一種大豆抗花葉病毒主效基因位點及應用的製作方法

2023-06-10 15:51:41

專利名稱：一種大豆抗花葉病毒主效基因位點及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於大豆分子生物學及遺傳育種技術領域。更具體涉及一種大豆抗花葉病毒主效基因位點及與該主效基因位點緊密連鎖的分子標記，同時還涉及該分子標記在大豆抗花葉病毒育種中的應用。
背景技術：
大豆是一種重要農作物，富含蛋白質和脂肪以及對人體有利的活性成分如皂貳、異黃酮、磷脂等，是世界上植物性蛋白和油分的主要來源之一。目前我國大豆種植面積、總產及單產均居世界第四位，生產水平落後於世界大豆生產。2012年中國大豆種植面積718萬公頃，總產量1280萬噸，而進口大豆達到創記錄的5750萬噸，佔據我國五分之四的大豆市場。造成我國大豆生產滯後、供給嚴重不足、國內大豆產業遭受進口轉基因大豆嚴重衝擊的原因是多方面的，但主要原因之一是綜合抗病蟲害和抗逆能力差，單產低，種植效益低下，國際競爭力弱。大豆花葉病毒(Soybean mosaic virus SMV)病是世界上分布最廣泛,危害大豆最嚴重的病毒性病害之一，在我國各產區均有發生，己經成為我國東北、黃淮和長江流域大豆主產區最主要的病害之一。SMV侵染大豆後，會導致大豆葉片中葉綠素含量及葉質下降，葉面積減小，影響光合面積和光合能力，植株矮小，生長量下降，單株莢數減少，降低種子百粒重、萌發率、蛋白質含量及含油量，並影響脂肪酸、蛋白質、微量元素及游離胺基酸的組分等，嚴重影響大豆產量和品質。大豆被花葉病毒侵染後的產量損失一般在15% - 35%，發病嚴重的年份，引起的產量損失可達70%以上，甚至絕產。大豆品種感染SMV後，根、莖、葉等形態器官受到嚴重影響，影響程度從大到小依次為單株粒重、單株葉面積、根瘤重、莖葉乾重、根乾重、種子褐斑粒率、株高、百粒重，且早期感染SMV其危害大於中後期感染。大豆花葉病毒病不但影響大豆的產量，還影響大豆的品質，嚴重時病粒率達50%以上，嚴重降低大豆的商品質量。

作物的許多重要農藝性狀如產量、品質和抗性等都是數量性狀，由多個基因控制，表現為連續變異，且易受環境影響，相對於由單基因控制的質量性狀而言，選擇效果不好。通過構建遺傳圖譜，定位數量性狀位點(quantitative trait loci, QTL),利用與QTL緊密連鎖的分子標記在早代對育種材料進行選擇，可克服環境影響，節約生產成本，提高選擇效率，加快育進程。對大豆抗SMV的QTL定位研究也有一些報導，目前，在大豆第2、13和14號染色體上已定位抗大豆花葉病毒QTL，但效應值較小,較難在大豆育種中應用。

發明內容
本發明所要解決的一個技術問題是提供鑑定或輔助鑑定大豆抗花葉病毒(SC-3株系)性狀的方法。本發明所提供的一種鑑定或輔助鑑定大豆抗花葉病毒性狀的方法，包括如下步驟:分別以待鑑定大豆的基因組DNA為模板，用由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對進行PCR擴增，通過聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測所得到的PCR產物，按照下述方法確定所述待鑑定大豆的抗花葉病毒性狀:如果待鑑定大豆的PCR擴增產物在聚丙烯醯胺凝膠電泳中顯示為與中豆32的PCR擴增產物大小相同的一個條帶，所述待鑑定大豆為抗花葉病毒大豆或為候選抗花葉病毒大豆，如果所述PCR擴增產物在聚丙烯醯胺凝膠電泳中顯示為與中豆29的PCR擴增產物大小相同的一個條帶，所述待鑑定大豆為非抗花葉病毒大豆或為候選非抗花葉病毒大豆；所述待鑑定大ii選自中ii 29 X中ii 32的雜種後代中的F7及其以後世代的豕系。其中，所述聚丙烯醯胺凝膠電泳中，所述聚丙烯醯胺凝膠的濃度(凝膠溶液中單體丙烯醯胺和交聯劑甲叉雙丙烯醯胺的總質量濃度)可為60g/L，所述聚丙烯醯胺凝膠的交聯度(凝膠溶液中甲叉雙丙烯醯胺佔丙烯醯胺和甲叉雙丙烯醯胺的質量分數)可為5%。上述方法中，所述PCR擴增中先進行10個第一個循環後再進行25個第二個循環，所述第一個循環的引物退火條件為60°C 30s，所述第二個循環的引物退火條件為55°C30s。其中，所述第一個循環的溫度程序是:先94°C 30s，然後60°C 30s，最後72°CImin ;所述第二個循環的溫度程序是:先94°C 30s,然後55°C 30s,最後72°C lmin。上述方法中，所述待鑑定大豆具體選自中豆29 X中豆32的雜種後代中的F7至F11豕系。在本發明的個實施例中，所述待鑑定大ii具體選自中ii 29 X中ii 32的雜種後代中的F11的家系。

上述方法中，所述抗花葉病毒大豆是指花葉病毒病的病情指數 30的大豆品種或品系。上述方法中，在中豆29X中豆32這個雜交組合中，中豆29為母本，中豆32為父本。上述方法可用於大豆育種、大豆抗花葉病毒SC-3株系的早期預測和篩選抗花葉
病毒大豆。在大豆育種中，可選擇上述方法鑑定出的抗花葉病毒大豆或候選抗花葉病毒大豆進行育種。本發明所要解決的另一個技術問題是提供鑑定或輔助鑑定大豆抗花葉病毒性狀的引物對。本發明所提供的鑑定或輔助鑑定大豆抗花葉病毒性狀的引物對，名稱為GmSSRl3-23，由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的兩條單鏈DNA組成。其中，SEQ ID N0.1由20個脫氧核苷酸組成，SEQ ID N0.2由20個脫氧核苷酸組成。含有上述引物對GmSSR13_23的鑑定或輔助鑑定大豆抗花葉病毒性狀的試劑或試劑盒也屬於本發明的保護範圍。上述引物對GmSSR13-23、含有上述引物對GmSSR13-23的試劑或試劑盒的下述a)、
b)或c)用途也屬於本發明的保護範圍:a)在大豆育種中的應用；b)在大豆抗花葉病毒的早期預測中的應用；c)在篩選抗花葉病毒大豆中的應用。
本發明所要解決的再一個技術問題是提供一種大豆抗花葉病毒主效基因位點。本發明所提供的大豆抗花葉病毒主效基因位點是qRSC.13_1，該主效基因位點的貢獻率(32.4%)超過已往的報導，對大豆抗花葉病毒起著關鍵作用，可用作圖位克隆和分子標記輔助選擇。上文中，花葉病毒具體為花葉病毒SC-3株系。本發明的引物對GmSSR13_23，是與主效基因位點qRSC.13-1緊密連鎖的標記，與qRSC.13-1相距0.8cM,是基於PCR技術的共顯性SSR標記，因而可靠且使用方便。實驗證明，利用引物對GmSSR13_23對大豆育種群體進行輔助選擇得到了花葉病毒病的病情指數低於30的抗花葉病毒家系，這表明引物對GmSSR13-23用於大豆抗花葉病毒育種的分子標記輔助選擇是切實有效的。

本發明通過對大豆抗花葉病毒的QTL定位，首次精細定位了抗花葉病毒主效基因位點qRSC.13-1並獲得了與其緊密連鎖的分子標記GmSSR13_23，該大豆抗花葉病毒主效基因位點qRSC.13-1，可解釋32.4%的表型變異，可用於圖位克隆和分子標記輔助選擇。在常規育種方法中，大豆對SMV的抗性需人工接種鑑定才能確定，且易受環境，選擇效率低下。通過檢測抗SMV SC-3株系主效基因位點，可以在苗期進行淘汰，不僅節約生產成本而且大大提高選擇效率，從而加快育種進程。本發明中抗花葉病毒主效基因位點位置明確，主效基因位點的檢測方法方便快速，不受環境影響。通過檢測與抗花葉病毒主效基因位點緊密連鎖的分子標記，即可預測大豆的抗花葉病毒性狀，進而準確快速篩選高抗花葉病毒的材料。本發明通過分子標記GmSSR13-23輔助選擇得到的家系的花葉病毒病的病情指數均低於30，利用本發明的GmSSR13-23進行分子標記輔助選擇可提高大豆抗花葉病毒育種的選擇效率，加快育種進程。


圖1為利用GmSSR13-23對1_36的家系的F11代、母本和父本的基因組DNA進行PCR得到的PCR產物的變性聚丙烯醯胺凝膠電泳圖。圖中1-36為材料編號，Pl和P2分別代表母本中豆29和父本中豆32。圖2為大豆抗SMV SC-3株系病情指數LOD值分布曲線。圖中橫坐標代表連鎖群，縱坐標代表LOD值。箭頭所示為抗SMV SC_3株系主效基因位點(qRSC.13-1)曲線。圖3為大豆13號染色體對應的F連鎖群。左側為抗SMV SC-3株系主效基因位點(qRSC.13-1)位置及置信區間示意圖，右側為標記名稱及遺傳距離(CM)。
具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。大豆中豆29和中豆32 (周新安等，大豆重組自交系群體三、四粒莢變異及其與產量的關係，中國油料作物學報，2005，27:22-25)公眾可從商業途徑獲得，也可從中國農業科學院油料作物研究所獲得，以重複本發明實驗。花葉病毒SC-3株系(戰勇等，黃淮地區大S 花葉病毒株系的鑑定與分布，中國農業科學，2006，39 =2009-2015)公眾可從田間採集大豆葉片分離，也可從中國農業科學院油料作物研究所獲得，以重複本發明實驗。在以下的實施方案中，除非特別說明，否則所有操作均按照《分子克隆實驗指南》(第三版)(黃培堂等譯，北京:科學出版社，2002)所提供的方法進行。實施例1、利用引物對GmSSR13-23鑑定中豆29X中豆32的F11家系的抗花葉病毒性狀一、鑑定或輔助鑑定大豆抗花葉病毒性狀的PCR試劑本實施例的鑑定或輔助鑑定大豆抗花葉病毒性狀的PCR試劑由PCR引物對GmSSR13_23、10XTaq緩衝液，dNTP混合物，MgCl2溶液、Taq DNA聚合酶和ddH20組成。其中，PCR引物對GmSSRl3-23由正向引物和反向引物這兩條單鏈DNA組成，其序列如下:正向引物:5，-CAGCCAATAGCAACAAAGGG-3，(SEQID N0.1),反向引物:5，-GCCTTGCTTGCTCATCAAAT-3，(SEQID N0.2)。二、待鑑定大豆中豆29 X中豆32的F11家系是按照如下方法獲得:中豆29和中豆32雜交，雜交後代連續自交，在F3即分株行種植，以後各世代均從每一個株行中隨機選擇一個單株，衍生出下一世代。自F7世代同一個家系內隨機選擇5個單株，種子混合，不同家系分別種植，獲得由406個F11株系組成的重組自交系群體。其中，從F2至F11的雜交方式均為自交。三、田間實驗和利用引物對GmSSR13_23鑑定待鑑定大豆的抗花葉病毒性狀(一)隨機區組實驗測定花葉病毒抗性從步驟二的406個家系中隨機選36個家系的F11家系，即編號為1_36的大豆材料種植以測定每個家系對花葉病毒SC-3株系的抗性。試驗採用隨機區組設計，共設三個重複區。每個重複區設38個小區，36個家系中每個家系I個小區，母本中豆29 (Pl) I個小區,父本中豆32 (P2)l個小區。所有試驗材料種植於中國農業科學院油料作物研究所試驗農場。每個小區種植3行，行長3.5m，行距為
0.4m，株距為0.lm。在第一片真葉展開時人工磨擦接種鑑定(智海劍等，2002-2004年國家大豆區試品種對大豆花葉病毒抗性的評價.大豆科學，2005，24:190-193)，方法如下:(I)供試花葉病毒SC-3株系在感病品種大豆南農1138-2上繁殖保存。(2)群體及親本材料播種後在未出苗之前蓋好防蟲網。在第一對真葉展開時，取南農1138-2上具有典型花葉病毒症狀的新鮮病葉加0.1M、PH7.5的磷酸緩衝液(約Ig新鮮葉片加5ml緩衝液)和適量600目金剛砂，在攪拌機中打成勻漿，用毛刷蘸勻漿均勻摩擦接種於供試材料真葉上，接種後用清水衝洗葉片上多餘的汁液。待第一片複葉展開時重複接種I次。(3)接種30天症狀穩定時調查發病情況，並計算發病率、病情指數。(4)磷酸緩衝液的配製。稱取 Na2HPO4.12H20 71.6g,KH2PO4.12H20 6.8g，加純淨水2400ml，攪拌使其充分溶解，調pH到7 .5，定容到2500ml。置於4°C冰箱中備用。(5)大豆接種SMV的鑑定方法。親本及各家系的調查包括症狀類型、病級，並計算病情指數。病級是株系症狀的嚴重度分級，參照智海劍等(2005)的方法調查單株病級，具體的分級標準是:花葉型:0級:免疫、無症狀或僅在接種葉上出現局部枯斑；1級:輕花葉；2級:黃斑花葉、葉片輕度皺縮；3級:重花葉、葉片皺縮捲曲；4級:葉片嚴重皺縮且植株矮化。壞死型:0級:免疫、無症狀或僅在接種葉上有局部枯斑；1級:部分葉片上出現可見微小壞死斑；2級:多數壞死斑直徑在5mm以下或有部分葉脈壞死，其長度小於IOmm ；3級:壞死斑連片或主脈壞死長度大於20mm ；4級:葉片因壞死脫落，或壞死面積超過葉片面積50%，或出現頂枯，植株停止生長。如在同一植株上同時出現花葉、壞死二種症狀，病級取級別高者。病情指數(DI) =Σ(病級X發病株數)/(最高病級X總株數)X 100。(6)大豆對SMV抗感的劃分標準:病情指數小於等於30為抗花葉病毒大豆；花葉病毒病的病情指數大於30為非抗花葉病毒大豆。結果如表2 所示，表明家系 2、3、5、9、10、11、13、18、20、21、23、25、26、29、30、31、33
這17個家系以及中豆32的花葉病毒病的病情指數均小於30，是抗花葉病毒大豆；家系1、
4、6、7、8、12、14、15、16、17、19、22、24、27、28、32、34、35、36 這 19 個家系以及中豆 29 的花葉病毒病的病情指數均大於30，是非抗花葉病毒大豆。(二)利用引物對GmSSR13_23測定大豆的抗花葉病毒性狀在步驟(一)編號為1-36的家系的F11代、母本中豆29 (Pl)和父本中豆32的3葉期分別採集大豆葉片提取其基因組DNA，利用引物對GmSSR13-23進行PCR擴增，對得到的PCR擴增產物進行60g/L變性聚丙烯醯胺凝膠(交聯度為5%)電泳，檢測電泳條帶大小。其中，編號為1-36的家系每個家系採集5個植株的葉片等質量混合後提取基因組DNA，母本採集10個植株的葉片等質量混合後提取基因組DNA，父本採集10個植株的葉片等質量混合後提取基因組DNA。具體的實驗方法如下:1、用 CTAB 法(Keim P.A rapid protocol for isolating soybean DNA.Soybeangenet newslett, 1988, 15:147-148)提取葉片基因組 DNA(I)取0.5g新鮮葉片放入1.5ml離心管中，用玻璃棒磨為勻漿，加入700 yl經65°C預熱30min的CTAB溶液和20 yl P -巰基乙醇搖勻，放入65°C的水浴鍋中水浴30min。(2)取出離心管，加入700 U I氯仿-異戊醇(24:l/v:v)輕搖幾次，靜置30min後12000rpm,離心 lOmin。(3)吸取上清液，加入2倍體積的冰凍無水乙醇，置於_20°C冰箱30min。12000rpm離心10分鐘讓DNA沉澱，倒掉離心管中乙醇溶液。(4)用75%(V/V)乙醇清洗2_3次，倒乙醇溶液，打開離心管蓋置於通風櫥內吹乾。(5)加入200 U I雙蒸水溶解DNA，用紫外分光光度計測定DNA的濃度，於_20°C冰箱中保存備用。2、分別以步驟I提取的中豆29 X中豆32的的F11代家系1_36的基因組DNA為模板，利用引物對GmSSR13-23進行PCR擴增，反應體系如表1:表1.
權利要求
1.鑑定或輔助鑑定大豆抗花葉病毒性狀的方法，包括如下步驟:分別以待鑑定大豆的基因組DNA為模板，用由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對進行PCR擴增，通過聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測所得到的PCR產物，按照下述方法確定所述待鑑定大豆的抗花葉病毒性狀: 如果待鑑定大豆的PCR擴增產物在聚丙烯醯胺凝膠電泳中顯示為與中豆32的PCR擴增產物大小相同的條帶，所述待鑑定大豆為抗花葉病毒大豆或為候選抗花葉病毒大豆，如果所述PCR擴增產物在聚丙烯醯胺凝膠電泳中顯示為與中豆29的PCR擴增產物大小相同的條帶，所述待鑑定大豆為非抗花葉病毒大豆或為候選非抗花葉病毒大豆； 所述待鑑定大ii選自中ii 29 X中ii 32的雜種後代中的F7及其以後世代的豕系。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述聚丙烯醯胺凝膠電泳中，所述聚丙烯醯胺凝膠的濃度為60g/L，所述聚丙烯醯胺凝膠的交聯度為5%。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於:所述PCR擴增中先進行10個第一個循環後再進行25個第二個循環，所述第一個循環的引物退火條件為60°C 30s，所述第二個循環的引物退火條件為55°C 30s。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於:所述第一個循環的溫度程序是:先94°C30s，然後60°C 30s，最後72°C Imin ;所述第二個循環的溫度程序是:先94°C 30s，然後55°C 30s，最後 72°C Imin。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特徵在於:所述待鑑定大豆選自中豆29X中豆32的雜種後代中的F7至F11家系。
6.權利要求1-5中任一所述的方法的用途，所述用途為1)、2)或3): 1)權利要求1-5中任一所述的方法在 大豆育種中的應用； 2)權利要求1-5中任一所述的方法在大豆抗花葉病毒性狀的早期預測中的應用； 3)權利要求1-5中任一所述的方法在篩選抗花葉病毒大豆中的應用。
7.鑑定或輔助鑑定大豆抗花葉病毒性狀的引物對，名稱為GmSSR13-23，由SEQID N0.1和SEQ ID N0.2所示的兩條單鏈DNA組成。
8.含有權利要求7所述的引物對的鑑定或輔助鑑定大豆抗花葉病毒性狀的試劑或試劑盒。
9.權利要求7所述的引物對、權利要求8所述的試劑或試劑盒的用途，所述用途為a)、b)或 c): a)權利要求7所述的引物對、權利要求8所述的試劑或試劑盒在大豆育種中的應用； b)權利要求7所述的引物對、權利要求8所述的試劑或試劑盒在大豆抗花葉病毒性狀的早期預測中的應用； c)權利要求7所述的引物對、權利要求8所述的試劑或試劑盒在篩選抗花葉病毒大豆中的應用。
10.一種大豆抗花葉病毒主效基因位點，其特徵在於:所述主效基因位點為qRSC.13-1。
全文摘要
本發明公開了一種大豆抗花葉病毒主效基因位點及應用。該大豆抗花葉病毒主效基因位點及其在分子標記輔助選擇育種中的應用。該抗花葉病毒主效基因位點為qRSC.13-1,貢獻率為32.4%。與抗花葉病毒主效基因位點緊密連鎖的分子標記為GmSSR13-23。利用緊密連鎖的分子標記檢測育種群體家系是否含有該主效基因位點，可預測其抗花葉病毒性，大大提高了大豆抗花葉病毒育種的選擇效率。
文檔編號C12N15/11GK103114145SQ20131005381
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月20日 優先權日2013年2月20日
發明者陳海峰, 沙愛華, 單志慧, 楊中路, 張曉娟, 張嬋娟, 陳李淼, 陳水蓮, 邱德珍, 周蓉, 吳學軍, 周新安 申請人:中國農業科學院油料作物研究所