氨基修飾的磁性納米粒子及免疫磁性納米分離試劑的製備方法
2023-06-10 11:09:46
專利名稱：氨基修飾的磁性納米粒子及免疫磁性納米分離試劑的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種適於產業化的氨基修飾的磁性納米粒子及由其製得的 免疫磁性納米分離試劑的製備方法。
背景技術：
在20世紀70年代後期，磁性分離技術開始應用於生物學領域，目前已 經在細胞學、分子生物學、生物化學和生物醫學等方面取得了令人矚目的研 究成果。磁性分離技術是以磁性粒子為載體，包被酶、蛋白質、多肽、抗體和抗 原等生物分子，在外加磁場的定向控制下，通過親和吸附、清洗、解吸等操 作，可以一步從複雜的生物體系中分離到目標物分子，具有磁性分離簡單方 便、親和吸附高特異性及高敏感性等眾多優點，從而作為一類新型功能性材 料被廣泛應用於生物醫學、免疫分析領域。磁性納米粒子(粒徑l 100nm) 作為生物分子載體具有(l)高的比表面積及能量和良好的分散性，可吸附或 鍵合更多生物分子；(2)納米級磁性粒子更易懸浮於目標分離劑中，可大大提 高吸附或鍵合目標分子效率；(3)低的質量傳遞阻力；(4)因磁性納米粒子粒 徑小可在體內被細胞吞噬，從而為診斷與治療體內疾病提供了廣闊的發展空 間。目前，文獻報導中製備磁性納米粒子的方法大致有如下幾大類a.共沉 澱法；b.微乳液法；C.熱分解法；d.生物合成法；e.部分還原法；f.水熱合成法等，這些方法均為成熟的納米粒子製備技術，為了防止合成出來的磁性納 米粒子之間因範德華力作用產生團聚、沉降現象，通常需要在其表面引入高密度保護分子作為穩定劑，保護層可以是無機材料、有機分子或聚合物，這 樣可以有效的保持磁性納米粒子在溶液中良好的分散性。迄今為止，有關對磁納米粒子進行修飾，並應用於免疫磁性納米分離試 劑的研究較多，但國內多限於實驗室研究階段，國外已有此類產品銷售。如申請號為CN200610049213.9的專利申請公開了一種矽烷偶聯化納米磁性復 合四氧化三鐵材料的製備方法，利用矽烷偶聯劑直接對Fe304磁納米粒子進 行修飾，因磁粒子兼具有順磁性和鐵磁性，使得這種方法所製得的產物易於 團聚、粘連，從而不易分散，且Fe304易於氧化。再如申請號為 CN200510025324.1的專利申請公開了一種免疫磁性納米粒子細胞分離器及 其製法和應用，其中所涉及的免疫磁性納米粒子細胞分離器為首先通過油包 水型反相微乳液法製得具有核殼結構的磁性納米粒子，再通過N- (2-氨基乙 基)-3-氨基丙基三甲氧基矽垸在粒子表面修飾氨基，然後與抗體或配體偶聯 反應製得。然而，該發明仍處實驗室階段，其採用反相微乳液法製備的產物 粒徑、形貌雖均一但其產量極低，不適合產業化生產。發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種粒徑分布範圍窄且分散性較佳的 氨基修飾的磁性納米粒子以及由其製得的免疫磁性納米分離試劑的製備方 法，兩種製備方法均適於工業化生產。本發明將磁性Fe304納米粒子通過一定量矽烷試劑在甲苯和低級一元醇 混合溶劑中醇解，對磁性納米粒子表面進行矽膠包覆從而形成核殼結構，再 在相似反應條件下採用一定量矽垸偶聯劑以鍵合形式在矽膠包覆的磁性納 米粒子表面修飾氨基官能團，氮基經活化後，在一定的反應條件下偶聯生物 分子，從而得到最終產物——免疫磁性納米分離試劑。本發明採用在甲苯和 低級一元醇混合溶劑中醇解方式包覆矽膠，反應體系應充分除水，否則由於 水解速度快無法控制包覆過程，而使矽膠無法包覆磁納米粒子或包覆不均一。醇解則可避免這一情況的發生，通過磁性Fe304粒子表面羥基與矽烷試劑反應而最終實現矽膠包覆磁性Fe304納米粒子，並通過控制磁性Fe;04納米粒子與矽烷試劑、矽烷偶聯劑的用量比例及反應時間，使得製備的矽膠包覆及氨基修飾的磁性納米粒子粒徑分布範圍窄且分散性較佳、不易團聚；進 一步製得的免疫磁性納米分離試劑具有高的抗體結合率和低的非特異性結 合率、磁性分離快速等特性。而本發明製備方法選用的各種工藝條件溫和， 無需高溫高壓，重複性好；選用的試劑均為常規、價廉產品，且部分試劑可 回收再利用；故而成本低廉、適於工業化大生產。因此，本發明通過下列技術方案來解決上述技術問題。其中，氨基修飾 的磁性納米粒子的製備方法，可以包括下列步驟① 將磁性納米粒子與矽垸試劑按比例l:0.5 10(g/ml)添加，以體積比為 1:1 30的甲苯和低級一元醇混合溶液為反應溶劑，加熱至8(TC 12(TC在磁 性納米粒子表面進行矽膠包覆，得矽膠包覆的磁納米粒子-,② 將步驟①中矽膠的包覆磁納米粒子與矽烷偶聯劑按l:0.5 10(g/ml)比 例進行反應，反應溶劑及條件同步驟①，製得氨基修飾的磁性納米粒子。根據本發明，步驟①中所述的磁性納米粒子可以是現有任何鐵氧體磁性 納米粒子，所說的鐵氧體是指具有鐵磁性的金屬氧化物。本發明選用常用的 Fe304磁性納米粒子為例來說明。所說的Fe304磁性納米粒子可根據現有技 術自行合成，本發明優選共沉澱法來合成，如將強鹼溶液先在N2等惰性氣 體保護條件下，恆溫加熱至60 9(TC溫度範圍之後，取適當配比的三價鐵鹽、 二價鐵鹽、強酸混合溶液，快速加入至強鹼溶液中，強烈攪拌片刻後冷卻至 室溫，進行充分除水及除雜質，得到黑色的Fe304磁性納米粒子。本發明矽烷試劑是指一類單體表面具有矽醇、矽醚等基團與鐵氧體表面 羥基起反應生成矽膠，達到包覆磁納米粒子效果的試劑。本發明優選正矽酸 四乙酯(TEOS)或矽酸鈉。所說的低級一元醇是指CM—元醇，優選甲醇或乙醇。本發明步驟①中所述的磁性納米粒子與矽烷試劑的比例若過大，超過1:10，不僅造成試劑浪費、產物損失、難於清洗，而且未清洗淨的產物會影 響氨基修飾的效果；反之，比例太小，則無法完全包覆磁納米粒子。本發明 優選比例為l:4~6(g/ml)。因矽烷試劑易溶於甲苯，所以本發明反應溶劑選用甲苯作為介質，而低 級一元醇則為醇解介質，因此醇的用量可較甲苯過量，但太多，則不僅浪費， 還增加後處理的工作。本發明反應溶劑最優選體積比為1:1的甲苯和甲醇混 合溶液。本發明步驟①較佳地是進行回流18 30小時反應，在Fe304磁性納米粒 子表面包覆矽膠，得矽膠包覆的磁納米粒子。本發明步驟②中所述的矽膠包覆的磁納米粒子與矽烷偶聯劑的比例若 過大，不僅造成試劑浪費、產物損失、難於清洗，而且未清洗淨的產物會直 接影響下一步的反應；反之，比例太小，磁納米粒子表面修飾的氨基密度不 足，從而無法偶聯足夠的抗體。本發明優選為l:2 4(g/ml)。較佳地，為操作簡便和節約成本，步驟②中的反應溶劑與反應條件可設 置成與步驟①相同，故反應溶劑也優選體積比為1:1的甲苯和甲醇混合溶液， 並控溫回流18 30小時進行氨基修飾，使核殼結構的磁性納米粒子表面修飾 有較高密度的氨基活性基團，製備出氨基修飾的磁性納米粒子。其中，本發明所採用的矽垸偶聯劑為一類具有氨基修飾的反應試劑，如 市售各種型號矽烷偶聯劑，DB550、 KH792及SG-Si900等。另外，同常規，上述步驟①、②反應條件優選在惰性氣體保護下以防止 Fe304磁性納米粒子氧化，反應過程中以50 100rpm速度進行充分攪拌；每 一步製得的產物均需充分清洗除去雜質和未反應物，其中，步驟①採用甲苯， 步驟②依次用甲苯、甲醇、水及PBS緩衝溶液清洗。在上述製備過程中，所產生的有機廢液均可通過蒸餾方式回收重新利 用，不可回收利用的剩餘廢液可以通過在指定地點燃燒進行處理，燃燒產物為C02和水，不造成環境汙染；清洗過程產生的水廢液中無環境汙染物質， 可直接排放。本發明上述製備方法製得的氨基修飾的磁性納米粒子可直接應用於免 疫磁性納米分離試劑的製備，因此，本發明免疫磁性納米分離試劑的製備方 法包括上述氨基修飾的磁性納米粒子製備方法的步驟，然後將步驟②製得的 氨基修飾的磁性納米粒子進行活化後，與抗體或配體進行偶聯反應。其中，活化步驟可以採用常規技術，氨基活化所選用的活化劑為具有二 個醛基基團以上的試劑，本發明優選戊二醛作為活化劑，具體步驟包括將該製得的氨基修飾的磁性納米粒子與活化劑戊二醛按比例1: 0.01~1 (g/ml)，優 選l: 0.08 0.2(g/ml)反應3 8小時，依次用去離子水、pH=7.0~8.5的PBS 緩衝溶液清洗；更優選比例約為l:0.1(g/ml)的氨基修飾的磁性納米粒子與活 化劑戊二醛攪拌反應6小時左右。所述的抗體或配體可根據需分離的樣品來選用，可以是蛋白質、胺基酸、 多肽、核酸等。較佳地，本發明與抗體進行偶聯反應，偶聯反應也可以採用 現有技術，包括將活化後的氨基修飾磁性納米粒子與抗體在-8 8t:下反應 24 48h，並採用有機羧酸或生化試劑封閉產物的醛基作為封閉試劑；更佳地， 本發明選用特定清洗液清洗，以更好地降低產品的非特異性結合率，所說的 特定清洗液為含有lw/v% NaN3、 O.OlMTris、 0.1w/v% BSA、 0.15MNaCl 和0.001MEDTA的水溶液。上述在經活化、偶聯生物分子的製備過程中，除清洗液外其它反應廢液 均直接排放，不造成環境汙染。在本發明一較佳實施例中，所述的活化後的氨基修飾磁性納米粒子與羊 抗兔抗體按重量比1:0.025，在(TC反應36小時；而所說的有機羧酸優選甘 氨酸，生化試劑優選牛血清白蛋白(BSA)。本發明製備方法中所需試劑除NaN3外，其它均為常規試劑，來源充足， 產品的附加值高，因此適合規模化生產。本工藝方法在各階段反應體系中均無嚴格的客觀條件要求例如高溫、高壓等等，反應體系穩定，僅需在惰性氣體保護、50 100rpm快速攪拌等常規條件下，適當對反應體系溫度進行控 制即可得到所需產物，大大提高了合成效率，且可重複性好；也無需特殊設 備，易於操作，推廣性強。本發明兩種製備方法在整個生產過程中條件溫和， 部分試劑可回收、純化再利用，可進一步節約成本，廢棄的反應液易處理， 對環境不造成汙染，符合可持續發展的綠色環保要求。製得的氨基修飾的磁 性納米粒子粒徑小且粒徑分布範圍窄(20 60nm)、分散性好、順磁性、磁響 應能力強。而製得的免疫磁性納米分離試劑質量穩定，可低溫存放，具有高 的抗體結合率和低的非特異性結合率、磁性分離快速等特性。
圖1為本發明製備方法各步驟製得的磁性納米粒子產物的透射電子顯微 鏡(TEM)形貌圖，其中，a)圖為本發明採用共沉澱法自制的Fe304磁性納 米粒子；b)圖為矽膠包覆的磁性納米粒子(矽烷化磁納米粒子)；c)圖為偶 聯蛋白的免疫磁性納米分離試劑。圖2為本發明採用共沉澱法自制的Fe304磁性納米粒子的磁滯回曲線。圖3為本發明Fe304磁性納米粒子及矽膠包覆的磁性納米粒子的X射線 粉末衍射(XRD)圖。圖4為本發明氨基修飾的磁性納米粒子活化後的原子力顯微鏡(AFM)圖。圖5為本發明免疫磁性納米分離試劑零結合管結合率及非特異性管結合 率曲線(A)和Logit-Log校準曲線(B)。
具體實施方式
下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明並不受其限制。 實施例11) 分別配製1250ml 0.5M NaOH、 125ml 1M FeCl3、 125ml 0.5M FeCl2 和125ml 0.4MHC1溶液，將NaOH溶液置於三頸燒瓶中，在N2保護條件下 恆溫水浴加熱至6(TC，將己配製的FeCb、 FeCb和HC1溶液混合後，快速 加入到三頸燒瓶中，並以50rpm速度攪拌15min後冷卻至室溫。依次用去離 子水、甲醇清洗5次，所得產物Fe304磁性納米粒子分散於甲醇中。所得產 物TEM圖如圖1 (a)所示；並對產物的磁性質進行檢測，如圖2磁滯回曲 線所示。2) 將上一步製備的產物(分散於甲醇中的Fe304磁性納米粒子，Fe304 磁性納米粒子20g)置於燒瓶中，按體積比l: l加入甲苯與甲醇共1000ml， 添加100ml正矽酸四乙酯(TEOS)，並將燒瓶升溫至8(TC，通入N2進行保 護，以50rpm速度強烈攪拌、回流18h後，用甲苯清洗6次得到包覆矽膠的 Fe304磁性納米粒子，並分散於甲苯中。所得產物TEM圖見圖1 (b)所示。 對產物進行了結構表徵——XRD分析，如圖3所示，說明矽膠為無定型的 膠態，衍射峰說明磁納米粒子為尖晶石結構Fe304。3) 將步驟2) 20g包覆矽膠的Fe3O4磁性納米粒子產物置於燒瓶中，加 入500ml甲苯與500ml甲醇，並加入60ml矽烷偶聯劑(KH792)。並將燒瓶 升溫至8(TC，通入N2進行保護，以50rpm速度攪拌、回流18h後，依次用 甲苯、甲醇、水、pH7.0的PBS緩衝溶液清洗數次得到氨基修飾的磁納米粒 子，並分散於PBS緩衝溶液中。產物TEM圖參見圖1 (c)。4) 將步驟3)修飾氨基的磁納米粒子20g與2ml戊二醛置於燒瓶中以 50rpm速度攪拌反應3h，產物依次用去離子水、pH7.0的PBS緩衝溶液清洗 數次，之後分散於PBS緩衝溶液中。其AFM圖譜請參見圖4。5) 在-8i:條件下，將步驟4)所得20g活化後的磁納米粒子與羊抗兔IgG 500mg以50rpm轉速攪拌反應24h，以pH7.0的PBS清洗數次後，添加1M、 pH7.0的甘氨酸100ml攪拌30min後，產物依次以去離子水，pH7.0PBS緩 衝溶液清洗，之後將所得產物再以特製的清洗液(lw/v^ NaN3、0.01MTriS、0.1w/v% BSA、 0.15MNaCl和0.001MEDTA的水溶液)清洗3次，再以其 分散產物，即可得到最終產物——免疫磁性納米分離試劑。 實施例21) 分別配製1250ml 0.5M KOH、 125ml 1M Fe2(S04)3、 125ml 0.5M FeS04 和125ml 0.4MHC1溶液，將KOH溶液置於三頸燒瓶中，在氬氣(Ar)保護 條件下恆溫加熱至7(TC，將己配製的Fe2(S04)3、 FeS04和HC1溶液混合後， 快速加入到三頸燒瓶中，並以100rpm轉速強烈攪拌20min後冷卻至室溫。 依次以去離子水、乙醇清洗數次，所得產物Fe304磁性納米粒子分散於乙醇 中。2) 將上一步製備的產物20g磁納米粒子置於燒瓶中，按體積比h 15 加入甲苯與乙醇1050ml，添加10ml矽酸鈉，並將燒瓶升溫至100°C，通入 Ar進行保護，以100rpm轉速強烈攪拌、回流24後，用甲苯清洗數次得到 包覆矽膠的Fe304磁性納米粒子。3) 將步驟2)產物20g包覆矽膠的磁納米粒子置於燒瓶中，按體積比1: 15加入甲苯與乙醇1050ml，並加入10ml矽垸偶聯劑(DB550)。並將燒瓶 升溫至100°C，通入Ar進行保護，以轉速為100rpm強烈攪拌、回流24h後， 依次用甲苯、乙醇、水、pH7.8的PBS緩衝溶液清洗數次得到修飾氨基的磁 納米粒子。4) 將修飾氨基的磁納米粒子20g與0.2ml戊二醛置於燒瓶中以100rpm 轉速攪拌反應6h，產物依次用去離子水、pH7.8的PBS緩衝溶液清洗數次。5) 在0'C條件下，步驟4)所得活化後的磁納米粒子20g與人抗兔IgG 500mg反應40h，以pH7.8 PBS清洗數次後，添加0.1w/v%BSA 150ml並攪 拌30min後分別用去離子水及pH7.8 PBS緩衝溶液清洗數次，再將所得產物 以上述特製的清洗液清洗數次，即可得到最終產物本發明免疫磁性納米分離 試劑。實施例31) 分別配製1250ml 0.5M KOH、 125ml 1M Fe2(S04)3、 125ml 0.5M FeS04 和125ml 0.4MHC1溶液，將KOH溶液置於三頸燒瓶中，在N2保護條件下 恆溫加熱至9(TC，將已配製的Fe2(S04)3、 FeS04和HC1溶液混合後，快速 加入到三頸燒瓶中，並以80rpm轉速強烈攪拌30min後冷卻至室溫。依次用 去離子水、甲醇清洗數次，所得產物Fe304磁性納米粒子分散於甲醇中。2) 將上一步製備的產物20g磁納米粒子置於燒瓶中，按體積比1: 30 加入甲苯與甲醇1000ml，添加200ml正矽酸四乙酯，並將燒瓶升溫至120°C， 通入N2進行保護，以80rpm速度強烈攪拌、回流30h後，通過甲苯清洗數 次得到包覆矽膠的Fe304磁性納米粒子。3) 將步驟2)產物20g包覆矽膠的磁納米粒子置於燒瓶中，按體積比1: 30加入甲苯與甲醇1000ml，並加入200ml矽烷偶聯劑(SG-Si卯O)。並將燒 瓶升溫至120°C，通入Ar進行保護，以轉速為80rpm強烈攪拌、回流30h 後，依次用甲苯、甲醇、水、pH8.2的PBS緩衝溶液清洗數次得到修飾氨基 的磁納米粒子。4) 將修飾氨基的磁納米粒子20g與20ml戊二醛置於燒瓶中反應8h， 產物依次用去離子水、pH8.5的PBS緩衝溶液清洗數次。5) 在8"C條件下，步驟4)所得活化後的磁納米粒子20g與單抗500mg 反應48h，以pH8.5 PBS清洗數次後，添加0.2w/v%BSA 100ml並以80rpm 攪拌45min後以去離子水、pH8.5 PBS清洗數次，再將所得產物以上述特製 的清洗液清洗數次，即可得到最終產物本發明免疫磁性納米分離試劑。上述實施例中的矽烷偶聯劑(KH792,DB550,SG-Si900)購自南京曙光 化工總廠和湖北德邦化工新材料有限公司；抗體(單抗，二抗)購自華美生 物工程有限公司上海分公司；其它試劑均購自上海國藥集團，且均為分析純。試驗實施例1按放射免疫分析法和標準檢測本發明產物的質量一一抗體結合率及非 特異性(通過北京科美東雅生物技術有限公司提供的藥盒，按照內附檢測說明書進行檢測)，結果如圖5所示，說明本發明免疫磁性納米分離試劑具有 較高的零結合管結合率及較低的非特異性管結合率，Logit-Log校準曲線方 程式為Y=2.80234-0.5708X， R=0.9975。
權利要求
1. 一種氨基修飾的磁性納米粒子的製備方法，其包括下列步驟①將磁性納米粒子與矽烷試劑按比例1∶0.5～10(g/ml)添加，以體積比為1∶1～30的甲苯和低級一元醇混合溶液為反應溶劑，加熱至80℃～120℃在磁性納米粒子表面進行矽膠包覆，得矽膠包覆的磁納米粒子；②將步驟①中矽膠包覆的磁納米粒子與矽烷偶聯劑按1∶0.5～10(g/ml)比例進行反應，反應溶劑及條件同步驟①，製得氨基修飾的磁性納米粒子。
2、 如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟①中所述的磁性納 米粒子為Fe304磁性納米粒子，矽垸試劑為正矽酸四乙酯或矽酸鈉，低級一 元醇為甲醇或乙醇。
3、 如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟①中所述的磁性納 米粒子與矽垸試劑的比例為l:4 6(g/ml)，反應溶劑為體積比為1:1的甲苯和 甲醇混合溶液。
4、 如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟①是在惰性氣體保 護下，攪拌並控溫回流18 30小時進行矽膠包覆。
5、 如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟②中所述的矽膠包 覆的磁納米粒子與矽烷偶聯劑的比例為l:2 4(g/ml)，反應溶劑為體積比為 1:1的甲苯和甲醇混合溶液。
6、 如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟②是在惰性氣體保 護下，攪拌並控溫回流18~30小時進行氨基修飾磁納米粒子。
7、 一種免疫磁性納米分離試劑的製備方法，其包括權利要求1 6任一 項所述的製備方法的步驟，然後將步驟②製得的氨基修飾的磁性納米粒子進 行活化後，與抗體或配體進行偶聯反應。
8、 如權利要求7所述的製備方法，其特徵在於所述的活化包括將該制 得的氨基修飾的磁性納米粒子與活化劑戊二醛按比例l:0.01 l(g/ml)，反應3~8小時。
9、 如權利要求7所述的製備方法，其特徵在於所述的與抗體進行偶聯 反應包括將戊二醛活化後的磁性納米粒子與抗體在-8 8'C下反應24~48h，並採用有機羧酸或生化試劑作為封閉試劑，並用清洗液清洗；其中清洗液為 含有lw/v% NaN3、0.01MTris、0.1w/v% BSA、0.15MNaCl和0.001MEDTA的水溶液。
10、 如權利要求9所述的製備方法，其特徵在於所述的戊二醛活化後的 磁性納米粒子與羊抗兔抗體按重量比1:0.025，在0"C反應36小時；所述的 有機羧酸為甘氨酸，生化試劑為牛血清白蛋白。
全文摘要
本發明公開了一種氨基修飾的磁性納米粒子的製備方法，其包括①將磁性納米粒子通過矽烷試劑在甲苯和低級一元醇混合溶劑中醇解對磁性納米粒子表面進行矽膠包覆，得到矽膠包覆的磁納米粒子；②將上述矽膠包覆的磁納米粒子與矽烷偶聯劑反應，製得表面修飾氨基官能團的矽膠包覆磁性納米粒子。本發明還公開一種包括上述製備方法的免疫磁性納米分離試劑的製備方法。本發明製備方法的反應體系穩定、溫和，操作簡單易控制，所用試劑原料成本低廉，反應廢液易處理不造成環境汙染，適於工業化生產。製得的氨基修飾的磁性納米粒子粒徑小且分布範圍窄，分散性良好；製得的免疫磁性納米分離試劑具有高的抗體結合率和低的非特異性結合率、磁性分離快速等特性。
文檔編號C07K1/00GK101269844SQ20071003835
公開日2008年9月24日 申請日期2007年3月23日 優先權日2007年3月23日
發明者尹端沚, 張國欣, 勝 梁, 汪勇先 申請人:中國科學院上海應用物理研究所