一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因RkZWF1及其應用

2023-06-11 01:25:22 1

一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因rkzwf1及其應用
技術領域
1.本發明屬於基因工程技術領域，具體涉及一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因rkzwf1及其在提高紅冬孢酵母（rhodosporidium kratochvilovae）類胡蘿蔔素產量中的應用。


背景技術：

2.葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase,g6pdh），是磷酸戊糖途徑氧化分支的主要調節酶，催化6-磷酸葡糖氧化脫氫生成6-磷酸葡糖酸內酯，同時將nadp
+
還原為nadph。g6pdh是由zwf1基因編碼的一個二聚體，每個亞基由兩個結構域組成，較小的結構域是一個經典的羅斯曼摺疊，參與底物結合，而較大的結構域是一個包含九條反向平行的β-摺疊鏈的β＋α結構域，與亞基的聚合有關，該結構突顯的保守胺基酸殘基包括his-240（從6-磷酸葡糖的c
1-oh提取質子）、asp-177（其羧酸鹽在過渡態穩定了在his-240上形成的正電荷）、his178（與6-磷酸葡糖的磷酸部分結合）（cosgrove ms, naylor c, paludan s, adams mj, levy hr. on the mechanism of the reaction catalyzed by glucose 6-phosphate dehydrogenase. biochemistry. 1998 mar;37(9) 2759-2767.）。
3.g6pdh存在於所有類型細胞的胞質中，其主要作用是為細胞內的諸多生化代謝反應提供還原力，支持還原性物質如脂肪酸、類胡蘿蔔素和膽固醇等的生物合成，同時還通過促進穀胱甘肽循環參與酶促氧化應激進而在保護細胞中起到重要作用。通過磷酸戊糖途徑，g6pdh還能夠為嘌呤、嘧啶、atp和coa等的合成提供前體物質，g6pdh在細胞的生理以及在生物體的整個代謝調控中發揮重要作用。（park j, rho hk, kim kh, choe ss, lee ys, kim jb. overexpression of glucose-6-phosphate dehydrogenase is associated with lipid dysregulation and insulin resistance in obesity. mol cell biol. 2005 jun;25(12):5146-57.）。g6pdh缺乏症是人類最常見的遺傳性細胞酶病，g6pdh活性降低，可導致細胞生長和信號傳遞失調、胚胎發育異常、對病毒易感以及促進退行性疾病的發生。g6pdh與植物的生長發育同樣具有緊密的關係，相關研究顯示g6pdh的活性在休眠芽中高於萌芽期和恢復生長期；g6pdh參與植物響應外界的生物與非生物脅迫，在高低溫、乾旱、病毒感染和鹽脅迫等方面均有報導，如scharte j等的研究發現，在抗性菸草源葉中，通過抑制葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(g6pdh)或nadph氧化酶，可以防止菸草疫黴侵染後氧化爆裂和隨後形成的過敏性病變。這一觀察結果表明，由於細胞質中g6pdh活性的增加，nadph有效性的提高可能有利於植物的防禦。（scharte j, sch
ö
n h, tjaden z, weis e, von schaewen a. isoenzyme replacement of glucose-6-phosphate dehydrogenase in the cytosol improves stress tolerance in plants. proc natl acad sci u s a. 2009 may 12;106(19):8061-6.）。
4.類胡蘿蔔素(carotenoids)是一類脂溶性色素，許多研究發現類胡蘿蔔素在植物、動物以及微生物之中廣泛地存在，一般呈黃色、橙紅色、紅色或紫色，具有維生素a原活性、較強的抗氧化性、抗癌能力、調節免疫功能、著色功能等。因此，類胡蘿蔔素在醫藥、保健、食品等領域受到研究者極大的關注。


技術實現要素：

5.本發明提供了一種從紅冬孢酵母（rhodosporidium kratochvilovae）ym25235中分離獲得葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因rkzwf1及其用途，基因rkzwf1的核苷酸序列如seq id no:1所示，該基因序列長為1542bp，編碼胺基酸序列如seq id no:2所示的多肽，將該基因與載體連接，轉入紅冬孢酵母細胞中，這個基因表達水平的提高促進了類胡蘿蔔素的合成。
6.本發明目的通過以下技術方案實現：1、從紅冬孢酵母ym25235中提取總rna，然後反轉錄合成cdna，以合成cdna為模板，採用擴增rkzwf1基因的特異引物，通過聚合酶鏈式反應擴增獲得目的序列，將載體prh2034進行雙酶切、回收，用一步克隆法將目的片段和載體連接，獲得連接產物重組質粒prhrkzwf1，將重組質粒prhrkzwf1轉入大腸桿菌中，通過pcr篩選出陽性單克隆，重組質粒prhrkzwf1用bamhⅰ、ecor
ⅴ
兩個限制性內切酶進行酶切驗證，驗證陽性的克隆子培養後提取質粒，測序，獲得片段大小為1542bp的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因rkzwf1；2、利用peg介導的原生質體法將重組載體prhrkzwf1轉化至紅冬孢酵母ym25235中，篩選轉化子，獲得含有prhrkzwf1的過表達菌株，含有prhrkzwf1的過表達菌株經培養，提取色素，利用紫外-可見分光光度計測量總類胡蘿蔔素的含量。
7.本發明利用的紅冬孢酵母ym25235菌株具有原料成本低、生產周期短、遺傳穩定、安全性高等優點，從該菌株中提取的總rna反轉錄的cdna中克隆得到葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因rkzwf1，通過基因工程手段對紅冬孢酵母進行改造，紅冬孢酵母ym25235中rkzwf1基因的過表達引起細胞內這個基因轉錄水平的提高，繼而翻譯成相應蛋白，引起細胞內類胡蘿蔔素含量的提高；本研究結果有助於闡明紅冬孢酵母ym25235中產類胡蘿蔔素的機制，為揭示微生物提高類胡蘿蔔素產量的機制提供參考，本發明提供了一種生產類胡蘿蔔素的新方法，對類胡蘿蔔素的工業化生產提供良好的應用前景和經濟效益；本發明方法簡單，操作簡便，適於工業化生產和市場推廣應用。
附圖說明
8.圖1為本發明的紅冬孢酵母ym25235的rkzwf1基因的pcr擴增圖；1.dna分子量標記dl5000；2.陰性對照；3.基因rkzwf1的cdna片段；圖2為重組質粒prhrkzwf1的質粒圖譜；圖3為菌落pcr驗證電泳圖；1.dna分子量標記dl5000；2.陰性對照；3.基因rkzwf1的cdna片段；4-8為轉化子；圖4為重組質粒prhrkzwf1限制性酶切分析；其中：1.dna 分子量標記dl10000；2.陰性對照； 3.質粒prh2034的bamhi和ecorv雙酶切；4.重組質粒prhrkzwf1的bamhi、ecorv雙酶切；5.基因rkzwf1的cdna片段；6.dna 分子量標記dl2000；圖5重組質粒prhrkzwf1轉化紅冬孢酵母ym25235陽性克隆驗證；1.dna 分子標量dl2000；2.陰性對照；3.以ym25235基因組擴增的pcr產物；4.以質粒prhrkzwf1擴增的 pcr產物；5.以ym25235/prhrkzwf1菌株基因組擴增的pcr產物；圖6過表達菌株ym25235/prhrkzwf1與對照菌株ym25235的類胡蘿蔔素含量比較結果。
具體實施方式
9.下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明保護範圍不局限於所述內容，實施例中使用的試劑和方法，如無特殊說明，均採用常規試劑，使用常規方法。
10.實施例1：從紅冬孢酵母ym25235中克隆葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因rkzwf1並構建其過表達載體prhrkzwf1、轉化紅冬孢酵母ym252351、採用生工生物工程（上海）股份有限公司的unlq-10柱式trizol總rna抽提試劑盒（產品編號:sk1321）提取紅冬孢酵母ym25235的總rna，然後按照vazyme公司試劑盒（產品編號：r212-02）hiscript ii 1st strand cdna synthesis kit (+gdna wiper)中的操作說明進行反轉錄合成cdna，取1μl cdna為模板進行聚合酶鏈式反應，根據轉錄組測序中得到的rkzwf1序列，設計特異性引物rkzwf1-f和rkzwf1-r，以上述得到的cdna模板，採用引物rkzwf1-f和rkzwf1-r，在pcr儀（北京六一生物科技有限公司）上進行pcr擴增，反應所用引物、擴增體系和擴增條件如下：rkzwf1-f：（seq id no:3）（雙下劃線為上遊載體末端同源序列，單下劃線為bamhⅰ酶切位點）rkzwf1-r：（seq id no:4）（雙下劃線為下遊載體末端同源序列，單下劃線為ecorv酶切位點）；pcr擴增體系如下（50μl）：template cdna1μl、rkzwf1-f2μl、rkzwf1-r2μl、dntps mix(10mm each) 1μl、vazyme 2
×
phanta max buffer25μl、vazyme phanta max super-fidelity dna polymerase1μl，ddh2o加至50μl；擴增條件：95℃預變性3min，再用95℃變性15s，67℃退火15s，72℃延伸1min35s，共30個循環，最後72℃徹底延伸5min；反應後取產物2μl，在濃度為1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳分析，結果如圖1所示；擴增得到大小約為1550bp的片段，命名為rkzwf1；將prh2034經bamhⅰ、ecor
ⅴ
兩個限制性內切酶進行雙酶切；將以上兩個片段用多功能dna回收試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司，產品編號：dp1502）回收，將回收後的兩個片段用無縫克隆試劑盒（clonexpress ii one step cloning kit c112，南京諾唯贊生物科技有限公司）進行連接，獲得重組質粒prhrkzwf1，連接體系如下（20
µ
l）：exnase
tmⅱ2μl、rkzwf1片段61.68ng、線性化prh2034200ng、5
×
ceⅱbuffer4μl、其餘為ddh2o；使用移液器輕輕吹打混勻，短暫離心將反應液收集至管底，然後在pcr儀（北京六一生物科技有限公司）37℃反應30min；降至4℃或立即置於冰上冷卻。
11.2、取10
µ
l獲得的連接產物加到100
µ
l dh5α感受態細胞中，輕彈管壁混勻，冰浴30min，42℃水浴熱激90s後立即放置在冰上冷卻90s，向連接體系中加入900
µ
l lb液體培養基，於37℃、100rpm振蕩孵育1h，在5000rpm下離心10min後棄900
µ
l上清，剩餘約100
µ
l左右lb培養基輕柔吹打懸浮菌體並塗布於lb固體平板（含有100
µ
g/ml壯觀黴素），於37℃倒置培養12-16h，隨機挑取平板上生長的5個白色菌落並編號為1-5號，通過菌落pcr進行陽性克隆驗證，結果見圖3，從圖中可以看出挑取的五株單克隆菌株通過菌落pcr均擴增出與目的片段大小相同的特異性條帶，說明挑取的五株dh5α菌株中均成功轉入重組質粒；將驗證陽性的克隆子接入lb液體培養基（含100
µ
g/ml壯觀黴素）中過夜培養，收集菌體並提取質粒（omega plasmid mini kit i試劑盒，美國omega公司），用bamhⅰ、ecor
ⅴ
對prhrkzwf1進行雙酶切驗證，結果見圖4，結果表明，重組質粒prhrkzw1經雙酶切後產生了1.5kb 和10kb左
右的兩個條帶（圖4第4泳道），這兩個條帶分別與rkzwf1片段和prh2034載體經雙酶切後的片段大小一致，初步表明重組質粒prhrkzwf1構建成功，重組載體prhrkzwf1的質粒圖譜見圖2；將酶切驗證正確的質粒送出測序進一步進行驗證，經測序（昆明碩擎生物科技有限公司），測序結果顯示所擴增得到的片段大小為1542bp，與轉錄組序列一致，核苷酸序列如seq id no:1所示，命名為rkzwf1。
12.3、挑取成功轉入正確重組載體prhrkzwf1的dh5α菌株單克隆接入lb液體培養基（含100
µ
g/ml壯觀黴素）中過夜培養，提取質粒（omega plasmid mini kit i試劑盒，美國omega公司），測量濃度，並置於-20℃儲存備用。利用peg介導的原生質體轉化法將重組載體prhrkzwf1轉化至紅冬孢酵母ym25235中，具體方法如下：挑取紅冬孢酵母ym25235單菌落接種於5ml的ypd液體培養基中，於28℃、160rpm振蕩培養過夜，將其作為種子液；將種子液按1%的接種量轉接至50ml的ypd液體培養基中，於28℃、160rpm振蕩培養至菌液od
600
為0.45~0.5之間，將菌液於4℃、4500 rcf離心5 min收集菌體；收集的菌體用事先準備好的檸檬酸緩衝液（30mmol/l檸檬酸、83mmol/l檸檬酸鈉、600mmol/l甘露醇、naoh調ph值到5.4）洗滌兩次，繼續用800-1000μl檸檬酸緩衝液懸浮菌體，置於冰上備用；配製酶解液（0.075g蝸牛酶、0.03gsigma溶壁酶、0.03g廣東微生物溶壁酶，用檸檬酸緩衝液定容至5ml），並用0.22μm無菌濾膜過濾，置於5ml無菌離心管中備用；取4ml酶液與800-1000μl檸檬酸緩衝液懸浮的菌體混合後置於28℃、90rpm振蕩培養2.5-3h進行酶解，取少許菌液用顯微鏡觀察酶解效率，在確認酶解數量足夠多的情況下，將培養物於4℃、1300rcf離心10min收集菌體；加入10ml stc緩衝液（1.2mol/l山梨醇、10mmol/l tris-hcl、100mmol/l cacl2）於冰上洗滌收集的菌體兩次，製成酵母感受態細胞；用800-1000μl的stc緩衝液懸浮菌體，按每管100μl分裝到5ml無菌離心管中備用；向100μl感受態細胞中加入10μl 、濃度210.36μg/ml的prhrkzwf1重組質粒並輕輕混勻，冰上孵育10min，加入200μl預冷的ptc緩衝液（50%peg、10mmol/l tris-hcl、100mmol/l cacl2），冰浴10min，再次加入200μl預冷的ptc緩衝液，冰浴10min，最後加入800μl預冷的ptc緩衝液，並輕輕混勻，於42℃水浴30min，水浴結束後4℃、1500rcf離心10min收集菌體，棄去1ml上清，加入1ml 0.4mol/l蔗糖ypd液體培養基懸浮，28℃、90rpm振蕩培養24h復甦菌體；將復甦的菌體於1300rpm離心10min收集菌體，棄上清剩餘100μl培養基懸浮菌體，最後塗布於0.4mol/l蔗糖ypd固體培養基（含40μg/ml潮黴素b）上，於28℃倒置培養3-4天待固體培養基上長出，將轉化子編號，並轉接到含150μg/ml潮黴素b的ypd固體培養基上，於28℃倒置培養兩天；根據該基因的已知功能及紅冬孢酵母ym25235的特性，以顏色作為過表達菌株篩選的依據，具體操作為將所得轉化子接菌於5ml 含ypd液體培養基的試管中，於28℃、160rpm振蕩培養120h，以ym25235野生菌株作為對照，觀察顏色，篩選出顏色比ym25235較紅的轉化子；挑取篩選出的轉化子，然後按照dna 提取試劑盒（購買於上海生工生物工程股份有限公司）說明書中的步驟提取酵母轉化子的基因組 dna，後進行pcr驗證，結果如圖5所示，從圖中可以看出以轉化子的基因組為模板通過pcr可擴增出與rkzwf1的cdna片段大小相同的條帶，重組轉化子的基因驗證正確，說明rkzwf1片段已成功導入酵母轉化子的基因組中。
13.實施例2：過表達菌株ym25235/prhrkzwf1的類胡蘿蔔素含量分析將陽性轉化子接種於 50ml ypd 液體培養基中，28℃、160rpm 發酵培養168h 後，4500rpm離心6min收集菌體於50ml離心管中，用預冷的ddh2o洗滌兩次，最後4500rpm離心
8min徹底去除上清，輕輕敲擊管壁使得菌體均勻黏附在管內壁上，置於烘箱中55℃烘乾後把菌體研磨成粉，取0.4g菌粉使用丙酮-甲醇混合液（v
（丙酮）
：v
（甲醇）
=4:1）提取總類胡蘿蔔素，參照楊萬政等的「紫外分光光度法測定沙棘油中總類胡蘿蔔素方法改進[j].中央民族大學學報(自然科學版),2009,18(03):5-8.」中的方法，利用紫外-可見分光光度計，以野生型紅冬孢酵母ym25235菌株為對照，在450nm下測定吸光度並計算總類胡蘿蔔素的含量（mg/g幹菌體），其中野生型紅冬孢酵母ym25235菌株的總類胡蘿蔔素合成量為5.535
±
0.092mg/g，而過表達菌株ym25235/prhrkzwf1類胡蘿蔔素合成量為6.735
±
0.106mg/g，過表達菌株ym25235/prhrkzwf1總胡蘿蔔素合成量是對照菌的1.22倍過表達菌株ym25235/prhrkzwf1的總類胡蘿蔔素合成量較野生型紅冬孢酵母ym25235菌株明顯提高（如圖6所示）；結果顯示葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因rkzwf1的過表達能引起紅冬孢酵母ym25235菌株中總類胡蘿蔔素含量的增加，rkzwf1基因能夠促進總類胡蘿蔔素的合成。