、高效生產具有雌核發育特點的扇貝，並大大縮短獲得純系扇貝育種時間，方便扇貝的遺傳學研究，對於快速選育生長優勢和抗逆品種具有重要意義。
文檔編號A61D19/00GK1895036SQ20061007694
公開日2007年1月17日 申請日期2006年4月11日 優先權日2005年10月9日
發明者包振民, 陳剛, 胡景傑, 汪小龍, 潘傑 申請人:中國海洋大學