多價重組人乳頭瘤病毒疫苗及其應用的製作方法

2023-06-15 00:48:26

專利名稱：多價重組人乳頭瘤病毒疫苗及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及人乳頭瘤病毒感染的預防和治療領域。具體地，本發明涉及多價重組 人乳頭瘤病毒疫苗及其應用。
背景技術：
子宮頸癌(Cervical Cancer)每年直接造成約超過30萬成年女性死亡(國際衛 生組織資料)，成為世界範圍內僅次於乳腺癌的威脅婦女生命健康的第二號殺手。科學研究 證實，導致宮頸癌的罪魁禍首是一種名為人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus，簡稱HPV) 的DNA致癌病毒。該病毒主要通過兩性接觸傳染，專性侵染人體上皮細胞特別是生殖器官， 部分病毒攜帶者在反覆感染後表現出多種臨床症狀。女性受高危險型(HPV16、HPV18等) 病毒感染後，小部分患者由最初的宮頸細胞學異常，發展成I-III的宮頸內皮細胞瘤樣變 (CINI-III)和浸潤性宮頸癌變(ICC)，最終發展成致命的子宮頸癌。部分低危險型(HPV6、 HPVl 1)病毒感染可導致男女兩性生殖器官部位的尖銳溼疣。最新研究表明HPV除了直接導致宮頸癌，還與支氣管肺癌、直腸癌、口腔癌和皮膚 癌有重大關係。根據國際衛生組織WHO的有關資料，除了導致宮頸癌，HPV感染還可能解釋 60 %的皮膚癌，60 %的食管癌，50 %的肺癌、50 %的乳腺癌、25 %的口腔癌等人類重大癌症。HPV病毒在長期的進化中形成了上百種變異類型，其中HPV16、HPV18等13種高危 險型確認能夠導致宮頸癌症。HPV6、HPVll等低危險型是造成男女生殖部位尖銳溼疣的關 鍵病原體。根據《Vaccine》專刊增刊(25S(2007)C27-C219)中關於中國HPV類型分布頻率 的報導，HPV58是僅次於HPV16和HPV18的分布最廣的類型。全球除亞洲以外HPV 58的平 均分布頻率低於2%。但在亞洲，特別是中國，HPV 58在子宮頸癌患者中的分布頻率高達 7. 1%，在高等級傷害患者中的分布頻率甚至高達13. 1%。因此，研製多價重組人乳頭瘤病 毒疫苗刻不容緩。

發明內容
(一)要解決的技術問題本發明的目的之一是提供多價重組人乳頭瘤病毒疫苗；本發明的另一目的是提供 該重組人乳頭瘤病毒疫苗在製備藥物中的應用。( 二 )技術方案本發明所述一種多價重組人乳頭瘤病毒疫苗，它由活性成分和藥物學上可接受的 輔料組成，所述的活性成分包括至少一種重組HPV型的Ll蛋白五聚體和/或以五聚體為基 本單元組成的多聚體。其中，所述的以五聚體為基本單元組成的多聚體包括五聚體，十二五聚體(T = 1， 二十面體)、三十六五聚體(τ = 3，二十面體)、四十八五聚體(T = 4，二十面體)、七十二五 聚體(T = 7，二十面體)和其他具有生物活性的Ll蛋白聚合形式。
定義十二五聚體表示十二個五聚體自發聚合而成的多聚體。三十六五聚體、 四十八五聚體、七十二五聚體的定義依此類推。T表示三角可分體(Triangular division)數目。當T = 1時，表示只能有十二個 五聚體自發聚合而成多聚體。T = 3，T = 4，T = 7的定義依此類推。所述的HPV型包括流行病學意義上的HPV高危險型和低危險型。優選地，所述的HPV型指HPV16，得到重組HPV16疫苗；優選地，所述的HPV型指HPV16、HPV18，得到HPV16、HPV18 二價重組子宮頸癌疫苗。優選地，所述的HPV型指HPV6、HPV11，得到HPV6、HPVll 二價重組尖銳溼疣疫苗。優選地，所述的HPV 型指 HPV16、HPV18、HPV6、HPV11，得到 HPV16、HPV18、HPV6、 HPVll四價重組疫苗。更優選地，所述的HPV型指昍￥16、昍￥18、昍￥6、昍￥11、昍￥33，得到HPV16、HPV18、 HPV6, HPVlU HPV33五價重組疫苗。最優選地，所述的HPV型指昍￥16、昍￥18、昍￥6、昍￥11、昍￥58，得到HPV16、HPV18、 HPV6、HPV11、HPV58五價重組疫苗。所述輔料包括但不限於佐劑、賦型劑、穩定劑。其中，所述佐劑選自鋁鹽、3-0-去 醯化單磷酸類脂、脂質A衍生物中的一種或多種，所述穩定劑選自基於磷酸鹽的生理緩衝 液中的一種或多種，所述賦型劑選自生理鹽水及其它藥物上可接受的賦型劑中的一種或多 種。所述每種HPV型的Ll蛋白五聚體和/或以五聚體為基本單元組成的多聚體的含 量均為10-200 μ g/支疫苗。本發明還提供了一種生產上述疫苗的方法，它包括如下步驟(1)表達、分離、純化所需要的重組HPV型的Ll蛋白五聚體和/或以五聚體為基本 單元組成的多聚體；(2)將所得Ll蛋白五聚體和/或以五聚體為基本單元組成的多聚體與輔料混合制 劑，得到多價重組人乳頭瘤病毒疫苗。其中，表達、分離、純化重組HPV的Ll蛋白多聚體的方法參見專利PCT/ CN2008/000314, CN200810055700. 5，得到純度均為95%以上的Ll蛋白多聚體。本發明公開了上述疫苗在製備用於預防和/或治療由HPV引起的感染和疾病的藥 物中的應用。優選地，所述的感染和疾病包括子宮頸癌、尖銳溼疣、乳腺癌、支氣管肺癌、直腸 癌、食道癌、咽癌、口腔癌、皮膚癌及其它與HPV密切相關的疾病。更優選地，所述的感染和 疾病是尖銳溼疣和子宮頸癌。本發明所述的疫苗可採用多種方法作用於人體，包括肌肉和皮下注射。該疫苗在 能引發對Ll蛋白免疫反應的有效劑量範圍內使用。用於增強免疫反應的複合物的特定劑 量依照Ll複合物不同而變化。一般而言，Ll蛋白多聚體的用量在1_20μ g/Kg體重之間。 上述劑量範圍並不排除更高或更低劑量的可能。例如，具體的劑量會根據是否伴隨有其他 藥物劑量而定，或取決於個人的藥代動力學、藥物積累和代謝速率。(三)有益效果本發明所述的多價疫苗能夠有效預防包括尖銳溼疣、子宮頸癌在內的多種與HPV感染相關的疾病。因為五聚體與HPV Ll蛋白的VLP(類病毒顆粒，為HPV Ll蛋白的七十二五 聚體)具有相同的免疫原性和抗原性，且相對於VLP而言具有結構更穩定、工業成本大幅降 低的優點，所以本發明所述的疫苗與目前已有的疫苗相比，質量穩定、成本低廉，防治範圍 更大，具有顯著的經濟效益和社會效應。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例1重組HPV16人乳頭瘤病毒疫苗的製備以下步驟中涉及的基因克隆、修飾等的操作參見PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。一、HPV16L1多聚體的製備1、克隆HPV16L1衣殼蛋白基因，克隆到T-Easy vector質粒(購自美國Promega 生物試劑公司)上。2、修飾HPV16L1衣殼蛋白基因，並在大腸桿菌中表達將含有鹼基替代突變的載 有HPV16L1基因插入片段的表達質粒pGEX-6-l通過熱激法導入大腸桿菌BL21細胞之後， 使用LB培養基(配方見《(分子克隆》第三版，科學出版社，2002年8月出版)進行攝氏37 度培養，菌種接入後生長12小時開始用表達誘導劑IPTG(購自美國Promega公司)誘導， 9小時後收穫細胞，細胞用Niro Soavi NS2006型高壓勻質機在800bar下重複破碎細胞2 次，顯微鏡檢查細胞破碎率達到90%以上。3、HPV16L1蛋白多聚體的分離、純化上清溶液中的Ll蛋白經親和色譜純化蛋白 預裝穀胱甘肽-瓊脂糖樹脂(Amersham公司生產的Glutathiones印harose 4B)色譜柱， 取濃度為50%的Glutathione Sepharose 4B勻漿放入色譜柱中(每200ml蛋白清液需要 5-10ml勻漿)。用5-10倍的柱床體積的緩衝液A (組分為:50mmol/L Tric-HCl，200mmol/ L NaCl,lmmol/L EDTA，pH8. 0)洗滌樹脂，將蛋白清液加入色譜柱中，與樹脂混合均勻並在 室溫下作用20分鐘後放出濾過液，用10倍柱床體積的緩衝液A洗滌樹脂柱。用電鏡觀察 純化產物，得到HPV16L1的五聚體和以五聚體為基本單元組成的多聚體。二、活性成分與輔料混合將純化的HPV16L1的多聚體與含有IOOmM NaCl的標準 磷酸緩衝液(見《分子克隆實驗指南》第三版，)通過緩衝液置換(bufferexchange，見《分 子克隆實驗指南》第三版)方式混合，使得Ll多聚體保存在pH值為7. 2的磷酸緩衝液中， 通過調整使得重組HPV16蛋白多聚體含量為50μ g/支疫苗，製劑成為重組HPV16人乳頭瘤 病毒疫苗，在4°C保存。實施例2 二價重組人乳頭瘤病毒(HPV16、HPV18)疫苗的製備以下步驟中涉及的基因克隆、修飾等的操作參見PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。一、HPV16L1五聚體的製備同實施例1。二、採用與前述相同的方法製備HPV18L1蛋白的五聚體。三、活性成分與輔料混合將純化的HPV16和HPV18L1蛋白的五聚體與含有IOOmM NaCl的標準磷酸緩衝液(見《分子克隆實驗指南》第三版，)通過緩衝液置換(buffer exchange,見《分子克隆實驗指南》第三版)方式混合，使得Ll五聚體保存在pH值為7. 2的磷酸緩衝液中，同時加入氫氧化鋁150 μ g，通過調整使得重組HPV16蛋白五聚體含量為 10 μ g/支疫苗、HPV18蛋白五聚體含量為20 μ g/支疫苗，製劑成為二價重組人乳頭瘤病毒 疫苗，在4°C保存。實施例3 二價重組人乳頭瘤病毒(HPV6、HPVl 1)疫苗的製備以下步驟中涉及的基因克隆、修飾等的操作參見PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。一、HPV6L1蛋白三十六五聚體(VLP)的製備同實施例1。二、採用與前述相同的方法製備HPVll Ll蛋白的三十六五聚體。三、活性成分與輔料混合將純化的HPV6和HPVll Ll蛋白的三十六五聚體與含有 IOOmM NaCl的標準磷酸緩衝液(見《分子克隆實驗指南》第三版，)通過緩衝液置換(buffer exchange，見《分子克隆實驗指南》第三版)方式混合，使得Ll三十六五聚體保存在pH值為 7. 2的磷酸緩衝液中，通過調整使得重組HPV6蛋白三十六五聚體含量為150 μ g/支疫苗、 HPVll蛋白三十六五聚體含量為200 μ g/支疫苗，製劑成為二價重組人乳頭瘤病毒疫苗，在 4°C保存。實施例4四價重組人乳頭瘤病毒(HPV6、HPV11、HPV16、HPV18)疫苗的製備以下步驟中涉及的基因克隆、修飾等的操作參見PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。一、HPV6L1蛋白七十二五聚體(VLP)的製備同實施例1。二、採用與前述相同的方法製備HPVll、HPV16、HPV18L1蛋白的七十二五聚體。三、活性成分與輔料混合將純化的HPV6、HPVl 1、HPV16、HPV18 Ll蛋白的 七十二五聚體與含有IOOmM NaCl的標準磷酸緩衝液(見《分子克隆實驗指南》第三版，) 通過緩衝液置換(buffer exchange，見《分子克隆實驗指南》第三版)方式混合，使得Ll 七十二五聚體保存在PH值為7. 2的磷酸緩衝液中，通過調整使得重組HPV6蛋白七十二五 聚體含量為20 μ g/支疫苗、HPVll蛋白七十二五聚體含量為25 μ g/支疫苗、HPV16蛋白 七十二五聚體含量為20 μ g/支疫苗、HPV18蛋白七十二聚體含量為35 μ g/支疫苗，製劑成 為四價重組人乳頭瘤病毒疫苗，在4°C保存。實施例5五價重組人乳頭瘤病毒(HPV11、HPV16、HPV18和HPV58)疫苗的製備以下步驟中涉及的基因克隆、修飾等的操作參見PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。一、HPV6L1五聚體的製備同實施例1。二、採用與前述相同的方法製備HPV11、HPV16、HPV18和HPV58L1蛋白的五聚體。三、活性成分與輔料混合將純化的HPV6、HPV11、HPV16、HPV18和HPV58的五聚體 與含有IOOmM NaCl的標準磷酸緩衝液(見《分子克隆實驗指南》第三版，)通過緩衝液置換 (buffer exchange，見《分子克隆實驗指南》第三版)方式混合，使得Ll五聚體保存在pH值 為7. 2的磷酸緩衝液中，通過調整使得重組HPV6蛋白五聚體含量為50 μ g/支疫苗、HPVll 蛋白五聚體含量為30 μ g/支疫苗、HPV16蛋白五聚體含量為50 μ g/支疫苗、HPV18蛋白五 聚體含量為20 μ g/支疫苗和HPV58蛋白五聚體含量為50 μ g/支疫苗，製劑成為五價重組 人乳頭瘤病毒疫苗，在4°C保存。實施例6五價重組人乳頭瘤病毒(HPV11、HPV16、HPV18和HPV33)疫苗的製備
以下步驟中涉及的基因克隆、修飾等的操作參見PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。一、HPV6L1十二五聚體的製備同實施例1。二、採用與前述相同的方法製備HPV11、HPV16、HPV18和HPV33 Ll蛋白的十二五聚體。三、活性成分與輔料混合將純化的朋￥6、朋￥11、朋￥16、朋￥18和朋￥33 Ll蛋白的 十二五聚體與含有IOOmM NaCl的標準磷酸緩衝液(見《分子克隆實驗指南》第三版，)通過 緩衝液置換(buffer exchange，見《分子克隆實驗指南》第三版)方式混合，使得Ll十二五 聚體保存在PH值為7. 2的磷酸緩衝液中，通過調整使得重組HPV6蛋白十二五聚體含量為 30 μ g/支疫苗、HPVll蛋白十二五聚體含量為30 μ g/支疫苗、HPV16蛋白十二五聚體含量 為30 μ g/支疫苗、HPV18蛋白十二五聚體含量為30 μ g/支疫苗和HPV33蛋白十二五聚體 含量為30 μ g/支疫苗，製劑成為五價重組人乳頭瘤病毒疫苗，在4°C保存。
權利要求
一種多價重組人乳頭瘤病毒疫苗，它由活性成分和藥物學上可接受的輔料組成，其特徵在於所述的活性成分包括至少一種重組HPV型的L1蛋白五聚體和/或以五聚體為基本單元組成的多聚體。
2.根據權利要求1所述的多價重組人乳頭瘤病毒疫苗，其特徵在於所述的以五聚體為 基本單元組成的多聚體包括五聚體，十二五聚體、三十六五聚體、四十八五聚體、七十二五 聚體和其他具有生物活性的Ll蛋白聚合形式。
3.根據權利要求1所述的疫苗，其特徵在於所述的HPV型包括流行病學意義上的HPV 高危險型和低危險型。
4.根據權利要求3所述的疫苗，其特徵在於所述的HPV型指HPV16。
5.根據權利要求3所述的疫苗，其特徵在於所述的HPV型指HPV16、HPV18。
6.根據權利要求3所述的疫苗，其特徵在於所述的HPV型指HPV6、HPV11。
7.根據權利要求3所述的疫苗，其特徵在於所述的HPV型指HPV16、HPV18、HPV6、 HPVllo
8.根據權利要求3所述的疫苗，其特徵在於所述的HPV型指HPV16、HPV18、HPV6、 HPV11、HPV33。
9.根據權利要求3所述的疫苗，其特徵在於所述的HPV型指HPV16、HPV18、HPV6、 HPV11、HPV58。
10.根據權利要求1所述的疫苗，其特徵在於所述輔料包括但不限於佐劑、賦型劑、穩 定劑。
11.根據權利要求10所述的疫苗，其特徵在於所述佐劑選自鋁鹽、3-0-去醯化單磷酸 類脂、脂質A衍生物中的一種或多種。
12.根據權利要求10所述的疫苗，其特徵在於所述穩定劑選自基於磷酸鹽的生理緩衝 液中的一種或多種。
13.根據權利要求10所述的疫苗，其特徵在於所述賦型劑選自生理鹽水及其它藥物上 可接受的賦型劑中的一種或多種。
14.根據權利要求1所述的疫苗，其特徵在於所述每種HPV型的Ll蛋白五聚體和/或 以五聚體為基本單元組成的多聚體的含量均為10-200 μ g/支疫苗。
15.一種生產如權利要求1-14之任一權利要求所述疫苗的方法，它包括如下步驟(1)表達、分離、純化所需要的重組HPV型的Ll蛋白五聚體和/或以五聚體為基本單元 組成的多聚體；(2)將所得Ll蛋白五聚體和/或以五聚體為基本單元組成的多聚體與輔料混合製劑， 得到多價重組人乳頭瘤病毒疫苗。
16.根據權利要求1-14之任一權利要求所述的疫苗在製備用於預防和/或治療由HPV 引起的感染和疾病的藥物中的應用。
17.根據權利要求16所述的應用，其特徵在於所述的感染和疾病包括子宮頸癌、尖銳 溼疣、乳腺癌、支氣管肺癌、直腸癌、食道癌、咽癌、口腔癌、皮膚癌及其它與HPV密切相關的 疾病。
18.根據權利要求17所述的應用，其特徵在於所述的感染和疾病是尖銳溼疣和子宮頸癌。
全文摘要
本發明提供了一種多價重組人乳頭瘤病毒疫苗，它由活性成分和藥物學上可接受的輔料組成，其中活性成分包括至少一種重組HPV型的L1蛋白五聚體和/或以五聚體為基本單元組成的多聚體。本發明所述的多價疫苗能夠有效預防包括尖銳溼疣、子宮頸癌在內的多種與HPV感染相關的疾病。本發明所述的疫苗與目前已有的疫苗相比，質量穩定、成本低廉，防治範圍大，具有顯著的經濟效益和社會效應。
文檔編號A61P17/12GK101890160SQ200910082730
公開日2010年11月24日 申請日期2009年4月28日 優先權日2009年4月28日
發明者陳小江, 馬潤林 申請人:北京康樂衛士生物技術有限公司