豬細小病毒vp2親和肽及其編碼核苷酸的製作方法
2023-06-15 08:47:26
專利名稱：豬細小病毒vp2親和肽及其編碼核苷酸的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種豬細小病毒VP2親和肽及其編碼核苷酸，屬於生物技術領域。
背景技術：
卩遼菌體表面展不技術(phagedisplay random peptide library)是20世紀80年代發展起來的利用噬菌體表達外源基因的一項分子生物學新技術。噬菌體展示技術所選用的噬菌體載體是絲狀噬菌體，包括Π，fd和M13噬菌體，其中M13噬菌體最為常用。這類單鏈環狀DNA病毒顆粒的噬菌體，編碼11種蛋白質，pII1、pV1、pVI1、pVII1、pIX為其衣殼結構蛋白，其中PVIII蛋白為主要衣殼蛋白，構成噬菌體的管狀結構，呈螺旋對稱排列，pill和PVII蛋白位於噬菌體外殼的尾端，是噬菌體吸附宿主菌的結構。目前大多數基於VP2的研究主要集中在PPV診斷和免疫方面；關於VP2在PPV感染過程中的作用機理研究方面的資料較少。目前豬細小病毒病在我國感染十分嚴重，陽性率可達90%以上，給養豬業造成了巨大的經濟損失。PPV VP2是構成衣殼蛋白的主要成分，其編碼的多肽能自我裝配成類病毒粒子，具有很強的免疫原性，是防治細小病毒病的主要蛋白。基於傳統疫苗的一些弊端，人工設計合成多肽疫苗將成為可能。噬菌體展示技術在新型疫苗研製上具有獨特的優勢，一是:噬菌體所展示的抗原表位能保持一定的空間構象，能有效刺激幾天產生免疫應答；二是:噬菌體本身既可以做為載體，又可作為良好的免疫佐劑，能增強免疫效果。同時，噬菌體展示肽庫技術對淘選PPV的抗原表位，研究豬細小病毒表面分子及其結合的受體，以及病毒侵入宿主細胞的分子機制，研製更有效的抗細小病毒的藥物具有重要意義。1985年，Smith第一次證實絲狀噬菌體fd基因組可以通過基因工程手段，將目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面。其基本原理為:選擇合適的噬菌體為載體，利用基因工程技術將 外源基因克隆到其載體上，同時將外源基因編碼的融合蛋白在噬菌體顆粒表面展示出來，被展示的多肽保持相對獨立的空間結構和生物活性，有利於受體的識別和結合，從而組成含有多種短肽的庫。外源蛋白或多肽的基因型和表現型的對應關係。噬菌體展示技術將基因表達與親和選擇相結合，其過程是將目的蛋白吸附於固相載體上，如酶標板或顆粒物質。原始肽庫噬菌體與靶分子短時間孵育，洗去未結合的噬菌體，然後用特定的洗脫液將與靶蛋白特異性結合的噬菌體洗脫下來。擴增洗脫後的噬菌體，然後進行下一輪淘選，經過3 4循環的「吸附-洗脫-擴增」後，最終得到高度富集與靶蛋白結合的序列，然後通過酶聯免疫吸附試驗進一步鑑定篩選，獲取真正的目的克隆，通過測定DNA序列，推導其胺基酸序列。最後合成多肽進一步研究其生物活性。
發明內容
本發明的目的在於通過噬菌體展示肽庫技術淘選PPV的抗原表位，提供一種豬細小病毒VP2親和肽A和B及其編碼核苷酸。本發明的目的通過下述技術方案實現:
1、一種豬細小病毒VP2親和肽A，胺基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。2、如上所述的一種豬細小病毒VP2親和肽A的核苷酸，核苷酸序列如序列表SEQID N0.2 所示。3、另外一種豬細小病毒VP2親和肽B，胺基酸序列如序列表SEQ ID N0.3所示。4、如上所述的一種豬細小病毒VP2親和肽B的核苷酸，核苷酸序列如序列表SEQID N0.4 所示。5、一種VP2序列的的擴增引物VP2-3和VP2-4，核苷酸序列為:VP2-3:5』 -GGGGATCCATGAGTGAAAATGTGGAA-3』 ；VP2-4: 5，-CCCCGTCGACTTAGTATAATTTTCTTGG-3，。本研究相對於現有技術，有如下有點及有益效果:利用噬菌體隨機十二肽庫技術淘選出了與VP2蛋白特異性結合的多肽。人工合成此短肽，對防治豬細小病毒病提供了一定的理論基礎和試驗依據。在此基礎上我們擬利用病毒學實驗技術分析並特性鑑定的多肽在細小病毒感染周期中的作用，為PPV感染和致病機理的研究提供重要理論依據，也為尋找PPV VP2抗原表位及病毒侵入細胞機制提供了重要的理論依據。本發明的多肽由於分子量較小，易穿透進入組織，比大蛋白滲透能力更強；半衰期短，在組織中蓄積很少(減少其代謝物引起併發症的風險)；結構穩定且生產成本較低。
圖1是VP2基因的PCR擴增結果；其中M是Marker，I是VP2 基因的擴增片段，2是陰性對照；圖2是pET32a_VP2重組表達載體的PCR鑑定結果，I是VP2基因的擴增片段；圖3是pET32a_VP2重組表達載體的雙酶切鑑定結果，I是BamH I和Sal I雙酶切
結果;圖4是VP2融合蛋白的SDS-PAGE電泳圖；其中M:低蛋白質標準分子量；1:空載體菌液；2:未誘導菌液；3 1:誘導I 5h的重組菌；8:超聲破碎後菌體沉澱；9:菌體上清；圖5是噬菌體結合克隆模板DNA的純化結果；其中M:DL8000DNA Marker ; I 10:分別對應I 10噬菌體結合克隆模板DNA的純化；圖6是噬菌體PCR純化產物圖；其中M:DL8000DNA Marker ;1 10:分別對應I 10噬菌體PCR擴增產物；圖7是噬菌體結合克隆的ELISA檢測結果(0D490)；圖8是MTT法體外檢測多肽抑制效果，A為多肽對PPV抑制的MTT結果，B為多肽對PPV感染細胞的抑制率；圖9是間接免疫螢光體外檢測多肽抑制效果，ST細胞對照(A)，100TCID50PPV對照(B)，I 號肽 +PPV (C)，2 號肽 +PPV (D)，1+2 號肽 +PPV (E、F)；
具體實施例方式本發明設計一對引物，擴增得到PPV VP2基因片段，構建重組質粒VP2_pET32a經IPTG誘導，在E.coli Rosetta中進行高效表達。以VP2蛋白為靶分子，利用噬菌體隨即十二肽庫，對VP2重組蛋白進行了五輪生物淘選，最終篩選出6種親和力的十二肽。將親和力最高和重複性最好的2個序列合成十二肽，通過MTT法和免疫螢光試驗檢測合成肽體外抗病毒活性良好。本研究結果為尋找PPV受體奠定了基礎，為今後對PPV的防治及多肽疫苗的研製開發提供了一定的理論基礎和試驗依據。 實施例一 重組表達質粒pET32a_VP2的構建
(I) VP2序列的擴增(a)根據細菌偏愛的密碼子，設計引物VP2-3和VP2-4VP2-3:5』 -GGGGATCCATGAGTGAAAATGTGGAA-3，(劃橫線處表示引入的酶切位點為BamHI)VP2-4:5』 -CCCCGTCGACTTAGTATAATTTTCTTGG-3』 (劃橫線處表示引入的酶切位點為 Sail)(b)進行常規鏈式聚合酶反應擴增VP2基因以VP2-3和VP2-4為引物，以VP2-T-6為模板，以ExTaq聚合酶進行PCR，VP2的PCR反應條件:50iil體系中含有所述PCR反應體系為50 ii L，包括5 ii LlOXEasyTaq Buffer、4u L dNTP、I u L VP2-3、I u L VP2_4、0.5u L VP2-T_6、0.5u L ExTaq聚合酶，加無菌水補至50 u L0將混合液在所述的PCR檢測的反應程序為:95°C預變性5min ;94°C變性Imin ；56°C退火Imin ;72°C延伸2min ;反應進行30個循環；最後72°C再延伸15min。得到VP2序列PCR產物用I %的瓊脂糖凝膠電泳進行分析，在1740bp附近存在單一的目標條帶，結果如圖1，表明實驗獲得了與預期相符的特異DNA片段即VP2基因。(2)重組表達質粒pET32a_VP2的構建將膠純化回收後VP2PCR產物即進行BamH I和SalI雙酶切，膠純化回收後，與經同樣酶切回收的質粒pET32a體外連接，構建重組表達質粒pET32a-VP2。轉化入大腸桿菌感受態JM109中，37°C培養過夜，Amp+篩選陽性克隆子。實施例二重組表達質粒pET32a_VP2的PCR及酶切鑑定挑選陽性克隆子，抽提質粒pET32a_VP2，以VP2-3和VP2-4為引物進行PCR鑑定，並BamH I和Sal I雙酶切，產物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，位置與預測一致。結果如圖2，表明VP2基因成功連接入pET32a載體中。實施例三誘導表達產物的SDS-PAGE分析將鑑定正確的重組質粒pET32a_VP2轉化E.coli Rosetta (DE3)感受態細胞，加入IPTG使終濃度為0.6mmol/L，37°C振蕩培養。處理試驗樣品，進行SDS-PAGE電泳分析。結果如圖4。實施例四噬菌體隨機十二肽庫對VP2蛋白親和配體的生物淘選及擴增根據本實驗室成熟的噬菌體淘選技術，用噬菌體隨機十二肽庫，對靶分子VP2蛋白進行5輪生物淘選。(I)第一輪生物淘選(a) VP2重組蛋白通過0.22 —次性濾器過濾除菌，並測定其濃度，用包被液(0.lmol/L NaHCO3 pH8.6)將VP2蛋白稀釋至IOOy g/mL。以下操作均無菌進行，使用滅菌槍頭。(b)ELISA板於紫外燈下照射滅菌30min，每孔加入150iiL VP2蛋白稀釋液。4°C包被過夜。(c)甩掉包被液，倒扣於乾淨的紙巾上拍打幾次，以除去殘餘液體。每孔加入2001^封阻液，41:放置4h。(d) TBST (TBS+0.1 % [v/v] Tween-20)緩衝液洗板 6 次，每次旋轉 ELISA 板使孔的底部及邊緣均被洗到，棄去緩衝液，乾淨紙巾上拍甩幾次以除去殘餘液體。洗滌過程操作要快，以避免板乾燥。 (e) I U L噬菌體十二肽原始文庫加入99 ii L的TBS緩衝液，混勻，加入酶標板孔中，室溫間隔慢搖40min,即慢搖IOmin,停止IOmin,依次進行40min。(f)棄液，倒置於乾淨的紙巾上拍打幾次除去殘液。0.1 % TBST洗滌10次，每次甩拍均換乾淨的紙巾防止交叉汙染。(g)加入洗脫液(0.2mol/L Glycine-HCl pH2.2) 100 u L，室溫慢搖 30min，然後將洗脫液移入無菌微量EP管中，加入中和液(lmol/L Tris-HCl pH9.1) 15 y L以中和洗脫液，即為噬菌體第一輪淘選洗脫物，4 0C保存。(h)測定第一輪淘選洗脫物的滴度。(2)第一輪淘選洗脫物的擴增(a)取IOy L第一輪的噬菌體洗脫物，做KT1-KT5稀釋，測定第一輪洗脫的滴度。(b)E.coli ER2 738按1: 100比例接種Low-LB液體培養基(含1%。四環素)中，37 0C 200rpm 搖床培養 5h。(c)取第一輪洗脫物50 ii L和新活化的E.coli ER273820 u L加入到20mLLow_LB培養物中，37 °C搖床培養4.5h。(d)將培養物分裝IOmL離心管中，4°C、IOOOOrpm離心lOmin。取上清的上部80%轉入一新鮮管中，加入1/6體積PEG8000/NaCl混勻。4°C噬菌體沉降過夜。(e)4°C、IOOOOrpm離心15min。棄去上清液,短暫離心,吸去殘留液體。(f)取ImL TBS重懸沉澱物，懸液移入微量EP管中，4°C、IOOOOrpm離心5min，除去殘餘沉澱物。然後將上清轉入另一無菌微量EP管中，加入1/6體積的PEG8000/NaCl，4°C沉降 60min。(g) 4°C、IOOOOrpm離心IOmin,棄去上清,短暫離心，用微量移液器吸去殘餘液體。用200 ii LTBS重懸沉澱物，4°C、IOOOOrpm離心lmin，除去殘留的不容物沉澱。上清轉入滅菌微量EP管中，即為擴增產物。(h)取10 ii L擴增物做10_8_10_12稀釋，LB/IPTG/Xgal平板測定第一輪淘選擴增物的滴度。(3)第二、三輪生物淘選及洗脫物的擴增同上(4)第四輪篩選除去pET_32a標籤蛋白pET_32a標籤蛋白為靶分子，包被ELISA板IOii g/100ii 1，噬菌體與pET_32a標籤蛋白作用後，收穫上清即為第四輪淘選洗脫物，通過此過程除去與標籤蛋白結合的噬菌體，得到只於VP2蛋白特異性結合的噬菌體(5)第五輪生物淘選
噬菌體第五輪淘選。靶蛋白的包被量為4yg/孔，此步得到的終產物即為第五輪的洗脫物，將其做10_2 10_8稀釋，在LB/IPTG/Xgal平板上測定第五輪洗脫物的滴度，4°C避光保存總數不到100個噬菌斑的平板。表I噬菌體淘洗產物滴度pfu測定
權利要求
1.一種豬細小病毒VP2親和肽A，其特徵在於，胺基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。
2.一種編碼如權利要求1所述的一種豬細小病毒VP2親和肽A的核苷酸，其特徵在於，核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
3.一種豬細小病毒VP2親和肽B，其特徵在於:胺基酸序列如序列表SEQ ID N0.3所/Jn o
4.一種編碼如權利要求3所述的一種豬細小病毒VP2親和肽B的核苷酸，其特徵在於，核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.4所示。
5.一種VP2序列的的擴增引物VP2-3和VP2-4，其特徵在於，核苷酸序列為:VP2-3:5』 -GGGGATCCATGAGTGAAAATGTGGAA-3』 ；VP2-4:5』 -CCCCGTCGACTTAGTATAATTTTCTTGG-3』。
全文摘要
本發明涉及一種豬細小病毒VP2親和肽A和B及其編碼核苷酸，豬細小病毒VP2親和肽A，胺基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。豬細小病毒VP2親和肽B，胺基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。還涉及到一對引物VP2-3和VP2-4的核苷酸序列。本發明的多肽由於分子量較小，易穿透進入組織，比大蛋白滲透能力更強；半衰期短，在組織中蓄積很少；結構穩定且生產成本較低。
文檔編號C12N15/35GK103145804SQ201310028148
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月25日 優先權日2013年1月25日
發明者任曉峰, 朱衛娟, 斯琴高娃, 任玉東, 李廣興 申請人:東北農業大學