一種用於鑑別診斷非典型肺炎病原體的懸浮點陣系統的製作方法
2023-06-15 03:03:36
專利名稱：一種用於鑑別診斷非典型肺炎病原體的懸浮點陣系統的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫學和生物學檢測領域，具體而言，本發明涉及一套包括嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒(Severe acute respritory syndrome-associatedcoronavirus，簡稱SARS-CoV或SARS冠狀病毒)在內的非典型肺炎病原體快速檢測螢光微球，可以用於檢測和/或鑑別診斷髮燒人群、非典型肺炎疑似病例以及非典型肺炎臨床診斷病例的病原體，包括非嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒感染的排查、嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒感染的確診以及急性呼吸道病原體合併感染的診斷。本發明還涉及該鑑別診斷系統的製作、測定和計算機軟體分析處理系統。
背景技術：
嚴重急性呼吸道症候群(Severe Acute Respiratory Syndrome，簡稱SARS(薩斯)，即非典型肺炎)是一種新型冠狀病毒所致的急性呼吸系統傳染病，其發病機制尚未明確，病情進展迅速，具有較高的死亡率，已成為世界範圍內對人類健康的一種威脅。目前在SARS疾病控制方面，主要是要控制該病的傳播和治療患者。早期隔離、早期治療可以減少疾病的傳播並降低病死率，因此準確的診斷和正確的治療是關鍵；特別是在診斷方面，缺少針對SARS冠狀病毒以及其它急性呼吸道感染的常見病原體檢測方法。目前已有的針對SARS冠狀病毒的檢測方法主要有酶聯免疫反應方法(ELISA)和基因診斷方法。ELISA方法是通過檢測病人血清中的特異抗體含量來判斷該病人是否受到SARS病毒感染。眾所周知，血清中出現免疫球蛋白G(IgG)的時間約在感染後10天以上，免疫球蛋白M(IgM)也在感染後約一周才可能出現，因此，ELISA方法不能在感染早期作為有效的SARS病毒感染的檢測方法；而且ELISA方法的敏感度和特異性均不夠理想。目前已有的基因診斷方法大多採用單純液相反應體系(如實時螢光PCR(聚合酶鏈反應))或單純固相反應體系(如基因晶片)，均存在靈敏度不夠高、檢測樣本所需量較大等缺點。本發明鑑別診斷系統採用特異性寡核苷酸探針偶聯的螢光微球，雜交反應在固-液相之間進行，不但克服了已有基因診斷方法的上述缺點，而且利用螢光微球具有高載量和高通量的特點，可以在檢測SARS病原體的同時，檢測其它若干種嚴重急性呼吸道感染病原體，以便在發燒早期進行非SARS冠狀病毒感染患者的排查、SARS冠狀病毒感染的確診以及急性呼吸道病原體合併感染的診斷，從而可以減少交叉感染以及制訂適宜的治療方案。
發明目的因此，本發明的目的是提供一套用於非典型肺炎病原體特異性檢測螢光微球對發燒患者、非典型肺炎疑似病例和臨床診斷病例進行病原體檢測的試劑及其分析處理系統。
發明內容
本發明的上述目的是通過下列技術方案實施的一種用於檢測人類常見急性呼吸道感染病原微生物的非典型肺炎病原體懸浮點陣鑑別診斷系統，其特徵在於它由質量控制樣品、生物素標記的特異性核酸擴增引物、非典型肺炎病原體特異性寡核苷酸探針偶聯的螢光微球和輔助試劑組成的檢測試劑盒及其計算機分析處理系統。
本發明鑑別診斷系統的製作方法包括陽性和陰性質控品的製備、生物素標記的特異性核酸擴增引物的製備、非典型肺炎病原體特異性寡核苷酸探針偶聯螢光微球的製備及輔助試劑的配製；以及線性判別函數公式的建立、分析方程的編制和資料庫的建立。
本發明鑑別診斷系統可以診斷和/或鑑別診斷的非典型肺炎病原體包括屬於正粘液病毒屬的5種甲流感病毒(包括H1N2、H1N1、H2N2、H3N2、H5N1共5種亞型)、2種乙流感病毒(包括乙型流感病毒、乙流感病毒2兩種亞型)；屬於副粘液病毒屬的腺病毒、腸道病毒、副流感病毒1型、副流感病毒3型、2種呼吸道合胞體病毒(A型和B型)、人偏肺病毒(HMPV)和SARS冠狀病毒；以及其它病原體有肺炎支原體、肺炎衣原體、嗜肺軍團桿菌，共18種。
本發明鑑別診斷系統中的陽性質控品的製備是通過人工合成具有以下特點的SARS冠狀病毒和其它病原體檢測靶位點，並在片段5』端加上了核糖核酸(RNA)合成酶T7，在3』端加SP6。合成這些基因片段的目的是用來做為體外轉錄的模板合成RNA，以此當作陽性質控品來檢驗整個檢測體系的敏感性和特異性。這些構建的基因片段與從野生型的病原體基因組中擴增出的靶片段完全相同，因此可能會因為實驗室內部汙染而導致假陽性的發生。為了防止由於汙染造成的假陽性，構建時在SARS模板與微球雜交的位置加入了一段20個鹼基的「突變」片段，它與野生型的相應片段的CG含量和長度都相等。得到的這個突變型模板與野生型基因片段的大小、擴增引物等特徵都相同，唯一不同的就是片段中間的檢測探針雜交序列，這個序列不會與不同顏色的野生型微球雜交，所以不會因此而造成假陽性。
(一)、下面以合成突變型的SARS1靶序列為例，說明陽性質控品的設計方法A、流程見附圖1B、野生型和「突變型」SARS1靶序列的區別a)野生型SARS1靶序列設計如下序列中劃曲線的是聚合酶鏈反應(PCR)引物、劃實線的是與微球顆粒上的檢測雜交探針互補的寡苷核酸。
ttcgtgcgtggattggctttgatg agagatgctgtgggtactaacctacc b)「突變型」SARS1靶序列設計如下。它與野生型靶序列的唯一差別就是中間的二十個鹼基與檢測探針雜交的序列不同gaagctattcgtcacgttcgtgcgtggattggctttgatgTGCATGGTGCAACAATCGTGagagatgctgtgggtactaacctacctctccagctaggattttctacagC、「突變型」靶序列(即陽性質控品)的製備a)首先合成「野生型」靶序列；b)把合成好的「野生型」靶序列從凝膠中回收出來單獨擴增形成野生型的陽性質控品基因片段；c)以構建好的「野生型」陽性質控品基因片段為模板，用特別設計的PCR引物(SARSm-1和SARS1-5)來合成「突變型」陽性質控品的3』末端；用特別設計的PCR引物(SARSm-2和SARS1-1)來合成「突變型」陽性質控品的5』末端。「突變型」陽性質控品的結構見附圖2。
D、PCR擴增a)經過電泳並凝膠回收純化後再把SARSm-1，SARS1-5的產物和SARSm-2，SARS1-1的產物放到一起相互延伸，並加SARS1-1和SARS1-5為PCR引物來合成最終的特殊基因片段，即脫氧核糖核酸(DNA)片斷。利用該「特殊基因片斷」作為體外轉錄的模板，分別用T7和SP6 RNA合成酶試劑盒(Ambion，USA)合成RNA模板；b)將這些體外轉錄出來的RNA模板經DNA酶(DNAse)作用去除模板DNA後稀釋1000倍分裝；冰凍保存，即為陽性質控品。使用時不與病人標本混合而獨立在另一個試管裡進行RNA提取和反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)，或僅做RT-PCR的模板。
(二)、以SARS冠狀病毒為例，18種非典型肺炎病原體診斷和/或鑑別診斷陽性和陰性質控品的具體製備方法操作步驟如下A)、陽性質控品的製備(1)野生型模板的製備a)將(一)、C、c)所述PCR引物SARS1-5按順序編號為引物1、2、3、4、5，在擴增儀上進行第一次引物延伸反應，引物為1、2和3、4，延伸反應的程序為94℃1分鐘，55℃ 30秒，72℃ 15秒，共30個循環，然後在72℃ 3分鐘進行最後的延伸反應；通過電泳凝膠純化第一次引物延伸的反應產物；b)在擴增儀上進行第二次引物延伸反應，引物為1和5，以及引物1、2和引物產物3、4，延伸反應的程序為94℃ 1分鐘，55℃ 30秒，72℃ 15秒，共30個循環；然後在72℃ 3分鐘進行最後的延伸反應，通過電泳凝膠純化第二次引物延伸的反應產物；c)將純化好的產物用純水進行1∶1000倍稀釋，用於擴增野生型模板反應的模板，具體步驟包括在擴增儀上再次進行引物延伸反應，延伸反應的程序為95℃ 15分鐘；94℃ 1分鐘，55℃ 30秒，72℃ 15秒，共30個循環；然後在72℃ 3分鐘進行最後的延伸反應，最後進行野生型模板擴增產物的純化；d)擴增產物的純化上述所有擴增產物的純化試劑可選用不同廠家的純化試劑盒。本發明中選用的擴增產物純化試劑盒為Qiagen公司的Qiaex II Agarose GelExtraction kit(Cat#20021)。
(2)突變型模板的製備步驟同(1)。
B)、陰性質控品的製備(1)製備本發明鑑別診斷系統中的SARS陰性對照樣品採用構建陽性質控品類似的方法，帶有20個突變鹼基的陰性質控品靶序列如下gaacaacagactactagagattaccaggCGTTGTAAGGTTAGTATAGAcgtaactacacctgtaagtacttatatgttaactaatagtgaattattatcattaatcaatgatatgcctataaca(2)使用把用SP6 RNA合成酶體外轉錄合成了的這段無關RNA模板放在核酸提取液的RNA-sol裡(含苯酚和抑制RNAse的鹽)做為陰性質控品。這樣在從病人標本(標本來源包括血、尿、鼻咽拭子、糞便等)裡提取RNA時，每個病人標本裡都含有大約500-1000個拷貝的陰性對照模板RNA。陰性對照模板在RNA-Solv裡面很穩定。
(三)特異性擴增引物的製備本發明鑑別診斷系統中的生物素標記的特異性擴增引物是以寡核苷酸為原料，通過核酸合成儀製備的，核酸合成儀可選用不同廠家、不同型號的產品，寡核苷酸的購買及核酸片段的合成也可以委託相關的基因公司來完成。本發明中的特異性擴增引物是委託MWG公司(美國)用DNA合成儀合成的。SARS-Cov和其餘若干種急性呼吸道感染病原體的核酸特異性擴增引物的序列及其基本特性如下，本發明為SARS冠狀病毒設計了三對引物，其餘病毒各設計了一對引物。
注F、R分別表示一對引物中的5』末端引物和3』末端引物；A、C、G、T分別表示一種寡核苷酸，其中A表示腺苷，C表示胞苷，G表示脫氧鳥苷，T表示脫氧胸苷。
(四)特異性探針偶聯的螢光微球
本發明鑑別診斷系統中的非典型肺炎病原體特異性寡核苷酸探針偶聯的螢光微球的製作材料可選用不同的高分子材料(如聚苯乙烯，聚氯乙烯，殼聚糖等)，本發明採用螢光素載量不同的聚苯乙烯微球作為探針載體，通過與18種非典型肺炎病原體特異性寡核苷酸探針進行化學偶聯而製作，其中與聚苯乙烯螢光微球進行共價偶聯的寡核苷酸探針在合成過程中需要在5′端進行氨基化修飾。本發明鑑別診斷系統中所採用的聚苯乙烯螢光微球可選用國內外不同公司的產品，本發明中選用Luminex公司產品。一套非典型肺炎病原體特異性寡核苷酸探針偶聯的螢光檢測特異性寡核苷酸探針序列及其製作步驟如下A)非典型肺炎病原體特異性5』末端氨基化寡核苷酸探針序列如下
注「D」表示檢測探針；Amine表示氨基；A、C、G、T分別表示一種寡核苷酸，其中A表示腺苷，C表示胞苷，G表示脫氧鳥苷，T表示脫氧胸苷。
B)寡核苷酸探針與聚苯乙烯螢光微球的偶聯
進行偶聯的微球的濃度可以自由選擇。本發明中經比較在三種不同條件下(2500beads/反應；5000beads/反應；10000beads/反應)對檢測非典型肺炎病原體靈敏度影響的實驗數據表明反應體系中偶聯微球濃度在2500-5000/50μl時，螢光讀數與偶聯微球濃度呈線性相關；當反應體系中偶聯微球濃度在5000-10000/50μl時，螢光讀數與偶聯微球濃度無關。因此選擇探針雜交檢測體系偶聯微球濃度為5000beads/50μl；確定每交聯1×106個乳膠顆粒所使用的交聯探針量為0.75nmol(交聯反應體積為50ul)。
C)以SARS冠狀病毒病原體為例說明螢光檢測微球製作工藝流程(1)用超聲波儀打散聚苯乙烯螢光微球，並將容器震蕩20秒，(2)從貯存管中將1×107螢光微球分到1.5毫升的微量離心管中；用10,000×g離心1分鐘，去上清，注意不要觸動沉澱；(3)加入1.5M 2-(N-嗎啡基)乙磺酸(pH4.5)，震蕩並用超聲波分散，加入0.75nmol的氨基化的寡核苷酸(即0.75μl的1mM溶液)，瞬時震蕩；(4)僅在使用前，加1.0毫升的無菌水到10mg的1-乙基-(3-二甲基-丙烷)氫氯化二醯亞胺中，加2.5ml的新鮮1-乙基-(3-二甲基-丙烷)氫氯化二醯亞胺溶液到微球中，瞬時震蕩。避光室溫孵育30分鐘；(5)用新鮮的1-乙基-(3-二甲基-丙烷)氫氯化二醯亞胺重複步驟上述步驟；(6)加1.0毫升的吐溫-20(0.02％w/v)，震蕩，用10,000×g離心微球1分鐘，去上清，注意不要觸動沉澱；(7)加1.0毫升的十二烷基硫酸鈉(0.1％w/v)。震蕩，用10,000×g離心微球1分鐘，去上清，注意不要觸動沉澱；(8)用100毫升的0.1M 2-(N-嗎啡基)乙磺酸(pH4.5)懸浮微球，將製備的微球計數，在2-8℃避光保存備用。
(五)本發明鑑別診斷系統中的輔助試劑包括(1)螢光素標記的鏈黴親和素；螢光素可選用各種不同種類的螢光素，如異硫氰酸螢光素(FITC)、四甲基異硫氰酸羅達明(TMRITC)、若丹明、藻紅蛋白等，可從有關公司購買。本發明中使用的藻紅蛋白標記的鏈黴親和素購自Sigma公司。
(2)核酸提取試劑，可從相關公司購買，本發明中採用的核酸提取試劑為OmegaBiotek公司產品(3)一步法逆轉錄核酸擴增試劑、PCR產物純化試劑和懸浮點陣雜交檢測試劑，均可從相關公司購買。本發明中採用的一步法逆轉錄核酸擴增試劑、PCR產物純化試劑和懸浮點陣雜交檢測試劑均為Qiagen公司產品。
(六)本發明鑑別診斷系統中的計算機分析處理系統是根據懸浮點降檢測病原體獲得的數據，並將一定數量的三類臨床病例(即發燒患者、非典型肺炎疑似病例以及臨床診斷病例)進行分組，經過多元逐步回歸進行逐步判別的方法建立的三個線性判別函數方程構建的1、在顯著差異為0.05水平下的判別(1)分組類別 例數％ 概率確診 29 0.1746990.333333疑似 96 0.5783130.333333發燒 41 0.2469880.333333(2)由此建立的三個線性函數方程的係數表如下確診 疑似 發燒常數項CONSTANT -37.40594 -37.73991-42.94648病毒名稱肺炎衣原體(CPN) 0.88590-0.24935 -0.52834腸道病毒(ENTV) 2.24790-0.12706 -0.71957甲流感病毒(H5N1) 8.460585.98128 -0.34751甲流感病毒(INFA) 2.293884.02736 12.05741乙流感病毒2型(INFB2) 3.618243.15499 17.76646副流感病毒1型(PIV1) 14.37190 17.06734 15.25512副流感病毒3型(PIV3) 18.09694 19.93511 12.47616呼吸道合胞病毒B型(RSVB) 5.340516.91617 -1.70636冠狀病毒(SARS1) -1.31425 -0.60170 -2.15653冠狀病毒(SARS3) 8.782129.78919 16.22203(3)臨床診斷分類與判別函數分類的比較判別函數分類臨床診斷分類確診 疑似 發燒 合計確診22 7 0 29
％ 75.8624.140.00100.00疑似982 5 96％ 9.38 85.425.21100.00發燒0140 41％ 0.00 2.44 97.56 100.00合計31 90 45 166％ 18.6754.2227.11 100.00從上表可以看出確診的正確判別率為75.86％，疑似的正確判別率為85.42％，發燒的正確率判別為97.56％。總的判斷正確率為86.75％(錯判率為13.25％)。
(4)三個線性函數方程式如下Y診斷＝-37.40594+0.88590cpn+2.2490entv+8.46058h5n1+2.29388infa+3.61824infb2+14.3719piv1+18.09694piv3+5.34051rsvb-1.31425sars1+8.78212sars3Y疑似＝-37.73991-0.88590cpn-0.12706entv+5.98128h5n1+4.02736infa+3.15499infb2+17.06734piv1+19.93511piv3+6.91617rsvb-0.60170sars1+9.78919sars3Y發燒＝-42.94648-0.52834cpn-0.71957entv-0.34751h5n1+12.05741infa+17.76646infb2+15.25512piv1+12.47646piv3-1.706361rsvb-2.15653sars1+16.22203sars3注cpn，肺炎衣原體；entv，腸道病毒；h5n1，甲流感病毒；infa，甲流感病毒；infb2，乙流感病毒2型；piv1，副流感病毒1型；piv3，副流感病毒3型；rsvb，呼吸道合胞病毒；sars1，冠狀病毒；sars3，冠狀病毒2、在顯著性差異為0.01水平下的判別(1)分組與步驟1、(1)相同。
(2)建立的三個線性函數方程的係數表如下確診 疑似 發燒常數項 CONSTANT -29.84871-27.95731-33.41170乙流感病毒2型(INFB2) 6.27513 6.05405 20.72240肺炎衣原體(CPN) 1.48372 0.37915 0.48398甲流感病毒(H5N1) 11.18852 8.75797 3.16586副流感病毒3型(PIV3) 19.62581 21.76331 15.29176呼吸道合胞病毒B型(RSVB) 6.74481 8.94035 1.63531冠狀病毒(SRS3) 6.85826 7.55123 14.09893
(3)臨床診斷分類與判別函數分類的比較判別函數分類臨床診斷分類 確診 疑似 發燒合計確診 20 8 1 29％ 68.97 27.59 3.45100.00疑似 10 815 96％ 10.42 84.38 5.21100.00發燒 0 4 37 41％ 0.00 9.76 90.24 100.00合計 30 9343 166％ 18.07 56.02 25.90 100.00從上表可以看出確診的正確率為68.97％，疑似的正確率為84.38％，發燒的正確率為90.24％。總的判斷正確率為83.13％(錯判率為16.87％)。
(4)三個線性函數方程如下Y診斷＝-29.84871+1.48372cpn+11.18852h5n1+6.27513infb2+19.62581piv3+6.74481rsvb+6.85826sars3Y疑似＝-27.95731+0.37915cpn+8.75797h5n1+6.05405infb2+21.76331piv3+8.94035rsvb+7.55123sars3Y發燒＝-33.41170+0.48398cpn+3.16586h5n1+20.72240infb2+15.29176piv3+1.63531rsvb+14.09893sars3注所有英文縮寫名詞的含義同(六)、1、(4)的註解。
3、對計算機分析處理系統的評價本發明鑑定診斷系統的分析處理系統的建立採用多因素逐步回歸方法。統計學上一般認為多因素分析的總判斷正確率達到80％時，即認為判別效率良好。本發明建立的分析判斷模型在顯著性差異為0.05和0.01水平時，總判斷正確率分別達到86.75％和83.13％，說明使用該分析方法進行檢測數據分析的統計效果良好。
(七)本發明鑑別診斷系統的檢測方法，其特徵在於它依次按下述步驟進行1、一步法逆轉錄核酸擴增a)按照下表準備PCR反應體系
注5×，代表五倍濃縮液；1×，代表工作液；RNase-free，代表不含RNA酶。
b)按如下步驟編程進行PCR循環i. 反轉錄50℃ 30分鐘ii. 起始PCR 95℃ 15分鐘iii. 三步循環 94℃ 30秒i.55℃ 15秒ii. 72℃ 15秒iii. 共進行30個循環(據具體情況可提高到40個循環)iv. 終延伸72℃ 3分鐘2、以SARS病原體為例說明非典型肺炎病原體的懸浮點陣系統檢測操作步驟a)按照下表準備反應體系10.5ul 1×TE，PH8.05.0ul 純化的RT-PCR樣品1.5ul SARS系列偶聯微球33.0ul 1.5×TAMC50ul總體積注TE，Tris-EDTA緩衝液；TAMC，四甲基氯化銨緩衝液。
b)操作步驟將樣品放置98℃中5分鐘變性，然後立即將變性的樣品置於52℃中雜交15分鐘；在樣品孵育過程中，按1∶250稀釋配製新鮮的鏈黴抗生物素-R-藻紅素(SA-PE)，即加3ul SA-PE儲存液(1mg/ml)到750ul 1×TMAC；孵育完成後，以最大轉速離心2分鐘沉澱螢光檢測微球，去除上清夜，保存沉澱的微球；每管加入75μl 1∶250的SA-PE液體，旋渦震蕩使微珠重新懸浮，52℃孵育5分鐘；最後在檢測儀上對螢光標記微球進行計數。
3、螢光標記微球計數螢光標記微球的計數由檢測儀完成，檢測儀可以採用不同廠家生產的各種螢光微球計數儀或流式細胞計數儀。本發明中採用的螢光微球計數儀是型號為Luminex100的懸浮點陣分析計數儀(Luminex公司產品)。
4、結果計算a)根據已經建立的三個線性判別函數方程編制計算機分析處理系統；b)每個個體進行判別時，把檢測的各變量值代入判別函數，得出判別分數；c)從哪一個線性函數方程得出的判別分數高，即可以判定該個體屬於哪一類臨床分組。
與其它SARS冠狀病毒檢測指標和技術相比較，本發明鑑別診斷系統具有以下優點a)與已有的SARS冠狀病毒檢測指標相比較，本發明鑑別診斷系統的檢測指標是SARS病毒特異性基因片斷，克服了SARS病毒特異性抗體在感染後7-10天才可能從血液中檢出、不適宜作為早期檢測SARS病毒感染指標的缺點。SARS病毒特異性抗體(IgM或IgG)的已有檢測方法為酶聯免疫反應方法(ElISA)，本發明所採用的病毒基因懸浮點陣螢光微球方法克服了ElISA方法所具有的敏感度不夠高、特異性不夠強的缺點。
b)與已有的SARS病毒基因檢測方法相比較，本發明鑑別診斷系統採用了3個SARS冠狀病毒基因探針同時檢測的設計，克服了已有的SARS病毒基因診斷方法一般只有一個基因探針的缺點，提高了檢測的特異性，降低了假陰性。
c)本發明鑑別診斷系統的基因雜交反應是在固-液相之間進行的，由於聚苯乙烯微球表面的羧基基團十分豐富(球面效應)，使得其結合的檢測探針十分充足，因此雜交所需時間短暫、快速。與已有的的基因檢測方法(如基因晶片技術是單純的固相反應，實時螢光PCR技術是單純的液相反應)相比較，本發明鑑別診斷系統具有更高的敏感度和檢測效率。
d)本發明鑑別診斷系統採用了螢光載量不同的聚苯乙烯微球，利用微球表面豐富的羧基團與18種病原體特異的氨基化寡核苷酸探針進行共價偶聯，從而實現了包括SARS病毒在內的18種急性呼吸道感染病原體的基因檢測可在同一試管中同時檢測的目的，與已有的SARS病毒基因檢測方法相比，具有非常明顯的操作簡便、快速有效、高通量的優點，克服了已有的SARS病毒基因檢測方法只針對SARS一種病毒進行診斷、不能對其它若干種急性呼吸道病原體合併感染進行同時檢測的缺點，本發明鑑別診斷的檢測結果更有利於臨床上儘早採取有效、合理的治療方案，提高治癒率，降低病死率。
本發明還包括將鑑別診斷系統用於鑑別或者診斷嚴重急性呼吸道症候群的方法，包括如下步驟a.非典型肺炎病原體樣本的核酸提取；b.一步法反轉錄核酸擴增；c.聚合酶鏈反應產物的純化；d.螢光微球的檢測；e.計算機分析處理系統判定檢測結果。
附圖1製備陽性質控品的流程圖附圖2「突變型」陽性質控品的結構下面用實施例進一步說明本發明。應該理解的是，本發明的實施例是用於說明本發明而不是對本發明的限制。根據本發明的實質對本發明進行的簡單改進都屬於本發明要求保護的範圍。除非另有說明，本發明中的百分數是重量百分數。
實施例一非典型肺炎病原體鑑別診斷系統製作方法的應用實例一、非典型肺炎病原體鑑別診斷系統(50人份)，其組成包括
DEPC，焦碳酸二乙酯；HiBind，代表高鍵合；TE，Tris-EDTA緩衝液；TAMC，四甲基氯化銨緩衝液。
二、具體製作方法如下1、寡核苷酸引物合成1)製備採用HPLC純化的人工合成的特異性正向與反向寡核苷酸引物，其中反向引物5』末端進行生物素化修飾，共包括14對引物，可特異擴增新型冠狀病毒(SARS-Cov，RNA病毒)、腸道病毒(Enterovirus，RNA病毒)、5種甲流感病毒(INF A，RNA病毒)、2種乙流感病毒(INF B，RNA病毒)、副流感病毒1型(PIV-1，RNA病毒)、副流感病毒3型(PIV-3，RNA病毒)、2種呼吸道合胞病毒(RSV，RNA病毒)、腺病毒(Adenobirus，DNA病毒)、肺炎支原體(M.Pneumoniae)、肺炎衣原體(C.Pneumoniae)、人偏肺病毒(HMPV)和嗜肺軍團桿菌(Legi)的相關區域。寡核苷酸引物是用DNA合成儀人工合成以及生物素修飾的，所有引物在合成後經HPLC純化，凍幹，-20℃保存。
2)質量檢定標準純度＞99％，A260nm/A280nm＞1.6，用每對引物分別反轉錄擴增相應病毒核酸，將擴增產物與和微球偶聯的對應檢測探針進行雜交，懸浮點陣檢測結果為陽性；與其它探針偶聯微球雜交結果為陰性。
2、5』末端氨基化寡核苷酸探針製備1)製備採用HPLC純化的特異性人工合成的寡核苷酸探針，5』末端氨基修飾，18種探針分別特異性結合如前所述18種引物相對應的病毒核酸區域。所有探針在合成後經HPLC純化，凍幹，-20℃保存。
2)質量檢定標準純度＞99％，A260nm/A280nm＞1.6，將氨基化的檢測探針與微球進行偶聯，然後用與被檢測探針互補的5』端生物素化修飾的反義探針進行雜交，懸浮點陣檢測結果為陽性；與其它反義探針雜交結果為陰性。
3、螢光檢測微球的製備本發明鑑別診斷系統中使用的螢光檢測微球是由Luminex公司提供的。
1)製備一種具有高度的物理學和熱力學穩定性的表面羧基化的聚苯乙烯微球顆粒被採用。上百種不同顏色的螢光標記染料分別為每一個微球標記上不同的螢光顏色，這些不同的螢光顏色作為微球的特定編碼，為微球在Luminex100TM系統中設定了特定的光譜地址，可被LUMINEX 100TM系統檢測到。
將5』末端氨基化修飾的寡核苷酸探針用無菌純水稀釋至DNA濃度為1nmol/μl。通過共價偶聯的方式分別包被於相應螢光編碼的表面羧基化微球，2-8℃避光保存。
2)質量檢定標準每種微球分群的差錯率應＜0.5％，每種微球分群的準確率應＞98％，每種空白微球1000個的螢光強度應＜104、陽性質控品的製備1)製備以SARS1為例1000-2000個拷貝SARS1 MT模板擴增純化產物。
2)質量檢定標準擴增陽性質控品，擴增產物與所有探針偶聯微球雜交，懸浮點陣檢測，對應探針檢測結果為陽性，其它探針檢測結果為陰性。
5、陰性質控品的製備1)製備1000-2000個拷貝RSVm模板擴增純化產物。
2)質量檢定標準擴增陰性質控品，擴增產物與所有探針偶聯微球雜交，懸浮點陣檢測，對應探針檢測結果為陽性，其它探針檢測結果為陰性。
6、核酸提取試劑的製備1)製備由Omega Biotek公司提供，包括RNA Solv、RNA洗液I、RNA洗液II(5×)、水(經DEPC處理)、HiBind RNA玻璃纖維離心柱和收集管、2ml收集管等組份。可以同時提取DNA病毒和RNA病毒的核酸。
2)質量檢定標準用該試劑提取純化250μl SRAS病毒培養上清的病毒核酸，A260nm＞0.02，A260nm/A280nm＞1.8。
7、一步法遞轉錄核酸擴增(RT-PCR)試劑的製備1)製備由Qiagen公司提供，包括一步法RT-PCR酶混合液、5×RT-PCR緩衝液、dNTP、水(RNase free)等組份。用於病毒核酸的體外反轉錄與PCR擴增。
2)質量檢定標準用5μl濃度為1ng/μl的SARS病毒核酸反轉錄擴增，取經過PCR產物純化的5μl擴增產物與所有探針偶聯微球混合物雜交，懸浮點陣檢測結果相應探針為陽性，除RSVm外其它探針為陰性。
8、PCR產物純化試劑的製備1)製備由Qiagen公司提供，包括HiBind DNA玻璃纖維離心柱和收集管等組份。
用於一步法RT-PCR反應後的產物純化。
2)質量檢定標準用5μl濃度為1ng/μl的SARS病毒核酸反轉錄擴增，擴增產物經過PCR產物純化後核酸純度A260/A280＞1.6。
9、懸浮點陣雜交檢測試劑的製備由Qiagen公司提供，包括1.5×TMAC，1×TE，SA-PE等組分。用於純化後的一步法RT-PCR產物的懸浮點陣檢測。
三、本發明技術製備的非典型肺炎病原體鑑別診斷系統的質量檢測1)檢測極限以SARS1為例，將SARS1陽性質控品連續10-1梯度稀釋3次，分別經核酸提取、反轉錄擴增、擴增產物純化、雜交、懸浮點陣檢測，檢測結果為陽性的最低濃度不高於100拷貝。以SARS1模板DNA進行過柱純化後，以UV分光光度計進行DNA含量的測定，同時以瓊脂糖電泳檢查對比濃度。得到約2ng/ul的模板濃度，然後以此模板濃度進行10倍梯度稀釋，以此稀釋產物1μl為模板，進行PCR擴增反應、PCR產物純化、核酸雜交，用Luminex100TM懸浮點陣檢測，結果見下表。PCR反應結束後，瓊脂糖電泳檢查反應結果。用1D圖象分析軟體進行紫外分析並照相，擴增產物灰度掃描得A值，SARS1擴增片段的A值與DNA MARKER相比較得出擴增片段的濃度為2ng/μl，，擴增片段長度為109bp，得到每μl的分子數(即為拷貝數)為1.9×108，則起始模板的檢測極限濃度為1.9×108×2。
編號 模板量SARS1雜交結果1 1.9×108×2 1172 1.9×1081603 1.9×107338.54 1.9×106368.55 1.9×1054996 1.9×1044397 1.9×1033548 1.9×10286
9 1.9×1019110 background 482)準確性包括陽性質控品符合率，即以10份陽性質控品檢測結果不得出現假陰性；陰性質控品符合率，即以10份正常人全血檢測結果不得出現假陽性。在上述條件下用SARS1探針重複檢測同一種陽性質控品、正常人全血標本各10次。結果如下
3)精密度將含102個SARS病毒拷貝參考品作為精密性參考品，連續十次分別經核酸提取、反轉錄擴增、擴增產物純化、雜交、懸浮點陣檢測本系統精密性。計算每次測定結果，求出均值、SD和變異係數CV。精密度試驗結果顯示批間CV≤20％4)靈敏度和特異性通過檢測臨床確診的SARS冠狀病毒感染樣本20份以及正常樣本80份驗證試劑盒的檢測域值、靈敏度及特異性。按非典型肺炎病原體懸浮點陣鑑別診斷系統使用說明書操作。測試臨床樣本的結果經統計學分析結果表明靈敏度(真陽性率)＝100％特異性(真陰性率)＝96％假陽性率＝0假陰性率＝4％實施例二非典型肺炎病原體鑑別診斷系統檢測方法的使用實例(一)非典型肺炎病原體樣本核酸提取標準操作規程具體操作步驟如下1、取250μl的病人標本與1ml RNA-Solv(綠顏色液體)在2ml離心管中混合，如果標本少於250μl，相應減少RNA-Solv的用量即可，樣本體積不應超過工作終體積的20％。以下是幾種不同來源的標本的採集處理方法1)拭子拭子浸入1ml的RNA-Solv中3分鐘，取出並棄掉拭子，接步驟3。
2)全血/血漿將250μl病人的全血/血漿與1ml RNA-Solv充分混合，接步驟3。
3)糞便在2ml離心管(RNase free)中用生理鹽水(經DEPC處理)稀釋標本，製成10％(wt/wt)懸液；4℃，3200×g離心15分鐘，將上清轉移，16000×g，4℃離心15分鐘去除剩餘殘渣。取250μl上清，與1ml RNA-Solv(綠顏色液體)在2ml離心管中混合，接步驟3。
4)尿將20-30ml尿，離心，收集沉澱物置於2ml螺口離心管中，加入1ml RNA-Solv(綠顏色液體)充分混合，接步驟3。
2、往步驟1的離心管中加入250μl氯仿，充分漩渦混合至少30秒。
3、設立空白對照以去離子水作為空白同時進行核酸提取操作。
4、12,000×g離心10分鐘，使水相與有機相充分分層。
5、小心的將450μl上層水相移入一個新的1.5ml離心管(RNase free)中，並保持剩餘水相與有機相的分層。
6、向步驟4的離心管中加入等體積的70％的乙醇，使用漩渦混合器將其充分混勻。
7、取700μl步驟5的樣品加入到HiBind RNA玻璃纖維離心柱的上部。10,000×g，離心15秒鐘，丟棄收集液，保留收集管並重新組裝。
8、如果步驟5的樣品還有剩餘，將剩餘樣品加到重新組裝的HiBind RNA離心柱上部。10,000×g，離心15秒鐘。
9、丟棄收集液和收集管。
10、將HiBind RNA離心柱與一個新的2ml收集管(試劑盒中已提供)組裝，並在HiBind RNA離心柱的上部加入500μl的RNA洗液I。
11、10,000×g離心15秒鐘，丟棄收集液，保留收集管並重新組裝。
12、在HiBind RNA離心柱的上部加入500μl的RNA洗液II(1X)(注意RNA WashBuffer I在使用前需加入100％的乙醇)。。
13、10,000×g離心15秒鐘，丟棄收集液，保留收集管並重新組裝。
14、在HiBind RNA離心柱中加入500μl的RNA洗液II15、10,000×g離心15秒鐘，丟棄收集液，保留收集管並重新組裝。
16、使用離心機的最高轉數離心1分鐘，將HiBind RNA離心柱殘液完全甩幹。
17、將HiBind RNA玻璃纖維離心柱與一個新的1.5ml離心管(RNase free，試劑盒中未提供)組裝。
18、RNA/DNA洗脫。將50μl經DEPC處理水(試劑盒中已提供)直接加到玻璃纖維離心柱基質上，並且不要碰到離心柱，使用離心機的最高轉數離心1分鐘。
19、純化的RNA/DNA需立即用於RT-PCR，或者5μl/份分裝於Rnase free的螺口離心管中，凍存於-80℃直到用於RT-PCR。
(二)一步法反轉錄核酸擴增RT-PCR標準操作規程具體操作步驟如下1、將RNA模板溶解，並將其與引物、dNTP、一步法PCR緩衝液(5×)、一步法RT-PCR混合酶、水(RNase-free)放置於冰上。
2、按照下表準備RT-PCR反應體系。以7人份為例，應至少配製10人份反應混合液(含1個陽性質控品和1個空白樣品)。
3、用移液器輕輕的上、下抽吸RT-PCR反應混合液幾次，使其充分混勻，按45μl/反應管分裝，置於冰盤上。
4、在RT-PCR反應管上標記病人編號，每管中加入5μl RNA模板。
5、設立陽性質控樣品和空白質控樣品(1)用由核酸提取操作中以去離子水代替樣本所得到的提取物為模板作為空白對照樣本。
(2)將陽性質控品取出，室溫溶解混勻，離心數秒，向含45μlRT-PCR反應試劑的PCR反應管中分別加入5ul陽性質控品作為陽性對照樣本。
6、按如下步驟編程PCR循環A.反轉錄50℃ 30分鐘B.終止反轉錄95℃ 15分鐘C.三步循環94℃ 30秒55℃ 15秒72℃ 15秒共進行40個循環D.終延伸72℃ 3分鐘
7、先將加好試劑的PCR管放置冰上，待RT-PCR啟動並升溫至50℃後再放入PCR儀進行擴增循環。
(三)PCR產物純化標準操作規程具體操作步驟如下1、將HiBind DNA玻璃纖維離心柱(藍色向上)插入收集管中，適當標記每個管；2、將PCR產物轉移到組裝好的HiBind DNA玻璃纖維離心柱和收集管中；3、加400ul的pH8.01×TE於含有PCR產物的已經組裝好的HiBind DNA玻璃纖維離心柱和收集管中；4、10,000×g離心5分鐘，棄去收集液；5、裝回離心柱；6、用400ul的pH8.01×TE衝洗；7、10,000×g離心5分鐘，離心後在收集管中剩有小體積(大約5ul)的收集液是合適的；8、將HiBind DNA玻璃纖維離心柱與新的收集管組裝；9、檢查樣品體積，在收集管中剩餘的樣品體積不超過5ul；10、將45ul pH8.01×TE直接加到HiBind DNA玻璃纖維離心柱的表層，輕輕搖動30秒；11、將HiBind DNA玻璃纖維離心柱顛倒並插入到收集管中(白邊向上)；12、10,000×g離心3分鐘，在收集管中大約45-50ul的液體既是RT-PCR純化產物。
(四)螢光微球測定標準操作規程具體操作步驟如下1.將所有試劑恢復至室溫並震蕩混勻；將微球混合物充分渦旋振蕩至少15秒，並注意避光。(可置於黑暗處或用鋁箔包裹覆蓋)然後按如下說明配製好1×TE，1.5×TMAC和微球混合液加入至乾淨的離心管中，並旋渦震蕩混勻，按45ul/test分裝至小管中。反應體系如下10ul/test 1×TE，PH8.02ul/test SARS系列偶聯微球33.0ul/test 1.5×TAMC5.0μl/test純化的RT-PCR樣品(在步驟2中加入)50ul 總體積
2.在上述含核酸雜交試劑的小管中加入5.0ul純化的RT-PCR樣品；微球背景空白用0.5ul 1×TE代替純化的RT-PCR樣品加入含核酸雜交試劑的小管；3.將樣品放置98℃中變性5分鐘，然後立即將變性的樣品置於52℃中雜交15分鐘。可在PCR儀中進行。請保持樣品閉光，可加入油覆蓋樣品以避光；4.在雜交反應進行過程中，按1∶250稀釋配製新鮮的藻紅蛋白標記的鏈黴生物素，即加3ul SA-PE儲存液(1mg/ml)到750ul 1×TMAC(預先用250ul去離子水稀釋500ul 1.5×TMAC)；5.雜交完畢後，以最大轉速離心2分鐘沉澱微球，去除上清液，保存沉澱的微球。去除上清液時應留下一些液體，以免將微球吸出；6.每管加入75ul 1∶250的SA-PE液體，旋渦震蕩使微球重新懸浮，52℃閉光保溫5分鐘(可在PCR儀中進行)。
(五)結果判定標準1、數據有效性分析(1)微球背景空白螢光強度不高於100；(2)空白樣本中內源性陰性對照與其它寡核苷酸探針雜交螢光強度不高於200；與自身對應寡核苷酸探針特異性雜交螢光強度高於空白對照兩倍以上；(3)陽性對照與自身對應寡核苷酸探針特異性雜交螢光強度高於空白對照五倍以上。
當實驗數據同時滿足上述3個條件，本次實驗判為有效實驗。
2、待測樣本分析通過三個線性函數方程分析待測樣本、對於每個個體進行判別時，把測試的各變量值代入判別函數，得出判別分數。從哪一個線性函數方程得出的判別分數高，就可以判定該個體屬於哪一類臨床分組，包括發燒、非典型肺炎疑似病例和非典型肺炎臨床確診病例。以上分析均使用專用計算機分析處理系統進行。
權利要求
1.一種用於檢測人類急性呼吸道感染病原體的非典型肺炎病原體懸浮點陣鑑別診斷系統，該系統由檢測試劑盒和計算機分析處理系統組成，其中檢測試劑盒由質量控制樣品、生物素標記的特異性核酸擴增引物、非典型肺炎病原體特異性寡核苷酸探針偶聯的螢光微球和輔助試劑組成，計算機分析處理系統是帶有建立在多元逐步回歸基礎上的線性判別函數方程軟體的計算機處理系統。
2.根據權利要求1的鑑別診斷系統，其中所述質量控制樣品包括呼吸道感染病原體陽性質控品和陰性質控品。
3.根據權利要求2的鑑別診斷系統，其中所述呼吸道感染病原體陽性質控品，是將寡核苷酸用核酸合成儀進行合成後、獲得檢測非典型肺炎病原體的靶序列、用基因工程重組的方法構建的「基因片斷」。
4.根據權利要求3的鑑別診斷系統，其中所述生物素標記特異性核酸擴增引物是根據非典型肺炎病原體靶序列的特異性和同源性特點、用核酸合成儀將寡核苷酸按照上述特點進行合成而製備的。
5.根據權利要求4的鑑別診斷系統，其中所述非典型肺炎病原體特異性寡核苷酸探針偶聯的螢光微球，是用帶有螢光素的聚苯乙烯微球、分別與18種非典型肺炎病原體特異性寡核苷酸探針通過共價偶聯的化學反應而製作的。
6.根據權利要求5的鑑別診斷系統，其中所述非典型肺炎病原體特異性寡核苷酸探針是通過核酸合成儀製備，探針在5′-末端被氨基化；所述聚苯乙烯微球是羧基化的聚苯乙烯螢光微球。
7.根據權利要求6之一的鑑別診斷系統，其中所述計算機分析處理系統是帶有根據懸浮點陣病原體檢測結果對感染患者進行判別分類後，根據發燒患者、非典型肺炎疑似病例和臨床診斷病例病原體的分布建立三個線性判別函數方程，並由此編制的軟體程序的計算機分析處理系統。
8.根據權利要求1-7之一的鑑別診斷系統，其中所述輔助試劑包括藻紅蛋白標記的鏈黴親和素、核酸提取試劑、一步法逆轉錄核酸擴增試劑、聚合酶鏈反應產物純化試劑和懸浮點陣雜交檢測試劑。
9.根據權利要求1-8之一的鑑別診斷系統用於鑑別或者診斷嚴重急性呼吸道症候群的用途。
10.一種使用權利要求1-8之一的鑑別診斷系統用於鑑別或者診斷嚴重急性呼吸道症候群的方法，包括如下步驟a.非典型肺炎病原體樣本的核酸提取；b.一步法反轉錄核酸擴增；c.聚合酶鏈反應產物的純化；d.螢光微球的檢測；e.計算機分析處理系統判定檢測結果。
全文摘要
本發明公開了一種快速檢測嚴重急性呼吸道症候群相關的冠狀病毒核糖核酸及其它人類常見非典型肺炎病原體的鑑別診斷系統，該系統包括病原體懸浮點陣檢測試劑盒和計算機分析處理系統。本鑑別診斷系統利用18種常見急性呼吸道感染病原微生物特異性探針偶聯的螢光微球組合，以寡核苷酸探針捕獲的方法檢測包括嚴重急性呼吸道症候群相關冠狀病毒在內的非典型肺炎病原體，該方法檢測指標多、靈敏度高、特異性好、組配合理、操作簡便，特別適宜進行群體發燒的病原學篩查和非典型肺炎病原體的鑑別診斷。
文檔編號G01N33/52GK1600864SQ03126419
公開日2005年3月30日 申請日期2003年9月28日 優先權日2003年9月28日
發明者馬旭, 韓健 申請人:馬旭