一種寬宿主譜產超廣譜β－內醯胺酶大腸桿菌噬菌體及其分離獲得方法
2023-06-15 01:28:11
專利名稱：一種寬宿主譜產超廣譜β－內醯胺酶大腸桿菌噬菌體及其分離獲得方法
技術領域：
本發明涉及一種寬宿主譜產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌噬菌體及其分離獲得方法，屬於微生物生物工程領域。
背景技術：
隨著人類對抗菌藥物廣泛及不合理應用，耐藥性細菌大量出現，多重耐藥菌的產生及傳播已成為全世界高度關注的問題。人們試圖通過不斷研製新抗菌藥物來對付細菌日益複雜的耐藥性，但一種新的抗菌藥物在臨床應用後，仍將面對細菌耐藥性的產生。
β-內醯胺類抗生素是指分子結構中含有β-內醯胺環的一大類抗生素，包括青黴素類、頭孢菌素類及非黃型β-內醯胺類。β-內醯胺類抗生素通過抑制青黴素結合蛋白(Penicillin binding proteins，PBPs)發揮治療作用，阻止細菌細胞壁粘肽(Mucopiptide)的合成，阻止粘肽鏈的交叉連結，使細菌無法形成細胞壁，從而導致細菌溶解並死亡。
超廣譜β-內醯胺酶(extended-spectrum beta-lactamases，ESBLs)是指由細菌質粒介導的能水解氧亞氨基β-內醯胺抗生素，能使第三代頭孢菌素(如頭孢他啶、頭孢唑肟、頭孢曲松)和單菌黴素(如氨曲南)失活的一類酶。1983年德國學者knothe首先報導ESBLs以來，許多國家都相繼發現產ESBL細菌的出現，目前全世界產ESBL細菌在臨床標本中的分離率有增加的趨勢。ESBLs主要由腸桿菌科細菌產生，以大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌為代表，10％-20％的菌株產ESBLs。ESBLs的產生使治療更為困難，使得抗菌藥物的選擇範圍更窄。大大減少抗菌藥物的選擇餘地，常導致臨床治療的失敗、感染的復發，並增加死亡的危險性。
自從1915年英國細菌學家Twort和1917法國細菌學家d′Herelle觀察到噬菌體以來，人們對噬菌體的研究日益深入。噬菌體是一類特異的細菌病毒，有毒性噬菌體和溫和噬菌體兩種類型。毒性噬菌體在宿主菌內以複製方式進行增殖，裂解宿主菌。美國、英國、法國、澳大利亞、波蘭、前蘇聯等國有的科學家一直在研究用裂解性的噬菌體來治療細菌感染。前蘇聯，噬菌體製劑被長期大量用於軍隊中腹瀉的控制並取得顯著效果。在東歐國家(如波蘭)及法國，噬菌體作為一種治療感染的手段也被長期使用並有成品製劑在市場出售。
近年來，人們已經注意到產ESBL細菌的檢出率較高，其產生的耐藥性已成為全球性的臨床治療難題，產ESBL細菌感染導致住院時間延長，費用增加及死亡率增高等。在這種嚴峻的情況下，各國也都採取合理使用抗生素、減少抗生素應用的選擇性及盲目性，加強對細菌耐藥率監測，定期通報細菌耐藥情況等措施。但ESBLs由質粒介導可在菌株間轉移和傳播，不易控制醫院交叉感染和院外細菌擴散。ESBLs菌株不但對大部分β-內醯胺類抗生素耐藥，而且也對氨基糖苷類、氟哇諾酮類和磺胺類耐藥。目前臨床對於產ESBL細菌感染，使用β-內醯胺酶抑制劑也可取得一定療效，但腸科桿菌容易對β-內醯胺酶抑制劑產生耐藥。對產ESBL細菌耐藥性分析表明，亞胺培南抗菌作用最強，可作為臨床治療產ESBL細菌感染的首選藥，但是一種新的抗菌藥物在臨床應用後，仍不可避免地面對細菌耐藥性的產生。因此，積極面對產ESBL細菌耐藥性這一世界性難題，將噬菌體應用於產ESBL細菌感染的治療中，有著極為廣闊前景
發明內容本發明人經過廣泛的研究，分離獲得一種寬宿主譜產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882，它能有效地在體內、體外殺滅產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌φ9882。本發明人在進一步研究中發現，該噬菌體能在體內外裂解多株臨床分離產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌，具有較寬的宿主譜。
因而，本發明的一種寬宿主譜產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882，它能夠在體內、體外有效地殺滅臨床分離的產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌。
本發明的第二個目的是公開分離獲得本發明的噬菌體的分離方法。
本發明的第三個目的是證實了寬噬噬菌體作為一種治療性物質應用臨床抗產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌感染治療的優越性及可行性，在臨床抗產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌感染治療開發和應用中可以成為有效的生物製劑。
根據本發明，寬宿主譜產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882在培養皿上可以形成較大的透亮空斑，並且對所收集的30株產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌臨床分離株中的11株有裂解作用，裂解率為36.67％，其所能裂解的臨床分離株如下產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌9716、9719、9539、9853、9854、9860、9882、9730、9739、9914、1068。採用本發明的噬菌體用於小鼠菌血症的治療，在MOI≥0.0001(multiple of infection，感染複數)時可以治癒全部小鼠。即使在延遲3小時治療的情況下(此時小鼠已經出現明顯的全身感染症狀如無活力、捲毛、弓背、眼周膿性滲出物聚集等)仍有20％的療效。體內、體外實驗均證明本發明的噬菌體為一種有效的抗感染物質，具有臨床應用的潛在藥學價值。
分離獲得本發明的噬菌體的過程如下取同濟醫院汙水處理中心處理前汙水1L，加NaCl58g，10,000×g離心10min。取上清，加PEG-8000至終濃度為10％(w/v)，置4 ℃冰箱過夜後在4℃，10，000×g離心20min。用5ml SM Buffer重懸沉澱。等體積氯仿抽提一次。300μl處理後的汙水與200μl過夜培養的產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌φ9882，37℃孵育20min，與3ml熔化頂層瓊脂在於50℃混勻，鋪平皿，冷卻後倒置於37℃過夜培養。次日在培養皿上發現數個大小不等透亮空斑。用tip頭取下其中最大的空斑，溶於2mlLB培養液中，按1∶100的比例向該培養液中加入過夜培養的產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌φ9882，37℃，250轉振搖4.5～5小時。12000轉離心5分鐘，取80％上清4℃保存。取此上清再與產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌φ9882於固體培養基上共培養，用tip挑取較大噬斑。如此反覆3次，即可得到大小均一的噬斑。取出噬斑，按上述方法進行小量擴增，得到液態的噬菌體擴增液。將過夜培養的宿主菌按1∶100稀釋，繼續培養至早期對數生長期。加入前述濃縮噬菌體10μl，繼續培養5h，加入1/10體積的氯仿，繼續振搖10分鐘後，分別加入DNase I及RNase A至終濃度均為1μg/ml，室溫放置30分鐘，離心除去細菌碎片。加1/6體積的PEG/NaCl，4℃過夜。次日，4℃，12,000×g離心20min。用1ml SM Buffer重懸沉澱。加入1/6體積PEG/NaCl再次沉澱，冰上孵育1h，4℃，12,000×g離心20min。用200μl SMBuffer重懸沉澱，即得到擴增的噬菌體，經過反覆擴增可以達到所需的滴度。
本發明的一種寬宿主譜產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882已於2005年5月16日在中國典型微生物保藏中心(中國武漢市，武漢大學，布達佩斯條約保藏單位)保藏，並收到保藏登記號CCTCC NOM205044。
本發明一種寬宿主譜產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882(CCTCC NOM205044)，其具有相對較寬宿主譜。
本發明分離獲得的寬宿主譜產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882的方法。
本發明寬宿主譜產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882的宿主細胞是產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌φ9882，它可作用一種治療性物質用來製備有效的生物製劑。
本發明一種寬宿主譜產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882，其具有體內抗感染效應。
本發明所採用的培養基具有以下組成LB培養基1％tryptone、0.5％Yeast extract和1％NaCl。固體瓊脂1％tryptone、0.5％Yeastextract和1％NaCl及1.5％Agar。頂層瓊脂1％tryptone、0.5％Yeastextract和1％NaCl及0.7％Agarose。SM Buffer由0.1M NaCl，0.01MMgSO4·7H2O，0.05M Tris-HCl(pH7.5)和0.01％gelatin(明膠)配製而成。PEG/NaCl由20％PEG-8000和2.5MNaCl配製而成。
本發明的一種寬宿主譜產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882(CCTCC NOM205044)具有以下微生物學特徵1、形態學特性磷鎢酸負染色電子顯微鏡觀察，電鏡超微結構顯示，此噬菌體為直徑70nm微球形顆粒，稜角不明顯，可見100nm長尾軸(如圖1)。
2、培養學特性本發明的噬菌體株在宿主菌產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌φ9882的固體培養基上可以形成透亮空斑，空斑直徑2-3mm，周圍無暈環。
3、生物學特性本發明的噬菌體株可以快速的吸附於宿主菌產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌φ9882上，在5分鐘內的吸附率達到98％(如圖2)。該噬菌體的一步生長曲線(如圖3)，從中可以看出該噬菌體感染宿主菌的潛伏期為30-40分鐘，平均裂解量為110。潛伏期短，裂解量大，說明該寬噬噬菌體具有很強的裂解效應。
本發明的一種寬宿主譜產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882，能同時裂解臨床分離的11株產超廣譜β-內醯胺酶株大腸桿菌，其寬噬率為36.67％，滴度為8.1×1018pfu/ml。同時寬宿主譜產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882不能裂解金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌，甲型溶血性鏈球菌和乙型溶血性鏈球菌等其它菌屬的菌株。
本發明人已經證實，分離獲得的寬宿主譜產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882在動物實驗(BlAB/c小鼠，雌性，體重為20.0±0.5g)中可以有效地治療產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌φ9853的感染。本發明的一種寬宿主譜產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882能治療小鼠產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌感染，且對易感宿主菌感染有明顯的治療效果。
本發明通過藉助下列實施例將更詳細說明本發明。以下實施例僅是說明性的，應當指出，本發明並不受這些實施例的限制。
圖1φ9882的電鏡照片，該噬菌體呈正多面體的頭部結構，直徑70nm，有尾軸機構。尾軸長100nm。
圖2噬菌體φ9882的吸收曲線，在5分鐘內的吸附率達到98％(如圖2)。
圖3噬菌體φ9882的一步生長曲線，該噬菌體感染宿主菌的潛伏期為30-40分鐘，平均裂解量為110。潛伏期短，裂解量大，說明該噬菌體具有很強的裂解效應。
圖4寬噬噬菌體的篩選以產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌φ9561為宿主菌製成均勻的菌苔，然後在培養皿的背部劃分20個小方格，在格內滴加噬菌體，具有裂解性的噬菌體則可以形成透亮的空斑。
圖5產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌φ9853感染小鼠最小致死量的確定，3×107-1×108CFU的菌液均可以導致全部小鼠死亡，而1×107-2×107CFU的菌液不會引起全部小鼠死亡。因此，3×107CFU為引起小鼠死亡的最小致死量。
圖6最小致死量的精確時相性分析，MLD的菌液經腹腔注射於10隻小鼠，小鼠在8～14小時內死亡。
圖7不同劑量噬菌體治療效果，噬菌體劑量在MOI≥0.0001的情況下全部小鼠均可存活並最終痊癒。
圖8噬菌體延遲治療效果，在延遲40分鐘內的情況下，全部瀕死的小鼠均可治癒。而在延遲治療1小時以上時，由於此時小鼠的狀態較差，已出現明顯的感染症狀如捲毛、弓背、眼周滲出物聚集等，噬菌體的效果有所下降，但仍具有統計學意義(P＜0.01)。
具體實施方式實施例1取同濟醫院汙水處理中心汙水1L，加NaCl58g，10,000×g離心10min。取上清，加PEG-8000至終濃度為10％(w/v)，置4℃冰箱過夜後在4℃，10,000×g離心20min。用5ml SM Buffer重懸沉澱。等體積氯仿抽提一次。300μl處理後的汙水與200μl過夜培養的宿主菌混合，37℃孵育20min，與3ml熔化頂層瓊脂在於50℃混勻，鋪平皿，冷卻後倒置於37℃過夜培養。用tip頭取下其中最大的空斑，溶於2mlLB培養液中，按1∶100的比例向該培養液中加入過夜培養的產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌φ9882，37℃，250轉振搖4.5～5小時。12000轉離心5分鐘，取80％上清4℃保存。取此上清再與產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌φ9882於固體培養基上共培養，用tip挑取較大噬斑。如此反覆3次，即可得到大小均一的噬斑。取此噬斑按前述方法液體擴增，得到濃縮噬菌體液。
實施例2將過夜培養的宿主菌產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌φ9882按1∶100稀釋，繼續培養至早期對數生長期。加入實施例1中的濃縮噬菌體10μl，繼續培養5h，加入1/10體積的氯仿，繼續振搖10分鐘後，分別加入DNase I及RNase A至終濃度均為1μg/ml，室溫放置30分鐘，離心除去細菌碎片。加1/6體積的PEG/NaCl，4℃過夜。次日，4℃，12,000×g離心20min。用1ml SM Buffer重懸沉澱。加入1/6體積PEG/NaCl再次沉澱，冰上孵育1h，4℃，12,000×g離心20min。用200μl SM Buffer重懸沉澱，即得到擴增的噬菌體，經過反覆擴增可以達到所需的滴度。
實施例3用30株稀釋的產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌在LB培養基上製成均勻的菌苔。在該培養基背面劃分16-20個方格並作標記，然後在相應的方格內滴加噬菌體φ9882液，待液滴乾燥後倒置於37℃孵育12-16h，觀察結果(圖4)。可見φ9882在其中的11個菌株上形成噬斑，具體如下1、取100ul過夜生長的細菌培養物，接入10ml培養基的三角燒瓶中，
1、取100ul過夜生長的細菌培養物，接入10ml培養基的三角燒瓶中，37℃振蕩培養2-2.5小時後，經鏡檢計數，細胞可達到108/ml以上，用培養基稀釋，配製成5×107/ml。
2、實驗前一天測定噬菌體效價，按此稀釋配製成5×109PFU/ml。
3、將上述二者在37度水浴中平衡，按MOI＝10將1ml噬菌體液加入9ml3細菌懸液，混合均勻，放回水浴中保溫或振蕩保溫。
4、按一定時間間隔(1-5min)取樣，稀釋1000倍，放在冰中，終止吸附。
5、取稀釋樣品1ml，在Ep管中離心3min或4000rpm離心5min，沉降細菌和吸附噬菌體的細胞。
6、經適當稀釋(10-100倍)後，按雙層瓊脂法測定上清液中的游離噬菌體，培養後記錄。
實施例41、稀釋噬菌體液至5×107PFU/ml。
2、將菌液稀釋成5×107CFU/ml。
3、取20支Ep管，每管加入900ulLB液。
4、取20支Ep管，每管加入200ul菌液。
5、取20支試管，每管加入3ml熔化的頂層膠，在50度水浴箱中保溫。
6、將上述噬菌體液，菌液置37度溫育。
7、取0.1ml噬菌體液加入0.9ml的細菌懸液中，吸附5分鐘。
8、取0.1ml混合液加至9.9ml冰TSBM液，混合均勻後各取1ml至9、取0.1ml重懸液加至9.9mlLB液，37℃振蕩培養，期間分別於第0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100分鐘取0.1ml共培養液與200ul菌液混合，5分鐘後鋪平皿，分別置於37℃培養。由上述各點的噬斑數-時間作曲線(圖3)，可得該噬菌體潛伏期為30-40min，裂解量為112。
實施例5建立全身感染模型培養過夜的產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌φ9853按1∶100的比例稀釋於100ml LB中，繼續培養至早期對數生長期(OD600值約為0.5)，4℃，8000g離心5分鐘，棄上清，將沉澱以等體積滅菌生理鹽水重懸，再次離心，沉澱溶解於5ml生理鹽水中。用生理鹽水系列稀釋的產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌φ9853菌液經腹腔(intraperitoneal，i.p)注射於11組小鼠，導致一組(如無特殊說明，均為5隻/組)小鼠全部死亡的最小劑量為最小致死量(minimal lethal dose，MLD)。系列稀釋的菌液注射於小鼠後，3×107-1×108CFU的菌液均可以導致全部小鼠死亡，而1×107-2×107CFU的菌液不會引起全部小鼠死亡(如圖5)。因此，3×107CFU為引起小鼠死亡的最小致死量。MLD的產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌φ9853菌液經腹腔注射於10隻小鼠，小鼠在8～14小時內死亡(如圖6)。
實施例6不同噬菌體劑量對療效的影響取9組小鼠，用MLD劑量的菌液經一側腹腔注射，立即經另一側腹腔注射不同劑量的噬菌體φ9882製劑(LB稀釋)，其中一組i.p注射LB培養液作為對照。觀測小鼠的健康狀態20天以上。如圖7，噬菌體劑量在MOI≥0.0001的情況下全部小鼠均可存活並最終痊癒。MOI＝0和MOI≥0.0001情況下小鼠生存率存在顯著的統計學差異(P＜0.01)。
實施例7延遲治療效果監測取7組小鼠，均用MLD劑量的菌液感染，並分別於注射後第0，20，40，60，180，360分鐘以500μl較高滴度的噬菌體9882液(MOI＝200)i.p注射，觀測20天以上。每組小鼠均設置相應的對照組(即i.p注射等量的LB培養液)。如圖8，在延遲40分鐘內的情況下，全部小鼠均可免於死亡。而在延遲治療1小時以上時，由於此時小鼠的狀態較差，已出現明顯的感染症狀如捲毛、弓背、眼周滲出物聚集等，噬菌體的效果有所下降，但仍具有統計學意義(P＜0.01)。
權利要求
1.一種寬宿主譜產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882(CCTCC NOM205044)，其具有相對較寬宿主譜。
2.分離獲得到權利要求1所述的寬宿主譜產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882的方法。
3.根據權利要求2所述方法，寬宿主譜產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882的宿主細胞是產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌φ9882，它可作用一種治療性物質用來製備有效的生物製劑。
4.一種寬宿主譜產超廣譜β-內醯胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882，其具有體內抗感染效應。
全文摘要
一種寬宿主譜產超廣譜β－內醯胺酶大腸桿菌噬菌體及其分離獲得方法，本發明涉及一種寬宿主譜產超廣譜β－內醯胺酶(extended－spectrum beta－lactamases，ESBLs)大腸桿菌噬菌體及其分離獲得方法。噬菌體是一類特異的細菌病毒，裂解性噬菌體能使宿主菌裂解、死亡。噬菌體具有嚴格宿主特異性，宿主譜特異性發生突變的寬噬噬菌體能裂解其宿主菌和易感宿主菌，可以利用這一特性治療超廣譜β－內醯胺酶大腸桿菌感染，將寬噬噬菌體製成臨床抗細菌感染的生物製劑。
文檔編號C12N7/01GK1699560SQ20051001892
公開日2005年11月23日 申請日期2005年6月16日 優先權日2005年6月16日
發明者王晶, 胡俊波, 徐敏超, 胡北 申請人:華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院