控制植物葉片轉綠的基因及其使用方法和應用的製作方法
2023-06-15 01:16:01
控制植物葉片轉綠的基因及其使用方法和應用的製作方法
【專利摘要】控制植物葉片轉綠的基因及其使用方法和應用，本發明公開了通過促進或抑制EMB2279基因或其蛋白來調節植物葉綠體成熟的方法及其應用。所述方法可用於控制植物葉片轉綠性狀。本發明的EMB2279基因或其蛋白及方法對於植物培植領域具有廣泛的應用價值，為轉基因技術改良農作物或者園藝植物提供了很好的基因資源。
【專利說明】控制植物葉片轉綠的基因及其使用方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】。具體地說，本發明涉及利用EMB2279基因及其蛋白控制植物葉片轉綠的方法及其應用。
【背景技術】
[0002]眾所周知，葉綠體是植物進行光合作用的場所，因此，改進葉綠體的功能，例如增強或促進葉綠體的活性對於提高農作物，特別是糧食作物產量或者經濟作物產量有極其重要的意義。
[0003]目前，農業生產中主要是通過延緩葉綠體衰老的途徑來提高作物產量。由於葉綠體發育受到包括低溫、陰雨等環境因子的影響，如果植物能在各種逆境條件下都能保障葉綠體順利發育，必將有利於植物的生長。但實際生產中尚未展開這樣的應用研究。其次，各種不同類型的質體，包括葉綠體也是許多營養物質積累的場所，例如胺基酸、維生素、抗氧化劑等等，因此調控葉綠體發育也與品質密切相關。但是，迄今還沒有運用生物技術調控葉綠體發育來提高作物品質的先例。例如，某些蔬菜栽培中，為了使葉綠體退化變成黃化質體，往往採用，諸如培土、遮光等傳統手段，而這些傳統的栽培措施往往具有成本過高、操作繁瑣、結果不穩定、成功率不高等等缺點。因此，如果能通過調控植物體內本身關鍵基因表達就能改變葉綠體發育的狀態，就可以簡單、高效實現作物的品質改良。
[0004]另外，在園藝觀賞植物中，觀葉植物也是越來越受到人們的重視。目前，這些觀賞植物都是從自然突變體或者通過人工誘變後篩選獲得的突變體。隨著生物技術的不斷發展，通過轉基因定向培育植物新品種具有快速、效率高等特點。
[0005]因此，本領域急需能夠控制葉綠體的成熟程度，進而調節植物的產量以及葉片顏色等各種性狀的方法。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在於提供調控植物葉綠體成熟的方法。
[0007]在第一方面，本發明提供EMB2279基因或其蛋白在調控植物葉綠體成熟中的應用。
[0008]在優選的實施方式中，所述植物包括十字花科、禾本科、豆科、脂麻科、菊科、藜科、山茶科、菌草科、梧桐科、爺科、五加科、多孔菌科、百合科、殼鬥科、棕櫚科、龍舌蘭科。
[0009]在優選的實施方式中，所述植物包括:擬南芥(Arabidopsis thaliana)、小麥、水稻、玉米、燕麥、黑麥、大麥、粟、高粱、青稞、棉花、麻類、花生、油菜、芝麻、大豆、向日葵、甜菜、甘蔗、茶葉、咖啡豆、可可、菸草、人參、靈芝、貝母、橡膠、椰子、油棕和劍麻。
[0010]在優選的實施方式中，所述應用是調節植物葉片顏色。
[0011]在優選的實施方式中，EMB2279蛋白包括
[0012](a)如SEQ ID N0:2所示的胺基酸序列的蛋白；或
[0013](b)將SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所述蛋白的功能的由(a)衍生的蛋白。
[0014]在第二方面，本發明提供調控植物葉綠體成熟的方法，所述方法包括以下步驟:
[0015]a)將促進或拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表達的物質給予植物、植物種子、植物細胞、組織或器官；和
[0016]b)培養步驟a)獲得的植物、植物種子、植物細胞、組織或器官。
[0017]在優選的實施方式中，所述促進EMB2279基因或其蛋白的活性或表達是指與對照相比，EMB2279基因或其蛋白的表達量升高或過表達，或表達活性更高的蛋白變體；所述拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表達是指與對照相比，EMB2279基因或其蛋白的表達量降低或不表達，或表達活性降低或無活性的EMB2279蛋白。
[0018]在優選的實施方式中，所述促進或拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表達的物質包括:EMB2279基因本身、EMB2279基因的反義RNA或EMB2279蛋白的抗體。
[0019]在優選的實施方式中，拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表達的物質是SEQ IDNO:3 所不的 microRNA。
[0020]在另一優選的實施方式中，所述步驟a)是將編碼EMB2279蛋白的多核苷酸轉入植物、植物種子、植物細胞、組織或器官，獲得轉化入編碼EMB2279蛋白的多核苷酸的植物、植物種子、植物細胞、組織或器官。
[0021]在進一步優選的實施方式中，所述步驟a)是將植物、植物種子、植物細胞、組織或器官與攜帶含有編碼EMB227 9蛋白的多核苷酸的農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)接觸，從而使編碼EMB2279蛋白的多核苷酸轉入植物細胞，並整合到植物細胞的染色體上。
[0022]在優選的實施方式中，所述方法用於調節植物葉片的顏色變化。
[0023]在第三方面，本發明提供EMB2279基因或其蛋白在篩選植物葉綠體成熟促進劑或拮抗劑中的應用。
[0024]在第四方面，本發明提供篩選植物葉綠體成熟促進劑或拮抗劑的方法，所述方法包括以下步驟:
[0025]a)將待測物質給予某植物；
[0026]b)檢測該植物中EMB2279基因或其蛋白的活性或表達情況；
[0027]如果與未給予待測物質的對照植物相比，所述EMB2279基因或其蛋白的活性或表達上調，則所述待測物質是葉綠體成熟促進劑；
[0028]如果與未給予待測物質的對照植物相比，所述EMB2279基因或其蛋白的活性或表達下調，則所述待測物質是葉綠體成熟拮抗劑。
[0029]在第五方面，本發明提供一種植物細胞，所述植物細胞中EMB2799蛋白的編碼基因失活。
[0030]在優選的實施方式中，通過基因剔除、基因中斷或基因插入造成EMB2799基因失活。
[0031]在另一優選的實施方式中，所述的失活還包括EMB2799基因不表達，或表達沒有活性的EMB2799蛋白。
[0032]應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在
此不再一一累述。【專利附圖】
【附圖說明】
[0033]圖1顯示了野生型擬南芥(WT)和突變型擬南芥(130)的表型、130圖位克隆結果、誤剪切產物、130T-DNA插入突變體emb2279-l表型以及emb2279_l與130等位測試結果。
[0034]圖2顯示了在突變型擬南芥中轉化野生型的EMB2279基因後獲得的轉基因擬南芥(35S:EMB2279/130)，在野生型擬南芥中轉入幹擾野生型擬南芥中EMB2279基因表達的幹擾分子後獲得的轉基因擬南芥(Am1-EMB2279/Col)的表型。
[0035]圖3顯示了擬南芥AtEMB2279_GFP融合蛋白定位於葉綠體中。
[0036]圖4顯示了野生型擬南芥以及AtEMB2279功能缺失的突變型擬南芥的葉綠體超微結構。
[0037]圖5顯示了野生型擬南芥以及AtEMB2279功能缺失的突變型擬南芥光和特性的比較。
[0038]圖6顯示了擬南芥EMB2279的靶標。
[0039]圖7顯示了在突變型擬南芥中轉化EMB2279-GFP (35S:EMB2279_GFP/130)以及EMB2279-FLAG (35S:EMB2279_FLAG/130)後獲得的轉基因擬南芥的表型。
【具體實施方式】
[0040]發明人經過廣泛而深入的研究，出乎意料地發現EMB2279基因與植物的葉片轉綠過程以及葉綠體的成熟相關，進而發現EMB2279蛋白是定位於葉綠體中的特異性加工葉綠體基因表達的調控因子，利用EMB2279基因可調節植物葉片顏色性狀。在此基礎上完成了本發明。`
[0041]植物
[0042]本文所用的術語「植物」是指可以藉助光合作用，以水、二氧化碳和無機鹽等無機物合成碳水化合物、蛋白質等來維繫生存，並通常不發生移動的生物。在具體的實施方式中，本文所述的「植物」通常包括糧食作物和經濟作物。所述糧食作物指以收穫成熟果實為目的，經去殼、碾磨等加工程序而成為人類基本食糧的一類作物，例如穀類作物、薯類作物和豆類作物。而所述經濟作物，又稱技術作物、工業原料作物，其指具有某種特定經濟用途的農作物，包括蔬菜、瓜果、花卉等園藝作物。
[0043]在優選的實施方式中，本文所述的「植物」包括但不限於:十字花科、豆科、脂麻科、菊科、藜科、山茶科、菌草科、梧桐科、爺科、五加科、多孔菌科、百合科、殼鬥科、棕櫚科、龍舌蘭科。
[0044]在進一步優選的實施方式中，本文所述的「植物」包括但不限於:擬南芥(Arabidopsis thaliana)、小麥、水稻、玉米、燕麥、黑麥、大麥、粟、高粱、青稞、棉花、麻類、花生、油菜、芝麻、大豆、向日葵、甜菜、甘蔗、茶葉、咖啡豆、可可、菸草、人參、靈芝、貝母、橡月父、挪子、油掠和劍麻，等等。
[0045]鑑於本發明的教導，本領域技術人員應該明白，本文所述的植物是其中的EMB2279基因或其蛋白的表達或活性得到抑制或增強的植物。本領域技術人員還應明白，除了成體植物本身，本文所述的植物還包括植物種子、植物細胞、植物組織或器官。
[0046]在具體的實施方式中，本發明的植物包括:轉入了 EMB2279基因或其同源基因的轉基因植物；或者EMB2279蛋白表達量降低(包括低表達或不表達)或表達無活性EMB2279蛋白的植物，等等。
[0047]EMB2279基因及其蛋白
[0048]在本發明中，術語「EMB2279蛋白」指具有SEQ ID NO: 2所示胺基酸序列的多肽。然而，鑑於本發明的教導以及現有技術，本領域技術人員還應明白該術語包括EMB2279蛋白的變異形式，所述變異形式具有與EMB2279蛋白相同或相似的功能，但其胺基酸序列與SEQID N0:2所示胺基酸序列有少量差異。這些變異形式包括(但不限於):一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個，還更佳如1_8個、1-5個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或多個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，本領域技術人員熟知，用性能相近或相似的胺基酸進行取代，例如，異亮氨酸與亮氨酸相互取代時，不會改變所得蛋白質的功能。再例如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸，例如為便於分離而添加的標籤通常不會改變所得蛋白質的功能。
[0049]多肽的變異形式包括:同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴格性條件下能與EMB2279蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗EMB2279蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含EMB2279蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了 EMB2279蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有EMB2279蛋白序列的至少約20個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。
[0050]發明還提供EMB2279蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然EMB2279蛋白的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、Y-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。
[0051]修飾(通常不改變一級結構)形式包括:體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
[0052]在本發明中，「ΕΜΒ2279蛋白保守性變異多肽」指與SEQ ID Ν0:2所示胺基酸序列相比，有至多20個，較佳地至多10個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。
[0053]因此，鑑於本發明的教導和現有技術，本領域技術人員可根據，例如下表所示進行胺基酸替換而產生保守性變異的突變體。
[0054]
【權利要求】
1.EMB2279基因或其蛋白在調控植物葉綠體成熟中的應用。
2.一種調控植物葉綠體成熟的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟: a)將促進或拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表達的物質給予植物、植物種子、植物細胞、組織或器官；和 b)培養步驟a)獲得的植物、植物種子、植物細胞、組織或器官。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述步驟a)是將編碼EMB2279蛋白的多核苷酸轉入植物、植物種子、植物細胞、組織或器官，獲得轉化入編碼EMB2279蛋白的多核苷酸的植物、植物種子、植物細胞、組織或器官。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述步驟a)是將植物、植物種子、植物細胞、組織或器官與攜帶含有編碼EMB2279蛋白的多核苷酸的農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)接觸，從而使編碼EMB2279蛋白的多核苷酸轉入植物細胞，並整合到植物細胞的染色體上。
5.EMB2279基因或其蛋白在篩選植物葉綠體成熟促進劑或拮抗劑中的應用。
6.一種篩選植物葉綠體成熟促進劑或拮抗劑的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟: a)將待測物質給予某植物； b)檢測該植物中EMB2279基因或其蛋白的活性或表達情況； 如果與未給予待測物質的對照植物相比，所述EMB2279基因或其蛋白的活性或表達上調，則所述待測物質是葉綠`體成熟促進劑； 如果與未給予待測物質的對照植物相比，所述EMB2279基因或其蛋白的活性或表達下調，則所述待測物質是葉綠體成熟拮抗劑。
7.一種植物細胞，其特徵在於，所述植物細胞中EMB2799蛋白的編碼基因失活。
【文檔編號】A01H5/00GK103865936SQ201210536969
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月12日 優先權日:2012年12月12日
【發明者】黃繼榮, 黃偉華, 吳文娟 申請人:中國科學院上海生命科學研究院