一種混合離子交換模式的親水色譜填料、其製備方法及應用與流程
2023-06-15 03:04:21 1
本發明涉及色譜分離分析領域，具體地說，涉及一種混合離子交換模式的親水色譜填料及其製備方法。
背景技術：
色譜填料及固定相作為色譜分離技術的核心，其發展直接影響著色譜分離的選擇性和分離效率，制約著親水作用色譜的應用和推廣[chestert.l.etal,anal.chem.2013,85,579-589]。矽膠以良好的機械強度、可控的多孔結構、較好的化學穩定性等優點被廣泛用於高效液相色譜固定相應用[qiuh.d.etal,anal.bioanal.chem.2011,399,3307-3322]。不同表面基團的鍵合矽膠可以應用於多種不同的色譜分離模式。其中在矽膠表面修飾上兩性離子基團，可以製備性能優越的親水色譜固定相。
典型的兩性離子色譜材料，如硫代甜菜鹼型(zic-hilic)和磷酸膽鹼型(zic-chilic)，具有很高的親水性和獨特的分離選擇性，被廣泛用於分離小分子極性化合物、代謝產物、硫代葡萄糖苷、氨基糖苷、肽、糖肽和其他化合物[palmas.d.etal,anal.chem.2011,83,3440-3447]。但這種傳統的兩性離子色譜材料的表面正負電荷垂直於固定相表面分布，因而不能進行表面電荷的調控與優化。近期發展的新型兩性離子材料，如半胱氨酸鍵合矽膠親水色譜固定相，可形成帶正負不同電荷基團平行於矽膠表面的結構類型，使所製備的分離材料不僅具備較好的親水性，同時具有電荷調控能力[shena.j.etal,chem.commun2011,47,4550-4552]。這種新型的兩性離子色譜材料也是目前該體系材料發展的熱點與趨勢。
而縱觀兩性離子功能相的設計，含「巰基」的胺基酸、小肽樣品較少。因此，基於以上的研究背景，本發明採用相反的「巰基-烯烴」合成策略，將「巰基」修飾到矽膠表面，在兩性離子功能相上修飾上「烯基」，這樣在兩性離子功能相的設計中還可以很好地引入不同帶電能力官能團，設計出系列混合模式的兩性離子功能相。同時，「巰基-烯烴」反應是是一種簡單、快速、高效的小單元拼接反應，反應過程更為安全，且無重金屬離子催化，更為綠色環保[hoylec.e.etal,chem.soc.rev.2010,39,1355-1387]。因此，該反應過程可廣泛應用於材料的製備。這類新型混合離子交換模式的親水色譜填料的成功製備將為豐富兩性離子分離材料提供了可觀的保障，也為材料應用研究提供更多的發展思路和方向。
技術實現要素：
因此，本發明要解決的技術問題是，提供一種新型的混合離子交換模式的親水色譜填料。本發明要解決的另一個技術問題是，提供該色譜填料的製備方法。本發明要解決的另一個技術問題，是提供該色譜填料的應用。
本發明的技術方案是，一種混合離子交換模式的親水色譜填料，以矽膠為基質，鍵合相末端為兩性離子官能團，其化學結構式為：
其中silicagel為球型矽膠，是末端帶烯基的兩性離子鍵合相，n＝0～4，x是帶正電荷的官能基團，選自氨基，季銨基中的一種，y是帶負電荷的官能基團，選自羧基，磺酸基中的一種。
優選的是，球型矽膠的粒徑1～20μm，孔徑
本發明還提供了上述的混合離子交換模式的親水色譜填料的製備方法，其具體步驟為：
(1)兩性離子鍵合相的合成
以烯丙基胺、溴乙酸乙酯、丙磺酸內酯、boc-甘氨酸、甜菜鹼中的三種為原料，採用逐步反應法將不同電荷強度的帶電荷官能基團反應，生成帶「強」「弱」不同離子交換能力的兩性離子鍵合相，且保證該兩性離子鍵合相末端帶有「烯基」基團；
所述的兩性離子鍵合相為「帶正電荷的氨基」與「帶負電荷的羧基」的弱陰/弱陽離子交換功能相(wax/wcx)，「帶正電荷的氨基」與「帶負電荷的磺酸基」的弱陰/強陽離子交換功能相(wax/scx)，「帶正電荷的季胺基」與「帶負電荷的羧基」的強陰/弱陽離子交換功能相(sax/wcx)與「帶正電荷的季胺基」與「帶負電荷的磺酸基」的強陰/強陽離子交換功能相(sax/scx)這四種混合模式的兩性離子功能相中的一種；
(2)矽膠預處理
將每克球型矽膠加入2～100ml質量濃度為1～40％的鹽酸或硝酸溶液中，加熱回流攪拌1～48小時，過濾，水洗至中性，於100～160℃下乾燥至恆重，得到活化矽膠；
(3)矽膠表面修飾
將步驟(2)所得的活化矽膠置於反應容器中，在氮氣氛圍下加入有機溶劑，攪拌均勻，滴加矽烷試劑，每克活化矽膠使用0.5～5mmol矽烷試劑；保持溫度為20～200℃條件下攪拌2～48小時；待反應體系冷卻至室溫，減壓過濾並依次用甲苯、丙酮、甲醇、水、甲醇洗滌，固體產品在60～100℃條件下乾燥12～36小時，得到矽膠表面修飾的產品；
(4)巰基-烯烴點擊反應
將步驟(3)所得矽膠表面修飾的產品置於反應容器中，在氮氣氛圍下加入有機溶劑，每克活化矽膠使用2～100ml有機溶劑攪拌均勻，加入兩性離子鍵合相，攪拌均勻，再加入引發劑，引發劑的使用量為每克烯基或巰基矽膠使用0.01～1mmol；保持溫度為20～200℃條件下攪拌2～48小時；待反應體系冷卻至室溫，減壓過濾並依次用甲苯、丙酮、甲醇、水、甲醇洗滌，所得固體產品在60～100℃條件下乾燥12～36小時，得到混合離子交換模式的親水色譜填料。
理論上這樣的設計使得鍵合相中帶「正」和帶「負」電荷的官能團是相當的。與傳統的兩性離子鍵合不同的是，新設計的「正」「負」電荷官能團是平行於矽膠基質兩端，它會隨不同ph的變化表現出差異化的帶電情況，那麼應用於離子化合物的分離分析就有更大的前景。
優選的是，所述反應容器，是玻璃或者聚四氟乙烯反應容器。
根據本發明的混合離子交換模式的親水色譜填料的製備方法，優選的是，在所述的步驟(1)中，製備兩性離子鍵合相「wax/wcx」的原料為烯丙基胺、溴乙酸乙酯和boc-甘氨酸，投料摩爾比為0.6-6:0.5-5:0.5-5；製備兩性離子鍵合相「wax/scx」的原料為烯丙基胺、丙磺酸內酯和boc-甘氨酸，投料摩爾比為1.5-10:0.5-5:0.5-5；製備兩性離子鍵合相「sax/wcx」的原料為烯丙基胺、溴乙酸乙酯和甜菜鹼，投料摩爾比為0.6-6:0.5-5:0.5-6；製備兩性離子鍵合相「sax/scx」的原料為烯丙基胺、丙磺酸內酯和甜菜鹼，投料摩爾比為1.5-10:0.5-5:1-10。
因為一種兩性離子鍵合相均有陽離子交換基團和陰離子交換基團，所以叫混合離子交換模式鍵合相修飾材料，而每次採用的是一種混合。
優選的是，在所述的步驟(3)中，所述的有機溶劑包括苯系物和烷烴中的一種。所用的有機溶劑為與水不互溶的有機溶劑，有機溶劑包括甲苯、乙苯、二甲苯、正己烷、正庚烷、正戊烷、正辛烷、環己烷中的一種；有機溶劑的使用量為每克活化矽膠使用2～100ml有機溶劑。
優選的是，在所述的步驟(3)中，矽烷試劑結構式為：
其中，x為-och3，-och2ch3或-cl,n＝0～4，a為巰基。
根據本發明的混合離子交換模式的親水色譜填料的製備方法，優選的是，在所述的步驟(4)中，所述的兩性離子鍵合相的使用量為每克烯基或巰基矽膠使用0.01～100mmol。
根據本發明的混合離子交換模式的親水色譜填料的製備方法，優選的是，在所述的步驟(4)中，所述的引發劑為偶氮類引發劑，包括偶氮二異丁腈、偶氮二異庚腈、偶氮二異丁酸二甲酯、偶氮二異丁脒鹽酸鹽中的一種。
根據本發明的混合離子交換模式的親水色譜填料的製備方法，優選的是，步驟(4)引發劑的使用量為每克烯基或巰基矽膠使用0.2～1mmol。
本發明還提供了上述混合離子交換模式的親水色譜填料在基於親水作用色譜或離子作用色譜模式的極性樣品分離，及修飾蛋白質組學中糖肽或磷酸化肽的選擇性富集方面的應用。
本發明的有益效果是：
1.鑑於該混合離子交換模式的親水色譜分離材料同時具有親水性和電荷可調控性，可以簡單地在一種材料中實現多種分離模式的聯用，避免了分離富集操作的繁瑣及複雜化；
2.矽膠的修飾引入新型的兩性離子功能相，所設計的新型混合離子交換模式色譜填料的正負電荷中心平行於固體基質表面，表面正負電荷可以通過改變ph值進行調控和優化；
3.兩性離子功能相進一步引入「強」「弱」陰/陽離子交換基團，進一步實現了一種材料具有混合的離子交換能力，可通過分離富集能力的差異及比較，明確離子交換特性，從而有效實現離子交換容量的控制與優化；
4.基於材料獨特的性能，有望實現基於親水作用色譜或離子作用色譜模式的極性樣品分離及修飾蛋白質組學中糖肽或磷酸化肽的選擇性富集，從而提供一種選擇性更高、吸附量更大、可控性更好的分離富集新方法與新思路。
附圖說明
圖1為使用實施例1中的兩性離子鍵合相的反應過程圖；
圖2為使用實施例1中的色譜填料的製備過程圖；
圖3為使用實施例2中的兩性離子鍵合相的反應過程圖；
圖4為使用實施例3中的兩性離子鍵合相的反應過程圖；
圖5為使用實施例4中的兩性離子鍵合相的反應過程圖；
圖6為使用實施例2中的色譜填料在不同ph條件的磷酸二氫鉀緩衝液中的ζ-電勢圖；
圖7為使用實施例3中的色譜填料在不同ph條件的磷酸二氫鉀緩衝液中的ζ-電勢圖；
圖8為使用實施例4中的色譜填料在不同ph條件的磷酸二氫鉀緩衝液中的ζ-電勢圖；
具體實施方式
下面結合實例，對本發明做進一步說明。實例僅限於說明本發明，而非對本發明的限定。
實施例1
取250ml三口燒瓶，加入2.2g烯丙基胺，50ml四氫呋喃和12.5g三乙胺，置於冰浴中攪拌混合均勻，並通入氬氣保護，再通過常壓漏鬥向反應體系中滴加入2.6g溴乙酸乙酯和17ml四氫呋喃的混合液30min以上，攪拌反應1小時，然後撤出冰浴，常溫攪拌1.5小時。反應結束後將反應混合物旋蒸去除四氫呋喃，之後向殘留物中加入37ml乙醚，攪拌萃取，加入少量無水硫酸鈉乾燥，抽濾分離得到液體，旋蒸得到黃色油狀液體；取50ml圓底燒瓶，加入用8ml二氯甲烷溶解的1.75gboc-甘氨酸溶液，置於冰水浴中，攪拌均勻，滴加用4ml二氯甲烷溶解的2.06gdcc溶液，出現白色渾濁，冰浴反應1小時，滴加用4ml二氯甲烷溶解的1.43g上述黃色油狀溶液和0.0122gdmap，撤去冰浴，常溫攪拌反應一夜，停止攪拌，抽濾，用少量二氯甲烷洗濾餅，將濾液轉移至50ml茄型瓶中，旋蒸除去二氯甲烷，得到淺黃色油狀液體；將2ml三氟乙酸與8ml二氯甲烷的混合溶液加入到上述淺黃色油狀液體中，室溫攪拌1小時，反應結束後，旋蒸除去二氯甲烷，將剩餘物質加入適量乙酸乙酯中溶解，用5％碳酸鈉溶液洗滌至ph為8～9，取油相旋蒸除去溶劑得白色固體，乾燥；取50ml單口燒瓶，加入0.6g上述白色固體，0.8g氫氧化鈉，10ml甲醇，常溫下攪拌8小時，之後用鹽酸中和至ph為7～8，得兩性離子鍵合相「wax/wcx」，該反應過程如圖1所示。
稱取5g球型矽膠(粒徑5μm，孔徑比表面300m2/g)，置於250ml三頸燒瓶中，加入80ml濃度為2mol/l的鹽酸溶液，加熱回流12小時，冷卻至室溫，用4#砂芯漏鬥進行抽濾，水洗至中性，抽乾於80℃烘箱中乾燥過夜，得活化矽膠。在通入乾燥的氮氣的條件下，往活化矽膠中加入50ml乾燥的甲苯，攪拌均勻，然後滴加5.9mlγ-三乙氧基丙基巰基矽烷，110℃條件下加熱回流24小時，反應結束用4#砂芯漏鬥進行抽濾，依次用甲苯、丙酮、水、甲醇清洗，抽乾於80℃烘箱中乾燥過夜，得巰基矽膠。在通入乾燥的氮氣的條件下，稱取5g巰基矽膠，加入50ml無水甲醇，攪拌均勻，加入溶解於10ml甲醇的兩性離子鍵合相「wax/wxc」0.5g，攪拌均勻，加入溶解於5ml無水甲醇的2,2-偶氮二異丁腈0.1g，攪拌均勻，升溫至65℃，加熱回流48小時，反應體系冷卻至室溫，4#砂芯漏鬥進行抽濾，依次用水、甲醇清洗，抽乾於80℃烘箱中乾燥過夜，最終得混合離子交換模式的親水色譜填料ⅰ，製備過程如圖2所示。
實施例2
取50ml的三口燒瓶，加入12.0g烯丙基胺，置於溫度為45℃的油浴鍋中，冷凝回流，緩慢滴加6ml丙磺酸內酯，加熱攪拌反應2小時，得到黃色油狀液體，反應結束後，用乙醚適量多次地洗滌混合物，直至有白色晶體析出；取50ml圓底燒瓶，加入用8ml二氯甲烷溶解的1.75gboc-甘氨酸溶液，置於冰水浴中，滴加用4ml二氯甲烷溶解的2.06gdcc溶液，出現白色渾濁，冰浴攪拌反應1小時，滴加用4mldmso溶解的1.79g白色晶體和0.0122gdmap，撤去冰浴，常溫攪拌反應一夜，反應結束，抽濾，用少量二氯甲烷洗濾餅，將濾液轉移至50ml茄型瓶中，旋蒸除去二氯甲烷，得到淺黃色油狀液體；將2ml三氟乙酸與8ml二氯甲烷的混合溶液加入到淺黃色油狀液體，室溫攪拌1小時，反應結束後，旋蒸除去二氯甲烷，將剩餘物質加入適量乙酸乙酯中溶解，用5％碳酸鈉溶液洗滌至ph為8-9，取油相旋蒸，得兩性離子鍵合相「wax/scx」，該反應過程如圖3所示。
兩性離子鍵合相「wax/scx」鍵合矽膠的操作同實施例1，最終得混合離子交換模式的親水色譜填料ⅱ。
實施例3
取250ml三口燒瓶，加入2.2g烯丙基胺，50ml四氫呋喃和12.5g三乙胺，置於冰浴中攪拌混合均勻，並通入氬氣保護，再通過常壓漏鬥向反應體系中滴加入2.6g溴乙酸乙酯和17ml四氫呋喃的混合液30min以上，攪拌反應1小時，然後撤出冰浴，常溫攪拌1.5小時。反應結束後將反應混合物旋蒸去除四氫呋喃，之後向殘留物中加入37ml乙醚，攪拌萃取，加入少量無水硫酸鈉乾燥，抽濾分離得到液體，旋蒸得到黃色油狀液體；取100ml三口燒瓶，加入1g無水甜菜鹼，5ml二氯亞碸，置於72℃油浴鍋中，加熱攪拌，冷凝回流2小時，滴加入5ml甲苯，攪拌5min，撤去油浴鍋，冰浴中快速攪拌冷卻，析出沉澱，分離除去液體，固體用5ml甲苯洗滌，洗滌三次，得到氯化甜菜鹼醯氯固體；取0.7g黃色油狀液體，溶解於10ml四氫呋喃中，緩慢滴加入冰浴的氯化甜菜鹼醯氯中，滴加完畢後繼續攪拌十分鐘，分離得到固體，少量多次使用乙醚洗滌固體至乙醚洗液無色；取100ml單口燒瓶，加入0.6g上一步產物，0.8g氫氧化鉀，10ml甲醇，常溫下攪拌8小時，之後用鹽酸中和，得到兩性離子鍵合相「sax/wcx」，該反應過程如圖4所示。
兩性離子鍵合相「sax/wcx」鍵合矽膠的操作同實施例1，最終得混合離子交換模式的親水色譜填料ⅲ。
實施例4
取50ml的三口燒瓶，加入12.0g的丙烯胺，置於溫度為45℃的油浴鍋中，在冷凝回流的條件下，緩慢滴加6ml的丙磺酸內酯，加熱攪拌反應2.5小時。反應結束後，用乙醚適量多次地洗滌液態的反應混合物，吸去乙醚層，得到中間產物；取50ml的三口燒瓶，加入0.42g的乾燥過的甜菜鹼，置於溫度為72℃的油浴鍋中，在冷凝回流的條件下，滴入2ml的二氯亞碸，加熱攪拌反應1.5小時。反應結束後，加入5ml甲苯，攪拌5min，後置於冰浴中攪拌冷卻，析出晶體，吸去上層的甲苯洗液，固體產物繼續用5ml甲苯洗滌，洗滌三次，吸去甲苯，得醯氯化甜菜鹼；在的燒瓶中加入，超聲，得到均勻分散的濁液。取50ml的錐形瓶，加入分散於3mldmf的醯氯化甜菜鹼，將分散於10mldmf的中間產物1.25g濁液倒入恆壓滴液漏鬥，在冰浴的條件下，緩慢滴入1.5ml的三乙胺於燒瓶中，後控制恆壓滴液漏鬥的滴速，將濁液緩慢加入，之後補加3ml的dmf於滴液漏鬥中洗下殘留在壁上的小顆粒，全部滴加完成後，繼續攪拌15min。停止反應，離心分離後得到固體產物，用乙醚適量多次地洗滌直至乙醚層接近無色，除去乙醚，得到兩性離子鍵合相「sax/scx」，該反應過程如圖5所示。
兩性離子鍵合相「sax/scx」鍵合矽膠的操作同實施例1，最終得混合離子交換模式的親水色譜填料ⅳ。
實施例5
測定實施例2中混合離子交換模式的親水色譜填料ⅱ在不同ph值條件下的ζ-電勢的變化趨勢。具體方法為：稱取50mg的實施例2中的材料，加入30ml的水超聲分散。取1ml上述溶液加入2ml不同ph條件下的磷酸二氫鉀緩衝液和7ml水，振蕩均勻，轉移至malvernzetasizernano-zs90測試儀測定材料表面的電勢變化。實施例2中的材料ζ-電勢隨ph條件變化的趨勢圖如圖6所示。
實施例6
測定實施例3中混合離子交換模式的親水色譜填料ⅲ在不同ph值條件下的ζ-電勢的變化趨勢。具體方法為：稱取50mg的實施例3中的材料，加入30ml的水超聲分散。取1ml上述溶液加入2ml不同ph條件下的磷酸二氫鉀緩衝液和7ml水，振蕩均勻，轉移至malvernzetasizernano-zs90測試儀測定材料表面的電勢變化。實施例3中的材料ζ-電勢隨ph條件變化的趨勢圖如圖7所示。
實施例7
測定實施例4中混合離子交換模式的親水色譜填料ⅳ在不同ph值條件下的ζ-電勢的變化趨勢。具體方法為：稱取50mg的實施例4中的材料，加入30ml的水超聲分散。取1ml上述溶液加入2ml不同ph條件下的磷酸二氫鉀緩衝液和7ml水，振蕩均勻，轉移至malvernzetasizernano-zs90測試儀測定材料表面的電勢變化。實施例4中的材料ζ-電勢隨ph條件變化的趨勢圖如圖8所示。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍內。