用於治療缺血性心血管疾病的製劑及其製備方法
2023-06-10 13:55:56
專利名稱：用於治療缺血性心血管疾病的製劑及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種可以治療缺血性心血管疾病的製劑及其製備方法。
背景技術：
心血管疾病是世界上致死率和發病率最高的疾病。根據2010年美國心臟學會的 統計報告指出，2005年全世界大約有1750萬人死於各類心血管疾病，大約佔死亡總人數的 30%。預計到2020年，全球因心血管疾病死亡人數將達2500萬人。另據WHO的報告指出，在 2006年到2015年的10年之間，中國在因心血管病及糖尿病而導致的收入損失將高達5580 億美元。在2004年歐洲有430萬人死於各類心血管疾病，高達總死亡人數的48%。在各類 心血管疾病中，動脈粥樣硬化所導致的血栓及血管堵塞是最常見和最重要的發病機理。在 疾病初期，由活性氧激發的對低密度脂蛋白的修飾會逐漸導致血管內皮機能障礙。機體的 免疫系統對此產生慢性炎症並持續分泌富含T細胞，巨噬細胞，肥大細胞的白血球細胞群， 並形成脂紋，纖維斑塊，粥樣斑塊，使血管腔狹窄並導致血流量減少。當最終粥樣斑塊破碎 後，脫落的碎斑會導致血小板聚集並產生大規模的閉合性血栓及其他繼發性改變，包括由 該動脈所供應養份的組織或器官的缺血或壞死。由動脈粥樣硬化所導致的缺血性心血管疾 病主要包括有冠心病，中風，以及外周閉塞性動脈疾病。其中冠心病是世界上致死率最高的 單項疾病，2005年全球有760萬人死於此病；全球每年的中風患者有1500萬人，並導致500 萬人終身殘疾及570萬人死亡；在北美和歐洲有將近2700萬人患有各種程度的外周閉塞性 動脈疾病，一項2003年的研究表明，全球有將近20%的成年人患有無症狀的輕度外周閉塞 性動脈疾病。儘管有保守鍛鍊，化學藥物，和手術搭橋的傳統治療手段，大部分由動脈粥樣 硬化所導致的缺血性心血管病患者依然無法獲得有效的治療，究其原因，主要是因為對保 守治療和化學藥物的不敏感，以及身體或疾病條件而無法進行有效的手術搭橋等。幹細胞療法是近年來在治療癌症和心血管疾病等領域最受人期待的新發展方向。 從理論上講，幹細胞可以用於各種疾病的治療，但其最適合的疾病主要是組織壞死性疾病 如缺血引起的心肌壞死，退行性病變如帕金森症候群，自體免疫性疾病如胰島素依賴型糖 尿病等。尤其是其具有的促進血管再生和器官功能恢復的特殊功效，在心血管疾病的治療 中有著巨大療效。在全球現階段開展的臨床試驗中，針對缺血性心血管疾病的促血管再生幹細胞移 植作為一種極有希望替代傳統療法的再生療法已取得了很好的效果。然而，考慮到異體移 植所帶來的免疫應答及其嚴重的組織排斥甚至致死後果，(包括患者自身的免疫系統對異 體幹細胞的排斥及異體幹細胞群落中不可避免的含有的異源免疫細胞亞群對患者組織的 排斥)，此類臨床試驗都使用了患者自體同源的細胞。另外，在檢測了不同器官組織來源 的幹細胞種群之後發現，來源於骨髓及外周血液的成體CD34+幹細胞亞類具有極強的促血 管再生能力，在治療缺血性血管疾病中有較好的效果，也免除了採用胚胎幹細胞所帶來的 倫理問題。然而，現階段一系列技術和應用上的不足極大的限制了幹細胞療法在臨床上的 進一步推廣和應用，這些限制包括並不局限於(1)此類幹細胞在骨髓及血液中的極低含量(大約0.01%) ； (2)此類細胞療法所需細胞的極大數量(IX IO5-I X IO6個/千克體重)； (3)細胞移植入體內後的極低存活率和存活細胞的實際效率(低於10% )；以及(4)患者 自體幹細胞因慢性疾病及長期大量心血管危險因子的影響所導致的功能失常。基於上述事實，特別是現有的幹細胞療法應用於臨床時的缺陷和不足，有必要提 供更為有效、普適的治療缺血性心血管疾病藥物，以改善現有的由動脈粥樣硬化所導致的 缺血性心血管疾病的臨床治療狀況。血管內皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPC)是調節和誘導新血管生 成的主要幹細胞亞類。動物體內實驗數據表明，EPC參與血管生成的過程主要有(1)少量 細胞分化為成熟的內皮細胞，形成新的血管內壁以及(2)大部分細胞分泌出大量促血管新 生的生長因子和細胞活素，激發缺血組織內部的內皮細胞，平滑肌細胞，壁細胞及其他幹細 胞亞群及祖細胞亞群共同參與新血管的形成。事實上，此類EPC在缺血組織中分泌出的生 長因子和細胞活素，可藉由EPC在體外特定環境中所分泌的條件培養基中獲得，並完全可 能將其應用於受損血管的修復和再生，從而恢復缺血性壞死的組織的相應功能。因此，EPC 在體外人工環境中分泌的促血管新成的生長因子和細胞活素在臨床上有巨大的潛力，可以 作為幹細胞療法的有效替代品或輔助藥物。
發明內容
本發明的目的在於提供一種能夠有效的治療缺血性心血管疾病的製劑，用於克服 現有藥物的不足，為臨床治療缺血性心血管疾病提供一種新的治療藥物。上述缺血性心血管疾病主要指由於動脈粥樣硬化導致的血管阻塞類的疾病，具體 包括在冠狀動脈中產生粥狀硬化所引起的冠心病，心絞痛、心肌梗塞、心律失常。本發明的目的還在於提供一種製備能夠有效的治療缺血性心血管疾病的製劑的 方法，該方法步驟為1)從健康人血液中通過密度梯度離心的方法或白細胞置換(leukapheresis)獲 取外周血單核細胞，或從骨髓中通過密度梯度離心的方法獲取骨髓單核細胞；2)培養單核細胞以獲得EPC細胞；3)在特定條件下培養EPC細胞使其分泌促血管生成的生長因子和細胞活素，分離 EPC細胞和培養基，獲得富含促血管生成因子和細胞活素的無細胞培養基；4)對步驟3)中所獲得的無細胞培養基進行後處理，該後處理步驟包括過濾細胞 碎片、純化該無細胞培養基、檢測各有效生長因子的成分及含量、對該培養基進行凍幹處理 或冷凍保存，即獲得治療缺血性心血管疾病製劑。本發明所述製備能夠有效的治療缺血性心血管疾病的製劑的方法中，步驟1)所 述的健康人血液的來源可以是自體來源(僅局限於無症狀的輕度外周閉塞性動脈疾病) 或異體來源，獲得途徑可以是直接抽血，或由血庫直接購買的健康人白細胞懸液樣本，或 通過臨床白細胞置換。血液提供者的限制範圍為50歲以下，無菸酒史，無傳染性疾病， 血液疾病的健康人群。所述的梯度離心以獲取單核細胞的步驟為將所獲得的血液或白 細胞懸液在密度梯度劑中梯度離心，所用的梯度劑可為FiC0ll-Paque(GE healthcare), Histopaque-1077 (Sigma)，或其他公司同類產品，優選為Histopaque-1077 ；適用溫度範圍 為15到25°C，優選為25°C ；每15mL Histopaque可分離15至30mL全血樣品。具體操作為將含有血液及梯度劑的容器在200g-500g下離心20-40分鐘，分層後，用無菌一次性針 管吸取當中不透明層，即為富含單核細胞的懸浮液，經鑑定，此單核細胞群體來源於骨髓髓 系幹細胞，豐富表達單核細胞特異性受體CD14，其內所含多種細胞亞群，呈多形性。本發明所述製備能夠有效的治療缺血性心血管疾病的製劑的方法中，步驟2)中 的培養單核細胞所用的培養基可為Ml 19、DMEM、RPMI-1640、EBM、EBM-2中的一種，並添加有 0. 5-1%的生長因子添加劑EGM、EGM-MV、EGM-2或EGM2-MV中的一種(由瑞士 Lonza公司購 買，其中含血管內皮生長因子VEGF-1、鹼性成纖維細胞生長因子FGF 2、表皮生長因子EGF， 和胰島素樣生長因子IGF-1)；或添加有內皮細胞生長因子ECGF(10100yg/ml)。培養基中 另含有質量比為5%至20%的胎牛血清或者人血清白蛋白。在預設條件為培養溫度37°C， 二氧化碳濃度為5%的細胞培養箱中培養。本發明所述製備能夠有效的治療缺血性心血管疾病的製劑的方法中，步驟2)中 的培養單核細胞以獲得EPC細胞的步驟為以下所述方法①，②，③或④中的一種方法①將單核細胞以每平方釐米5X IO5至2X IO6個細胞的密度培養2_4天，將 貼壁細胞用胰蛋白酶消化收集後以每平方釐米1 X IO5至2 X IO5個細胞的密度重新培養3-7 天。所獲I型EPC為紡錘狀細胞，具有內吞乙縮醛化的低密度脂蛋白(acetylated-LDL)及 結合荊豆凝集素(UEA-1 lectin)的典型內皮細胞特性，並且大量表達血管內皮細胞生長因 子受體KDR，⑶31，單核細胞受體⑶14，造血細胞受體⑶45，少量表達幹細胞特有受體⑶34， CD133。方法②將單核細胞以每平方釐 米5X IO5至2X IO6個細胞的密度培養2天，收集 懸浮細胞，並以每平方釐米IX IO5至2X IO5個細胞密度重新培養3-7天。所獲II型EPC 為細胞集落，其中心分布為圓形細胞，周圍為紡錘狀細胞。此II型EPC具有典型內皮細胞 特性並表達內皮細胞特有受體KDR，CD31及Tie-2。方法③將單核細胞以每平方釐米5X IO5至2X IO6個細胞的密度培養1_6天， 將貼壁細胞用胰蛋白酶消化收集後以每平方釐米1 X IO5至2 X IO5個細胞的密度重新培養 10-21天。所獲III型EPC為細胞集落，並可持續培養及增殖12個星期以上，此III型EPC 具有典型內皮細胞特性並表達內皮細胞特有受體KDR，CD31，Tie-2，及Ve-cadherin。方法④將單核細胞通過⑶34特異性抗體進行磁珠分選(MACS ,由德國Miltenyi Biotec公司生產)，篩選出富含⑶34+的單核細胞亞群，將此⑶34+單核細胞亞群在步驟2) 中所描述的培養基及培養條件下以每平方釐米1 X IO5至1 X IO6個細胞的密度培養2-6天。 所獲IV型EPC為CD34+細胞集落，此IV型EPC具有典型內皮細胞特性並表達內皮細胞特 有受體KDR及幹細胞特有受體⑶34。本發明所述製備能夠有效的治療缺血性心血管疾病的製劑的方法中，步驟3)中 的在特定條件下培養EPC細胞的方法為將步驟2)所獲得的I、II、III或IV型EPC置於不 含任何生長因子的培養基內，在氧濃度為0. 5%至2%的環境中培養1至3天，所用的培養 基為 M119、DMEM、RPMI-1640、EBM、EBM-2、pH = 7.4 的磷酸鹽緩衝液(PBS)或 0.9% 的醫用 生理鹽水，並可添加的醫用人血清白蛋白。培養完成後收集富含細胞生長因子的條件培養基，棄去EPC細胞。本發明所述製備能夠有效的治療缺血性心血管疾病的製劑的方法中，步驟4)所 述的後處理步驟包括
①對步驟3)中所收集的無細胞培養基進行過濾，可通過高速離心或過濾器將細 胞雜質及碎片去除。②對過濾後的無細胞培養基進行成分鑑定，並對其中所含的代表性促血管生長因 子及細胞活素如MCP-I，EGF, MMP-9, IL-8，Angiogenin, VEGF的含量進行鑑定，鑑定方法可 為蛋白組學(proteomics)，細胞活素陣列(cytokine array)，酶聯免疫吸附測定(ELISA)， 或Bio-Plex 細胞因子測試。③對過濾後的無細胞培養基進行凍幹或分裝冷凍保存，以便長期保存其中的生長 因子及細胞活素成分的活性。
圖1 本發明所述治療缺血性心血管疾病製劑對成體內皮細胞的存活影響。圖2 本發明所述治療缺血性心血管疾病製劑對大鼠急性心肌梗塞損傷的修復。
具體實施例方式以下通過具體的實例對本發明的內容作進一步的闡述說明，本發明包括但不限於 下述步驟和內容。實施例1.單核細胞的製備。將 IOOmL 血液加入密度梯度劑 Histopaque-1077 (Sigma)，每 15mL Histopaque 中 加入30mL血液。將含有血液及梯度劑的試管在400G的速度下常溫離心30分鐘。分層後， 用無菌一次性針管吸取當中不透明層，即為富含單核細胞的懸浮液。視具體情況，每IOOml 血液可以獲得IxlO8 IxIOiq個單核細胞。實施例2. EPC細胞的獲取。針對I類EPC細胞的獲取方法將富含單核細胞的懸浮液在添加有10%人血清 白蛋白及的生長因子添加劑EGM(由瑞士 Lonza公司購買，其中含血管內皮生長因子 VEGF-1、鹼性成纖維細胞生長因子FGF-2、表皮生長因子EGF，和胰島素樣生長因子IGF-1) 的EBM-2培養基下以每平方釐米IX IO6細胞的密度培養4天，將貼壁細胞用胰蛋白酶消化 收集後以每平方釐米2 X IO5的密度重新培養2天。所獲I型EPC為紡錘狀細胞，具有內吞 乙縮醛化的低密度脂蛋白(acetylated-LDL)及結合荊豆凝集素(UEA-1 lectin)的典型 內皮細胞特性，並且大量表達血管內皮細胞生長因子受體KDR、⑶31、⑶14、⑶45、少量表達 CD34、CD133及血管內皮鈣粘蛋白VE_cadherin。針對II類EPC細胞的獲取方法將富含單核細胞的懸浮液在添加有10%人血清 白蛋白及的生長因子添加劑EGM(由瑞士 Lonza公司購買，其中含血管內皮生長因子 VEGF-1、鹼性成纖維細胞生長因子FGF-2、表皮生長因子EGF，和胰島素樣生長因子IGF-1) 的EBM-2培養基下以每平方釐米1 X IO6細胞的密度培養2天，收集懸浮細胞，並以每平方釐 米2X IO5個細胞的密度重新培養3天。所獲II型EPC為細胞集落，其中心分布為圓形細 胞，周圍為紡錘狀細胞。此II型EPC具有典型內皮細胞特性並表達內皮細胞特有受體KDR， CD31 及 Tie-2。針對III類EPC細胞的獲取方法將富含單核細胞的懸浮液在添加有10%人血 清白蛋白及的生長因子添加劑EGM(由瑞士 Lonza公司購買，其中含血管內皮生長因子VEGF-1、鹼性成纖維細胞生長因子FGF-2、表皮生長因子EGF，和胰島素樣生長因子IGF-1) 的EBM-2培養基下以每平方釐米IX IO6個細胞的密度培養3天，將貼壁細胞用胰蛋白酶消 化收集後以每平方釐米2 X IO5個細胞的密度重新培養20天。所獲III型EPC為細胞集落， 具有典型內皮細胞特性並表達內皮細胞特有受體KDR，CD31，Tie-2，及Ve-cadherin。針對IV類EPC細胞的獲取方法將單核細胞通過CD34特異性抗體通過磁珠分選 (MACS ,由德國MiltenyiBiotec公司生產)，篩選出富含⑶34+的單核細胞亞群，將此⑶34+ 單核細胞亞群在在添加有10%人血清白蛋白及的生長因子添加劑EGM(由瑞士 Lonza 公司購買，其中含血管內皮生長因子VEGF-1、鹼性成纖維細胞生長因子FGF-2、表皮生長因 子EGF，和胰島素樣生長因子IGF-1)的EBM-2培養基下以每平方釐米5 X IO5個細胞的密度 培養2天。所獲IV型EPC為⑶34+細胞集落，此IV型EPC具有典型內皮細胞特性並表達 內皮細胞特有受體KDR及幹細胞特有受體CD34。視具體情況，所獲得的各型EPC細胞的量約為單核細胞量的 10%。實施例3.治療缺血性心血管疾病製劑的獲取。將實施例2所獲得的I型EPC細胞置於不含任何生長因子的磷酸鹽緩衝液(PBS) 內(每平方釐米2 X IO5個細胞)，在氧濃度為1. 5%的環境中培養2天，並添加1 %的醫用人 血清白蛋白。培養完成後收集富含細胞生長因子的無細胞培養基，棄去貼壁的EPC細胞。將 收集的無細胞培養基通過孔徑為0. 2微米的過濾器將細胞雜質及碎片去除並分裝於-80°C 冷庫冷藏備用。視具體情況，每IxlO6個EPC細胞可以製備2-5ml所述治療缺血性心血管 疾病製劑。實施例4.治療缺血性心血管疾病製劑中的生長因子及細胞活素的鑑定。實施例3所製得的治療缺血性心血管疾病製劑中含有的生長因子及細胞活素成 分通過細胞活素陣列(cytokine array)鑑定(由R&D Systems購買)，此治療缺血性心 血管疾病製劑的有效成分包含並不局限於以下生長因子MCP-1、EGF、IL-8、MMP-9、μ PAR、 Angiogenin、SDF-I、HGF、VEGF 以及 PDGF。通過 Bio-Plex 細胞因子測試檢測(由 Bio-rad 公司生產)，其中有效成分的含量為，IL-8 :1-4μ g/ml ；SDF-I :50_100ng/ml ；HGF :5_10ng/ ml ；Angiogenin :l_5ng/ml ；PDGF-BB :l_5ng/ml ；VEGF 0. 1-lng/ml。其他成分組成見表 1。表1.本發明所述治療缺血性心血管疾病製劑中的成分列表(包含並不局限於以 下成分)
權利要求
一種治療缺血性心血管疾病的製劑的製備方法，其特徵在於，該製劑的製備方法包括如下步驟步驟1).從健康入血液中通過密度梯度離心的方法或白細胞置換(leukapheresis)獲取外周血單核細胞，或從骨髓中通過密度梯度離心的方法獲取骨髓單核細胞；步驟2).培養單核細胞以獲得EPC細胞；步驟3).在特定條件下培養EPC細胞使其分泌促血管生成的生長因子和細胞活素，分離EPC細胞和培養基，獲得富含促血管生成因子和細胞活素的無細胞培養基；步驟4).對步驟3)中所獲得的無細胞培養基進行後處理，該後處理步驟包括過濾細胞碎片、純化該無細胞培養基、檢測各有效生長因子成分及含量、對該培養基進行凍幹處理或冷凍保存，即獲得治療缺血性心血管疾病的製劑。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟1)所述的健康入血液的來源可 以是自體來源，或異體來源，或通過血庫購買的健康人白細胞懸液樣本，或通過臨床白細胞 置換。
3.根據權利要求1-2任一所述的製備方法，其特徵在於，步驟1)所述的從血液中 或骨髓中通過密度梯度離心獲取外周血單細胞的方法為使用梯度劑為Ficoll-Paque、 Histopaque-1077或其他同類產品，溫度為15 25°C，離心力為200g_500g，時間20-40分 鍾，離心完成後，吸取當中不透明層，即為單核細胞懸液。
4.根據權利要求1-3任一所述的製備方法，其特徵在於，步驟2)中的培養單核細胞所 用的培養基為M119、DMEM、RPM1-1640、EBM、EBM-2中的一種，並添加有0. 5-1 %的生長因子 添加劑EGM、EGM-MV, EGM-2或EGM2-MV中的一種(由瑞士 Lonza公司購買，其中含血管內 皮生K因子VEGF-1、鹼性成纖維細胞生長因子FGF-2、表皮生長因子EGF，和胰島素樣生長 因子IGF-1)；或添加有內皮細胞生長因子ECGF(10-100 μ g/ml)；或添加有內皮細胞生長因 子ECGF(10-100 μ g/ml)；培養基中另含有質量比為5%至20%的胎牛血清或者人血清白蛋 白；培養條件為溫度37°C，二氧化碳濃度為5%。
5.根據權利要求1-4任一所述的製備方法，其特徵在於，步驟2)所述的培養單核細胞 以獲得EPC細胞的方法為以下所述方法①、②、③或④中的一種方法①將單核細胞以每平方釐米5 X IO5至2 X IO6個細胞的密度培養2-4天，將貼壁 細胞用胰蛋白酶消化收集後以每平方釐米1 X IO5至2 X IO5個細胞的密度重新培養3-7天， 獲I型EPC細胞；方法②將單核細胞以每平方釐米5 X IO5至2 X IO6個細胞的密度培養2天，收集懸浮 細胞，並以每平方釐米1 X IO5至2X IO5個細胞的密度重新培養3-7天，獲II型EPC細胞；方法③將單核細胞以每平方釐米5X IO5至2X IO6個細胞的密度培養1-6天，將貼壁 細胞用胰蛋白酶消化收集後以每平方釐米IX IO5至2X IO5個細胞的密度重新培養10-21 天，獲III型EPC細胞；方法④將單核細胞通過CD34特異性抗體進行磁珠分選，篩選出富含CD34+的單核細 胞亞群，將此CD34+單核細胞亞群在步驟2)中所描述的培養基及培養條件下以每平方釐米 1 X IO5至1 X IO6個細胞的密度培養2-6天，獲IV型EPC細胞。
6.根據權利要求1-5任一所述的製備方法，其特徵在於，步驟3)所述的在特定條件下 培養EPC細胞的方法為將步驟2)所獲得的EPC細胞置於不含任何生長因子的培養基內，在氧濃度為0. 5%至2%的環境中培養1至3天，所用的培養基為M119、DMEM、RPMI-1640, EBM、EBM-2、pH值為7. 4的磷酸鹽緩衝液(PBS)或0. 9%的醫用生理鹽水，並添加的醫 用人血清白蛋白。
7.根據權利要求1-6任一所述的製備方法，其特徵在於，不添加的醫用人血清白蛋白。
8.根據權利要求1-7任一所述的製備方法，其特徵在於，所述EPC細胞為I型EPC細胞。
9.一種由權利要求1-8任一所述的方法製備獲得的製劑。
10.權利要求9所述的製劑在製備治療缺血性心血管疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種用於治療缺血性心血管疾病的製劑及其製備方法，該製劑的製備方法是通過誘導單核細胞獲得血管內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPC)，進而在低血清及低氧條件培養上述EPC細胞，最後分離EPC細胞獲得無細胞培養基，並對該無細胞培養基進行相應後處理，即可獲得所述製劑。體外和體內實驗表明，本發明所述的治療缺血性心血管疾病的製劑及其製備方法能夠有效的治療缺血性心血管疾病。
文檔編號A61K35/28GK101940594SQ20101026568
公開日2011年1月12日 申請日期2010年8月27日 優先權日2010年8月27日
發明者楊子江, 楊肖泱, 顧麗婭 申請人:上海士騰生物技術有限公司;楊子江