連接蛋白轉導結構域及輔助蛋白的生物活性蛋白、它的製備方法和應用的製作方法
2023-06-15 01:23:41
專利名稱：連接蛋白轉導結構域及輔助蛋白的生物活性蛋白、它的製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一類融合蛋白(Protein Fusion)及其製備方法和應用。
背景技術：
1、生物活性蛋白的應用及其不足細胞是生命的基本單位，蛋白質參與幾乎所有的生命活動過程，細胞內正常蛋白質的缺失或不足往往會導致細胞的病態和生命活動的異常。雖然基因療法可望通過轉錄和翻譯，補足這些蛋白質，但這種方法可使目標基因高效定位和目標蛋白長期表達的條件還有待於進一步探討。因此把生物活性蛋白從細胞外直接導入細胞內，從而改善細胞的生理狀態的蛋白質療法是一個很有意義的替代方法。
但是，由於分子大小和生化特性的原因，用生物活性蛋白對細胞進行胞內治療時，這些具有治療功能的分子本身難以進入細胞，這使得它們的治療價值受到極大限制[1]。在傳統的實驗和臨床治療上，已有許多方法用於將蛋白質遞送進入活細胞中，這些方法可以分成病毒載體或非病毒載體法兩大類。較之病毒載體法，非病毒遞送策略在生物安全和給藥方便性方面具有很大的優點。非病毒載體法包括顯微注射法，電穿孔法，脂質體法，細菌毒素、紅細胞及受體介導的胞吞作用等；但是這些方法大都效率不高或費時、容易引起細胞死亡或形成胞內小泡而不能使外源蛋白有效地跨膜進入細胞[2]。為此，尋找一種能有效地將外源生物活性蛋白輸入活細胞並使之在細胞內保持活性的方法就顯得相當重要。
2、蛋白轉導結構域(Protein Transduction Domain，PTD)的發現過去幾年有報導指出一些蛋白質以非傳統的內化方式跨膜進入細胞，如基態纖維細胞生長因子bFGF[3]，乳鐵傳遞蛋白[4]，人體免疫缺陷病毒HIV-1的TAT蛋白[5-7]，B型肝炎病毒蛋白PreS2[8]，白介素-1[9]和果蠅觸角足(ANTP)同源異型轉錄因子[10]等。進一步的研究發現，協助這些蛋白質分子跨膜轉運的是一些被稱為蛋白轉導結構域(PTD)的肽片斷(如表1)。
表1TAT、VP22和ANTP的轉導結構域核心區胺基酸序列
通過對這三個蛋白轉導結構域核心區的胺基酸序列進行比較後發現它們都富含鹼性胺基酸(精氨酸和賴氨酸)，這種帶有正電荷的多肽片段可以通過靜電相互吸引的作用結合到細胞膜上，從而促進與之融合的外源蛋白的跨膜遞送。
3、輔助蛋白在融合蛋白中的作用融合蛋白(Fusion Protein)是由兩個或兩個以上連接而不同的蛋白質組成，它由融合基因生成。在宿主細胞中表達融合蛋白時，往往出現表達水平偏低，分離純化困難等問題。在融合蛋白中增加輔助蛋白將有助於提高融合蛋白的表達水平和分離純化效率。另外，輔助蛋白也可以用於提高融合蛋白在細胞內的作用時間，以及調節生物活性蛋白，特別是酶分子的反應產物，從而提高生物活性蛋白的使用效果。
發明內容
本發明的目的之一就是提供一類具有高效跨膜遞送能力的連接蛋白轉導結構域及輔助蛋白的生物活性蛋白。
本發明的目的之二就是提供一類能提高融合蛋白的表達水平和分離純化效率的連接蛋白轉導結構域及輔助蛋白的生物活性蛋白。
本發明的目的之三就是提供一類能提高融合蛋白在細胞內的作用時間，以及調節生物活性蛋白，特別是酶分子的反應產物，從而提高生物活性蛋白的使用效果的連接蛋白轉導結構域及輔助蛋白的生物活性蛋白。
本發明的技術方案如下一種連接蛋白轉導結構域及輔助蛋白的生物活性蛋白，它包括蛋白轉導結構域、生物活性蛋白，其特徵在於它還包括輔助蛋白。
本發明的優點是含有生物活性蛋白的融合蛋白能夠高效跨膜進入細胞內部，從而達到胞內治療的目的。本發明在融合蛋白中增加輔助蛋白將有助於提高融合蛋白的表達水平、分離純化效率和使用效果等。
圖1細胞種類對GST-TAT-GFP和GST-GFP跨膜遞送的影響，四種不同的細胞培養在含500ug/mL GST-TAT-GFP或GST-GFP新鮮的RMPI 1640培養液中，於5％的CO2、37℃培養6h後用螢光分光光度計定量測定螢光值。
圖2、圖3、圖4分別是實驗七的小鼠血清尿酸、乳酸脫氫酶、乳酸含量坐標圖。圖中橫坐標的標註1、2、3、分別代表運動前30分鐘、120分鐘、240分鐘給藥的情況。
具體實施例方式本發明的連接蛋白轉導結構域及輔助蛋白的生物活性蛋白，它包括蛋白轉導結構域、輔助蛋白、生物活性蛋白，三者共價連接，連接發生在沿著生物活性蛋白結構的任何不明顯妨礙生物活性的部位。
本發明的連接蛋白轉導結構域及輔助蛋白的生物活性蛋白可應用於化妝品中，或者將它應用在治療炎症疾患中，或者將它應用在功能食品中。
實施例1用DNA重組技術製備融合蛋白GST-TAT-GFP(GST作為輔助蛋白的穀胱甘肽-S-轉移酶；TATTAT蛋白的蛋白轉導結構域；GFP綠色螢光蛋白)。
用細菌質粒中GFP的編碼基因的5』端引物1和3』端引物2做PCR擴增，在引物1的5』端還含有TAT的編碼序列，這樣可以擴增得到TAT和GFP的融合基因。擴增後的PCR產物經酶切和電泳回收後，插入質粒pGEX的多克隆位點，構建表達質粒pTAT-GFP，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，酶切鑑定篩選陽性克隆作為表達菌株。
挑取陽性單菌落接種於含氨苄青黴素的LB培養基，37℃生長約2h後，OD600達0.6左右，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，30℃誘導4h，離心收集菌體。從超聲波破碎的細胞破碎液中回收得到GST-TAT-GFP。
實驗一本實驗說明融合蛋白GST-TAT-GFP(GST輔助蛋白穀胱甘肽-S-轉移酶；TATTAT蛋白的蛋白轉導結構域；GFP綠色螢光蛋白)中的TAT能提高生物活性蛋白GFP的跨膜遞送作用。
1.不同細胞實驗結果本實驗研究了融合蛋白GST-TAT-GFP對L-02、SMMC-7721、Hela和BEL-7402細胞跨膜遞送作用。500μg/mL的融合蛋白與這些不同種類的細胞分別保溫6h後，四種細胞在螢光顯微鏡下都呈現明亮的綠色，雖然它們的螢光強度稍微有所差別。而用對照的不含TAT的融合蛋白GST-GFP處理的四種細胞在螢光顯微鏡下只能看到細胞的背景色，沒有螢光出現，即使把保溫時間延長至24h也無法看到螢光。
用螢光分光光度計定量測定這些細胞的螢光強度(圖1)，發現GST-TAT-GFP實驗組的細胞的螢光強度達到未處理細胞的25倍以上，而對照的不含TAT的融合蛋白GST-GFP的實驗組的細胞的螢光強度與未處理細胞沒有太大的區別。以上結果表明TAT能夠提高GFP的跨膜進入不同細胞的能力。
2.進入線蟲實驗通過融合蛋白GST-Tat-GFP(12μM)對線蟲的餵食，研究該蛋白在活體內的跨膜遞送。結果不僅線蟲的整個消化管內有較強的綠色螢光，在原體腔也充滿融合的螢光蛋白；且隨著餵食時間(1h、3h、6h)的延長，觀察到的綠色螢光逐漸增強。線蟲體內的螢光強度與蛋白濃度(3μM、6μM、12μM)存在正相關關係；而對照的不含TAT的融合蛋白GST-GFP的實驗組的線蟲體內的綠色螢光只有些許的增加。以上實驗說明TAT能夠促進生物活性蛋白GFP跨膜進入線蟲體內。
3.小鼠皮膚塗抹實驗皮膚是機體與自然界之間的第一道屏障，其主要功能是保護作用，防止環境有害物質的入侵以及自身體液的丟失。本實驗採用將小鼠腹部皮膚的冷凍切片直接置於螢光顯微鏡下觀察的方法考察融合蛋白GST-Tat-GFP跨膜遞送進入皮膚的情況。結果發現，深入真皮層的由內層的上皮細胞與外層的結締組織構成的整個毛囊可見明顯且分布均勻的綠色螢光，而陰性對照GST-GFP沒有表現出跨膜效果。由此可見，TAT有助於GST-Tat-GFP通過皮膚塗抹進入小鼠的皮膚。
4、小鼠腹腔注射實驗本實驗用融合蛋白GST-Tat-GFP探討其在小鼠體內組織的遞送情況。按照10mg/kg(蛋白/鼠)的量施以腹腔注射，17h後解剖取出組織，製成冷凍切片，同樣可在螢光顯微鏡下觀察到其心、肝、腎組織切片均有較強的綠色螢光，且在組織中分布均勻，而陰性對照蛋白GST-GFP未觀察到任何螢光。此外，在腦組織中也觀察到綠色螢光，說明該融合蛋白成功地跨越了血腦屏障(BBB)。BBB主要由血管內皮細胞和腦組織的星狀膠質細胞的足突構成，內皮細胞間的緊密連接和缺乏內吞囊泡的特點，限制了血與腦之間物質的交換，在生理狀態下其防止血液中有害物質對腦功能的影響；然而在病理情況下卻影響由於有治療作用的蛋白多肽或化學藥物受其限制無法通過。該體內實驗證明了融合蛋白GST-Tat-GFP實現跨膜進入體內包括腦部組織在內的各個組織。
實驗二本實驗說明融合蛋白GST-TAT-SOD(GST輔助蛋白穀胱甘肽-S-轉移酶；TATTAT蛋白的蛋白轉導結構域，SOD超氧化物歧化酶)中TAT提高生物活性蛋白SOD的跨膜遞送作用。
為了研究TAT介導的SOD跨膜進入不同細胞的效率，本實驗將融合蛋白GST-TAT-SOD與GST-SOD(對照蛋白)加入不同種類細胞(L-02、BEL-7402和Hela)的培養基中進行跨膜轉導實驗，融合蛋白的終濃度均為500μg/mL。溫育4h後，測定細胞裂解液中的SOD酶活。結果發現，與細胞空白對照以及用GST-SOD處理的細胞比較，GST-TAT-SOD顯示出很高的跨膜遞送活性，細胞內的SOD活力提高了200％以上。
實驗三本實驗說明融合蛋白GST-TAT-GFP(GST輔助蛋白穀胱甘肽-S-轉移酶，TATTAT蛋白的蛋白轉導結構域，GFP綠色螢光蛋白)中GST提高生物活性蛋白GFP的可溶性表達。
離心收集實施例1所述大量誘導的菌液，冰浴條件下超聲波破碎菌體細胞後高速離心，結果上清呈亮綠色；SDS-PAGE電泳法檢測發現約95％的融合蛋白GST-TAT-GFP呈可溶狀態；同樣的製備方法生產不含GST的融合蛋白TAT-GFP，SDS-PAGE電泳法檢測發現只有少於5％的融合蛋白TAT-GFP呈可溶狀態，其菌液的超聲波破碎上清基本看不到綠色。
實驗四本實驗說明融合蛋白TAT-SOD-CAT(TATTAT蛋白的蛋白轉導結構域；SOD超氧化物歧化酶；CATCatalase，過氧化氫酶)中CAT通過分解生物活性蛋白SOD的反應產物---過氧化氫，從而進一步改善SOD的生物活性。
在產生超氧化物自由基的黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶反應體系中，加入融合蛋白TAT-SOD-CAT與TAT-SOD(對照蛋白)。37℃保持10分鐘後，用EPR(Electron paramagneticResonance)法測定反應體系中的超氧化物自由基。結果發現，與不含融合蛋白的磷酸緩衝液相比，TAT-SOD-CAT不但能夠100％消除超氧陰離子自由基O2-，而且100％消除羥基自由基OH-；而TAT-SOD只能100％消除O2-，減少的OH-只達到50％。
實驗五本實驗說明融合蛋白GST-TAT-SOD(TATTAT蛋白的蛋白轉導結構域，SOD超氧化物歧化酶)作為面霜有效成分在化妝品中的應用。
1、面霜處方硬脂酸130g，液體石蠟200g，石蠟130g，三乙醇胺30g，甘油100g，SOD2×105U，蒸餾水加至1000g。
2、面霜的製備取硬脂酸、液體石蠟和石蠟加熱至80℃(油相)；另取三乙醇胺、甘油及蒸餾水亦加熱至80℃(水相)。在攪拌下將水相緩緩加入80℃油相中，待乳化完全後，停止加熱，攪拌至近凝，即得乳膏基質。取乳膏基質適量，每克加入200SOD活力單位的GST-TAT-SOD研勻，再分次加入乳膏基質至全量，研勻即得GST-TAT-SOD面霜。
3、使用方法用藥前先用溫水把臉洗乾淨，然後塗抹上適量GST-TAT-SOD面霜(存放於冰箱內或陰涼處)，每日擦2次。
4、評定方法每天隨訪一次，一周後評定效果。皮膚生理失調消失或部分消失為有效；不消失為無效。
5、結果附表1 GST-TAT-SOD霜劑的療效統計
以上結果表明，加入GST-TAT-SOD融合蛋白的化妝品，對美白除斑，去除皺紋、青春痘和疤痕等美化皮膚、治療皮膚受損和調整皮膚失調方面具有顯著療效。
實驗六本實驗說明融合蛋白GST-TAT-SOD(TATTAT蛋白的蛋白轉導結構域，SOD超氧化物歧化酶)在調整類風溼性關節炎、過敏性皮炎、腱鞘炎等炎症疾病中的應用。
對附表2所列各種由類風溼或其它原因引起的關節炎等炎症疾病，使用GST-TAT-SOD藥用霜劑(每克乳劑含1000U超氧化物歧化酶活性)進行治療，每日擦1～3次，視各人疼痛情況而定。用藥前先做熱敷或輕輕拍打病灶部位致微熱發紅，然後塗抹上適量GST-TAT-SOD霜劑(保存於4度冰箱內或陰涼處)，每天觀察一次，一周後評定效果如附表2。
附表2跨膜SOD霜劑對關節、肌肉疼痛的療效統計
備註減輕或消除病灶部分疼痛為有效；否則無效。
實驗七本實驗說明融合蛋白GST-TAT-SOD可應用於防止運動過度造成的肌肉疲勞、氧化破壞等生理失調的功能食品。
1.實驗動物成年昆明種雄性小鼠，體重18-22克。
2.實驗步驟無負重遊泳至衰竭，撈起後分別經口給予GST-TAT-SOD後30，120，240分鐘，置小鼠在遊泳箱中遊泳，水深40釐米，水溫25攝氏度，鼠尾根部負重5％體重的鉛皮。負重遊泳5分鐘後每組取12隻小鼠吹乾拔眼珠取血。
3.檢測項目血乳酸、乳酸脫氫酶、尿酸。
4.結果判定 統計結果採用方差分析，檢測各項目結果顯示有利於減少疲勞，且差異有顯著性(P＜0.05)，可判定該受試物有抗疲勞效果。
實驗結論GST-TAT-SOD有明顯降低血液尿酸和乳酸水平，提高血清乳酸脫氫酶水平，具有顯著的抗疲勞作用，且最佳給藥時間為運動前240分鐘。
參考資料1.Egleton RD，Davis TP.Bioavailability and transport of peptides and peptide druges into thebrain.Peptides，1997，18(9)1431-1439.
2.陳亞兵，溫龍平，Tat介導外源蛋白引入活細胞，國外醫學免疫學分冊，1996年，第5期，243頁。
3.Sosnowski BA，Gonzalez AM，Chandler LA，et al.Targeting DNA to cells with basic fibroblastgrowth factor(FGF2).J Biol Chem，1996，27133647-33653.
4.He J，Furmanski P.Sequence specificity and transcriptional activation in the binding oflactoferrin to DNA.Nature，1995，373721-724.
5.Frankel AD，Pabo CO.Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus.Cell，1988，55(6)1189-1193.
6.Green M，Loewenstein PM.Autonomous functional domains of chemically synthesized humanimmunodeficiency virus Tat trans-activator protein.Cell，1988，551179-1188.
7.Silhol M，Tyagi M，Giacca M，et al.Different mechanisms for cellular internalization of theHIV-1 Tat-derived cell penetrating peptide and recombinant proteins fused to Tat.Eur JBiochem 2002、269494-501.
8.Oess S，Hildt E.Novel cell permeable motif derived from the PreS2-domain of hepatitis-Bvirus surface antigens.Gene Ther.2000，7750-758.
9.Rubartelli A，Cozzolino F，Talio M，et al.A novel secretory pathway for interleukin-1 beta，aprotein lacking a sinal sequence.EMBO J.1990，91503-1510.
10.Derossi D，Joliot AH，Chassaing G，et al.The third helix of the Antennapedia homeodomaintranslocates through biological membranes.J Biol Chem，1994，26910444-10450.
權利要求
1.一類連接蛋白轉導結構域及輔助蛋白的生物活性蛋白，它包括蛋白轉導結構域、生物活性蛋白，其特徵在於它還包括輔助蛋白。
2.根據權利要求1所述的連接蛋白轉導結構域及輔助蛋白的生物活性蛋白，其特徵在於所述的蛋白轉導結構域、生物活性蛋白和輔助蛋白三者共價連接，連接發生在沿著生物活性蛋白結構的任何不明顯妨礙生物活性的部位。
3.根據權利要求2所述的連接蛋白轉導結構域及輔助蛋白的生物活性蛋白，其特徵在於所述的連接蛋白轉導結構域及輔助蛋白的生物活性蛋白是GST-TAT-SOD融合蛋白。
4.根據權利要求1或2或3所述的連接蛋白轉導結構域及輔助蛋白的生物活性蛋白的製備方法，其特徵在於用DNA重組技術製備融合基因，然後在轉化的陽性菌株中表達並製備融合蛋白。
5.根據權利要求1或2或3所述的融合有蛋白轉導結構域和輔助蛋白的生物活性蛋白的應用，其特徵在於將它應用在化妝品中。
6.根據權利要求1或2或3所述的連接蛋白轉導結構域及輔助蛋白的生物活性蛋白的應用，其特徵在於將它應用在治療炎症疾患中。
7.根據權利要求1或2或3所述的連接蛋白轉導結構域及輔助蛋白的生物活性蛋白的應用，其特徵在於將它應用在功能食品中。
8.根據權利要求3所述的連接蛋白轉導結構域及輔助蛋白的生物活性蛋白的應用，其特徵在於將所述的GST-TAT-SOD融合蛋白應用在化妝品中。
9.根據權利要求3所述的連接蛋白轉導結構域及輔助蛋白的生物活性蛋白的應用，其特徵在於將所述的GST-TAT-SOD融合蛋白應用在治療炎症疾患中。
10.根據權利要求3所述的連接蛋白轉導結構域及輔助蛋白的生物活性蛋白的應用，其特徵在於將所述的GST-TAT-SOD融合蛋白應用在功能食品中。
全文摘要
一類連接蛋白轉導結構域和輔助蛋白的生物活性蛋白及其應用。它解決了生物活性蛋白分子跨膜進入細胞的問題；它包括蛋白轉導結構域、輔助蛋白和生物活性蛋白。輔助蛋白用於改善融合蛋白的表達水平、分離純化、熱穩定性和在細胞內的半衰期，以及調節生物活性蛋白，特別是酶分子的反應產物，從而提高生物活性蛋白的使用效果等。它可用作化妝品、炎症疾患和功能食品的有效成分。例如，GST、TAT、SOD融合蛋白可廣泛用於美白、消除青春痘、疤痕、皺紋等調整皮膚失調方面，並可用於外部皮膚的局部應用和許多膚發疾病的治療，具有防曬、抗輻射、增白、防皺、消炎和延緩衰老的功效；亦可用於調整關節炎等疑難病症。
文檔編號A23L1/305GK1712415SQ20051001875
公開日2005年12月28日 申請日期2005年5月20日 優先權日2005年5月20日
發明者劉樹滔, 饒平凡 申請人:福州大學