從中藥材圓錐鐵線蓮中分離純化活性成分金色醯胺醇酯的方法
2023-06-10 11:32:31 1
專利名稱：從中藥材圓錐鐵線蓮中分離純化活性成分金色醯胺醇酯的方法
技術領域：
本發明是關於中藥有效成分的提取分離方法，具體涉及一種從藥用植物圓錐鐵線 蓮中分離純化生物活性成分金色醯胺醇酯的方法。
背景技術：
圓錐鐵線蓮(C/eaaiisterniflora DC.)系毛茛科(Ranunculaceae)鐵線蓮屬 (Clematis)植物，用於治療扁桃體炎、咽喉炎以及風溼和類風溼性關節炎等，在日本做為中 藥威靈仙替代品使用，其地上部分在浙江北部地區廣泛用於呼吸系統和泌尿系統炎症、腫 瘤的治療，特別是對慢性咽炎和慢性前列腺炎療效甚佳；其地上部分的藥理研究證明，黃酮 及木脂素類成分具有顯著的生理活性。圓錐鐵線蓮在民間用藥中對於炎症反應和腫瘤所表 現出的確切療效激發了我們進一步研究其生物活性成分的興趣。在藥理活性相關實驗的指 導下，我們首次在圓錐鐵線蓮中分離純化得到一種藥效成分金色醯胺醇酯，此成分有文獻 報導具有很好的抗炎鎮痛活性，其抗炎機制是通過選擇性的抑制組織蛋白酶L和B來實現 (Koneni V. Sashidhara, Jammikuntla N. Rosaiah, Ethika Tyagi, Rakesh Shukla, Ram Raghubir, Siron M. Rajendran. Rare dipeptide and urea derivatives from roots of Moringa oleifera as potential anti~inflammatory and antinociceptive agents. European Journal of Medicinal Chemistry, 2009, 432-436. ； Kengo Isshiki, Yasuyuki Asai, Sumiko Tanaka, Maki Nishio, Tomofumi Uchida, Toru Okuda, Saburo Komatsubara, Naoki Sakurai. Aurantiamide acetate, a selective cathepsin inhibitor, produced by Aspergillus penicilloides. BioscL Biotechnol. Biochem., 2001, 1195-1997.)。此外，我們選擇神經膠質瘤細胞U251和U87對金色醯胺 醇酯進行了初步體外藥理篩選，結果表明金色醯胺醇酯具有一定的抗腫瘤活性，其對U251 和U87抑制的IC50均為25 μ Μ,金色醯胺醇酯對U251和U87的抑制機制是通過誘導腫瘤細 胞產生自噬來實現的。本發明提供一種從中藥圓錐鐵線蓮中分離純化生物活性成分金色醯 胺醇酯的方法，此方法得到的金色醯胺醇酯純度較高，其產率(純品質量/藥材質量)可達到 0. 001% 0. 1%。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種從藥用植物圓錐鐵線蓮中分離純 化生物活性成分金色醯胺醇酯的方法。從藥用植物圓錐鐵線蓮中分離純化生物活性成分金色醯胺醇酯的方法的步驟如 下
A 將新鮮採摘的毛茛科圓錐鐵線蓮藥材全草或莖葉於室溫下陰乾，切段，加入2 50 倍體積份濃度為1% 100%的乙醇，採用冷浸、滲漉、煎煮、超聲、加熱回流或微波進行提取， 提取時間為0. 1 5小時，過濾，藥渣用上述方法再提取2 10次，合併提取液，回收乙醇，得到總提物浸膏；
B 取步驟A中總提物浸膏用1 20倍體積份的水稀釋，上裝有非極性、弱極性或 中極性中的任意一種大孔樹脂分離柱進行純化，大孔樹脂用量為藥材量的2 40倍重量 份，分離柱的徑高比為1 :3 30，吸附流速為1 10BV/h ；先用體積比為0. 1% 50%的乙 醇和水洗脫1 20BV，流速1 20BV/h ；再用體積比為50% 100%的乙醇和水洗脫1 30BV，流速1 30BV/h，收集體積比為50% 100%的乙醇和水洗脫部分，回收乙醇，得到總 提物純化部分；
C 取步驟B中總提物純化部分，拌入1 10倍重量份100 200目矽膠，將溶劑揮幹 得到拌樣矽膠；另取10 100倍重量份100 200目矽膠，幹法裝柱，徑高比為1:3 30， 將拌樣矽膠加入柱頂，上加矽膠做保護層，以氯仿-甲醇混合溶劑系統進行梯度洗脫，收集 體積比為99:1 50:50的氯仿和甲醇洗脫液部分，薄層檢識。薄層色譜條件為正向矽膠 G預製板；展開劑為99:1 80:20的氯仿-甲醇。合併並回收洗脫溶劑，得到濃縮物；
D 取步驟C中濃縮物，拌入1 10倍重量份100 200目矽膠，將溶劑揮幹得到拌樣 矽膠；另取10 100倍重量份100 200目矽膠，幹法裝柱，徑高比為1:3 30，將拌樣矽 膠加入柱頂，上加矽膠做保護層，以石油醚-乙酸乙酯混合溶劑系統進行梯度洗脫，收集體 積比為99:1 50:50的石油醚和乙酸乙酯洗脫液部分，薄層檢識。薄層色譜條件為正向 矽膠G預製板；展開劑為99:1 80:20的氯仿-甲醇。合併並回收洗脫溶劑，得到濃縮物； E 取步驟D中濃縮物，溶解於體積比為99:1 1:99的氯仿和甲醇混合溶劑中，上 Sephadex LH-20凝膠色譜柱進行純化，溶解後濃縮物上樣體積為凝膠柱保留體積的5% 20%，採用體積比為99:1 1:99的氯仿和甲醇混合溶劑進行等度洗脫，收集不同流份，薄層 檢識。薄層色譜條件為正向矽膠G預製板；展開劑為99:1 80:20的氯仿-甲醇。合併 含有金色醯胺醇酯的流份，回收氯仿和甲醇，得到金色醯胺醇酯純品。
所述步驟A為將新鮮採摘的毛茛科圓錐鐵線蓮藥材全草或莖葉於室溫下陰乾，切 段，加入5 30倍體積份濃度為10% 100%的乙醇，採用冷浸、滲漉、煎煮、超聲、加熱回流 或微波進行提取，提取時間為0. 5 3小時，過濾，藥渣用上述方法再提取2 6次，合併提 取液，回收乙醇，得到總提物浸膏；
所述步驟B為取步驟A中總提物浸膏用3 10倍體積份的水稀釋，上裝有非極性、 弱極性或中極性中的任意一種大孔樹脂分離柱進行純化，大孔樹脂用量為藥材量的2 20 倍重量份，分離柱的徑高比為1 :5 10，吸附流速為1 5BV/h ；先用體積比為0. 5% 50% 的乙醇和水洗脫2 10BV，流速2 10BV/h ；再用體積比為60% 100%的乙醇和水洗脫 2 15BV，流速2 15BV/h，收集體積比為60% 100%的乙醇和水洗脫部分，回收乙醇，得 到總提物純化部分；
所述步驟C為取步驟B中總提物純化部分，拌入2 4倍重量份100 200目矽 膠，將溶劑揮幹得到拌樣矽膠；另取30 70倍重量份100 200目矽膠，幹法裝柱，徑高比 為1:5 20，將拌樣矽膠加入柱頂，上加矽膠做保護層，以氯仿-甲醇混合溶劑系統進行梯 度洗脫，收集體積比為99:1 80:20的氯仿和甲醇洗脫液部分，薄層檢識。薄層色譜條件 為正向矽膠G預製板；展開劑為99:1 90:10的氯仿-甲醇。合併並回收洗脫溶劑，得到 濃縮物；
所述步驟D為取步驟C中濃縮物，拌入2 4倍重量份100 200目矽膠，將溶劑揮幹得到拌樣矽膠；另取30 70倍重量份100 200目矽膠，幹法裝柱，徑高比為1 5 20，將 拌樣矽膠加入柱頂，上加矽膠做保護層，以石油醚-乙酸乙酯混合溶劑系統進行梯度洗脫， 收集體積比為99:1 60:40的石油醚和乙酸乙酯洗脫液部分，薄層檢識。薄層色譜條件為 正向矽膠G預製板；展開劑為99:1 90:10的氯仿-甲醇。合併並回收洗脫溶劑，得到濃 縮物；
所述步驟E為取步驟D中濃縮物，溶解於體積比為80:20 20:80的氯仿和甲醇混合 溶劑中，上kphadex LH-20凝膠色譜柱進行純化，溶解後濃縮物上樣體積為凝膠柱保留體 積的8% 10%，採用體積比為80:20 20:80的氯仿和甲醇混合溶劑進行等度洗脫，收集 不同流份，薄層檢識。薄層色譜條件為正向矽膠G預製板；展開劑為99:1 90:10的氯 仿-甲醇。合併含有金色醯胺醇酯的流份，回收氯仿和甲醇，得到金色醯胺醇酯純品。本發明可以從圓錐鐵線蓮中分離得到一種醯胺類化合物金色醯胺醇酯，初步體外 藥理研究發現此化合物具有一定的抗腫瘤活性，另有研究報導此活性成分具有抗炎鎮痛作 用。該方法能夠有效地分離得到金色醯胺醇酯單體，為進一步藥理研究提供了基礎。
圖1是正常的神經膠質瘤細胞電鏡圖； 圖2是藥物作用後神經膠質瘤細胞電鏡圖3 a是藥物作用後觀察到的早期自噬泡示意圖； 圖3 b是藥物作用後觀察到的早期雙層膜結構的自噬體示意圖； 圖3 c是藥物作用後觀察到的正在與溶酶體發生融合的自噬體示意圖； 圖3 d是藥物作用後觀察到的大量的糖原結構示意圖。
具體實施例方式實施例1 金色醯胺醇酯的分離純化
A 取圓錐鐵線蓮乾燥後切段的全草或莖葉lOOOg，加入2000mL濃度為1%的乙醇，加熱 回流提取0. 1小時，過濾，藥渣用上述方法再提取2次，合併提取液，回收乙醇，得到總提物 浸膏50g ；
B 取步驟A中總提物浸膏50g，用50mL水稀釋，上裝有AB-8大孔樹脂的分離柱進行純 化，大孔樹脂用量為2000g，分離柱的徑高比為1 :3，吸附流速為lBV/h ；先用體積比為0. 1% 的乙醇和水洗脫1BV，流速lBV/h ；再用體積比為50%的乙醇和水洗脫1BV，流速lBV/h，收集 體積比為50%的乙醇和水洗脫部分，回收乙醇，得到總提物純化部分IOg ；
C 取步驟B中總提物純化部分10g，拌入IOg 100 200目矽膠G，將溶劑揮幹得到拌樣 矽膠；另取IOOg 100 200目矽膠G，幹法裝柱，徑高比為1:3，將拌樣矽膠加入柱頂，上加 矽膠做保護層，以氯仿-甲醇混合溶劑系統進行梯度洗脫，收集體積比為99:1的氯仿和甲 醇洗脫液部分，薄層檢識。薄層色譜條件為正向矽膠G預製板；展開劑為99:1的氯仿-甲 醇。合併並回收洗脫溶劑，得到濃縮物0. Sg;
D 取步驟C中濃縮物0. Sg,拌入0. Sg 100 200目矽膠G，將溶劑揮幹得到拌樣矽膠； 另取8g 100 200目矽膠G，幹法裝柱，徑高比為1:3，將拌樣矽膠加入柱頂，上加矽膠做保 護層，以石油醚-乙酸乙酯混合溶劑系統進行梯度洗脫，收集體積比為99:1的石油醚和乙
6酸乙酯洗脫液部分，薄層檢識。薄層色譜條件為正向矽膠G預製板；展開劑為99:1的氯 仿-甲醇。合併並回收洗脫溶劑，得到濃縮物0. 04g ；
E 取步驟D中濃縮物0. 04g,溶解於體積比為99:1的氯仿和甲醇混合溶劑中，上 Sephadex LH-20凝膠色譜柱進行純化，溶解後濃縮物上樣體積為凝膠柱保留體積的5%，採 用體積比為99:1氯仿和甲醇混合溶劑進行等度洗脫，收集不同流份，薄層檢識。薄層色譜 條件為正向矽膠G預製板；展開劑為99:1的氯仿-甲醇。合併含有金色醯胺醇酯的流份， 回收氯仿和甲醇，得到0. Olg的金色醯胺醇酯純品。
實施例2 金色醯胺醇酯的分離純化
A 取圓錐鐵線蓮乾燥後切段的全草或莖葉lOOOg，加入50000mL濃度為100%的乙醇， 加熱回流提取5小時，過濾，藥渣用上述方法再提取10次，合併提取液，回收乙醇，得到總提 物浸膏500g ；
B 取步驟A中總提物浸膏500g，用IOOOOmL水稀釋，上裝有DlOl大孔樹脂的分離柱進 行純化，大孔樹脂用量為40000g，分離柱的徑高比為1 :30，吸附流速為10BV/h ；先用體積比 為50%的乙醇和水洗脫20BV，流速20BV/h ；再用體積比為100%的乙醇和水洗脫30BV，流速 30BV/h，收集體積比為100%的乙醇和水洗脫部分，回收乙醇，得到總提物純化部分IOOg ；
C 取步驟B中總提物純化部分100g，拌入IOOOg 100 200目矽膠G，將溶劑揮幹得到 拌樣矽膠；另取IOOOOg 100 200目矽膠G，幹法裝柱，徑高比為1:30，將拌樣矽膠加入柱 頂，上加矽膠做保護層，以氯仿-甲醇混合溶劑系統進行梯度洗脫，收集體積比為50:50的 氯仿和甲醇洗脫液部分，薄層檢識。薄層色譜條件為正向矽膠G預製板；展開劑為80:20 的氯仿-甲醇。合併並回收洗脫溶劑，得到濃縮物8g ；
D 取步驟C中濃縮物8g，拌入80g 100 200目矽膠G，將溶劑揮幹得到拌樣矽膠；另 取800g 100 200目矽膠G，幹法裝柱，徑高比為1:30，將拌樣矽膠加入柱頂，上加矽膠做 保護層，以石油醚-乙酸乙酯混合溶劑系統進行梯度洗脫，收集體積比為50:50的石油醚和 乙酸乙酯洗脫液部分，薄層檢識。薄層色譜條件為正向矽膠G預製板；展開劑為80:20的 氯仿-甲醇。合併並回收洗脫溶劑，得到濃縮物0. 4g ；
E 取步驟D中濃縮物0. 4g，溶解於體積比為1:99的氯仿和甲醇混合溶劑中，上 Sephadex LH-20凝膠色譜柱進行純化，溶解後濃縮物上樣體積為凝膠柱保留體積的20%，採 用體積比為1:99氯仿和甲醇混合溶劑進行等度洗脫，收集不同流份，薄層檢識。薄層色譜 條件為正向矽膠G預製板；展開劑為80:20的氯仿-甲醇。合併含有金色醯胺醇酯的流 份，回收氯仿和甲醇，得到0. Ig的金色醯胺醇酯純品。實施例3 金色醯胺醇酯的分離純化
A 取圓錐鐵線蓮乾燥後切段的全草或莖葉lOOOg，加入IOOOOmL濃度為50%的乙醇，加 熱回流提取2小時，過濾，藥渣用上述方法再提取5次，合併提取液，回收乙醇，得到總提物 浸膏300g ；
B 取步驟A中總提物浸膏300g，用3000mL水稀釋，上裝有DM130大孔樹脂的分離柱進 行純化，大孔樹脂用量為20000g，分離柱的徑高比為1 :10，吸附流速為5BV/h ；先用體積比 為20%的乙醇和水洗脫10BV，流速10BV/h ；再用體積比為60%的乙醇和水洗脫10BV，流速 10BV/h,收集體積比為60%的乙醇和水洗脫部分，回收乙醇，得到總提物純化部分50g ；C:取步驟B中總提物純化部分50g，拌入250g 100 200目矽膠G，將溶劑揮幹得到拌 樣矽膠；另取2500g 100 200目矽膠G，幹法裝柱，徑高比為1:10，將拌樣矽膠加入柱頂， 上加矽膠做保護層，以氯仿-甲醇混合溶劑系統進行梯度洗脫，收集體積比為80:20的氯仿 和甲醇洗脫液部分，薄層檢識。薄層色譜條件為正向矽膠G預製板；展開劑為90:10的氯 仿-甲醇。合併並回收洗脫溶劑，得到濃縮物4g ；
D:取步驟C中濃縮物4g，拌入20g 100 200目矽膠G，將溶劑揮幹得到拌樣矽膠；另 取200g 100 200目矽膠G，幹法裝柱，徑高比為1:10，將拌樣矽膠加入柱頂，上加矽膠做 保護層，以石油醚-乙酸乙酯混合溶劑系統進行梯度洗脫，收集體積比為80:20的石油醚和 乙酸乙酯洗脫液部分，薄層檢識。薄層色譜條件為正向矽膠G預製板；展開劑為90:10的 氯仿-甲醇。合併並回收洗脫溶劑，得到濃縮物0. Ig ；
E 取步驟D中濃縮物0. lg，溶解於體積比為80:20的氯仿和甲醇混合溶劑中，上 Sephadex LH-20凝膠色譜柱進行純化，溶解後濃縮物上樣體積為凝膠柱保留體積的10%，採 用體積比為80:20氯仿和甲醇混合溶劑進行等度洗脫，收集不同流份，薄層檢識。薄層色譜 條件為正向矽膠G預製板；展開劑為90:10的氯仿-甲醇。合併含有金色醯胺醇酯的流 份，回收氯仿和甲醇，得到0. 05g的金色醯胺醇酯純品。
實施例4 金色醯胺醇酯的分離純化
A 取圓錐鐵線蓮乾燥後切段的全草或莖葉lOOOg，加入30000mL濃度為70%的乙醇，加 熱回流提取4小時，過濾，藥渣用上述方法再提取7次，合併提取液，回收乙醇，得到總提物 浸膏400g ；
B 取步驟A中總提物浸膏400g，用6000mL水稀釋，上裝有ADS-7大孔樹脂的分離柱進 行純化，大孔樹脂用量為30000g，分離柱的徑高比為1 :20，吸附流速為7BV/h ；先用體積比 為40%的乙醇和水洗脫15BV，流速15BV/h ；再用體積比為70%的乙醇和水洗脫20BV，流速 20BV/h,收集體積比為70%的乙醇和水洗脫部分，回收乙醇，得到總提物純化部分60g ；
C:取步驟B中總提物純化部分60g，拌入420g 100 200目矽膠G，將溶劑揮幹得到拌 樣矽膠；另取4200g 100 200目矽膠G，幹法裝柱，徑高比為1:20，將拌樣矽膠加入柱頂， 上加矽膠做保護層，以氯仿-甲醇混合溶劑系統進行梯度洗脫，收集體積比為90:10的氯仿 和甲醇洗脫液部分，薄層檢識。薄層色譜條件為正向矽膠G預製板；展開劑為95:5的氯 仿-甲醇。合併並回收洗脫溶劑，得到濃縮物5g ；
D:取步驟C中濃縮物5g，拌入35g 100 200目矽膠G，將溶劑揮幹得到拌樣矽膠；另 取350g 100 200目矽膠G，幹法裝柱，徑高比為1:20，將拌樣矽膠加入柱頂，上加矽膠做 保護層，以石油醚-乙酸乙酯混合溶劑系統進行梯度洗脫，收集體積比為90:10的石油醚和 乙酸乙酯洗脫液部分，薄層檢識。薄層色譜條件為正向矽膠G預製板；展開劑為95:5的氯 仿-甲醇。合併並回收洗脫溶劑，得到濃縮物0. 08g ；
E 取步驟D中濃縮物0. 08g，溶解於體積比為70:30的氯仿和甲醇混合溶劑中，上 Sephadex LH-20凝膠色譜柱進行純化，溶解後濃縮物上樣體積為凝膠柱保留體積的15%，採 用體積比為70:30氯仿和甲醇混合溶劑進行等度洗脫，收集不同流份，薄層檢識。薄層色譜 條件為正向矽膠G預製板；展開劑為95:5的氯仿-甲醇。合併含有金色醯胺醇酯的流份， 回收氯仿和甲醇，得到0. 02g的金色醯胺醇酯純品。
下面實驗例用於進一步說明但不限於本發明。
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實驗例1 金色醯胺醇酯的純度檢查
採用高效液相色譜的方法檢查純度。儀器=WaterW695高效液相色譜儀-DAD紫外檢測 器(USA)。色譜柱RP-18色譜柱，250mmX4. 6 mm(USA)。流動相乙腈_0. 1%磷酸水(梯度 洗脫)。流速1.0mL/min。柱溫室溫。檢測波長211nm。進樣量10yL。保留時間(RT): 金色醯胺醇酯為50-70min。色譜圖記錄時間8& η。面積歸一化法測純度，得到金色醯胺 醇酯的純度為98. 8%。實驗例2 金色醯胺醇酯的結構鑑定
熔點儀為Χ-4數字顯示顯微熔點測定儀(北京泰克儀器有限公司)；紫外(UV)光譜採 用Win-Sp 5. 0型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)測定；紅外(IR)光譜採用 Shimadzu IR-408型紅外光譜儀測定；核磁共振氫譜和碳譜(1H NMR和13C NMR)採用DRX400 核磁共振譜儀測定；質譜(MS)採用FTICR型質譜儀(USA)測定。上述分離純化方法所得到的金色醯胺醇酯純品為白色絮狀結晶或粉末，熔點 180-185°C。UVXmax (nm) :213，240。IRvmax (cnT1) :3410，1735，1670，1665。MS (m/z) 467 (M+Na),445 (M+l)。1H 匪R ( δ ) 2. 01 (3Η, s, CH3), 2. 81 (2H, m, CH2), 2. 98 (2H，m， CH2), 3. 85 (1H, dd, CH2), 4. 00 (1H, dd, CH2), 4. 16 (1H, qua, CH), 4. 69 (1H, sex, CH), 7. 12 (2扎苯環!0，7. 23-7. 28 (6H，苯環 H)，7. 31 (2扎苯環!0，7. 44 (2H，苯環 H)，7. 51 (1H，苯環 H), 7. 79 (2H，苯環 H)，8. 12 (1H，d，NH)，8. 47 (lH，d，NH)。13C NMR (δ ):20. 6 (CH3), 36. 5 (CH2), 37. 1 (CH2), 49. 1 (CH)，54.8 (CH)，64.6 (CH2), 126. 2 (2CH，苯環 C)，127. 4 (2CH，苯 環 C)，128. 0 (2CH，苯環 C)，128. 1 (2CH，苯環 C)，128. 2 (2CH，苯環 C)，129. 1 (4CH，苯環 C)， 131.2 (CH，苯環 C)，134. 0 (C，苯環 C)，138. 0 (C，苯環 C)，138. 3 (C，苯環 C)，166. 0 (CO), 170. 2 (CO), 171. 1 (CO)。以上波譜數據與文獻報導一致，金色醯胺醇酯分子結構如下
權利要求
1.一種從藥用植物圓錐鐵線蓮中分離純化生物活性成分金色醯胺醇酯的方法，其特徵 在於它的步驟如下A 將新鮮採摘的毛茛科圓錐鐵線蓮藥材全草或莖葉於室溫下陰乾，切段，加入2 50 倍體積份濃度為1% 100%的乙醇，採用冷浸、滲漉、煎煮、超聲、加熱回流或微波進行提取， 提取時間為0. 1 5小時，過濾，藥渣用上述方法再提取2 10次，合併提取液，回收乙醇， 得到總提物浸膏；B 取步驟A中總提物浸膏用1 20倍體積份的水稀釋，上裝有非極性、弱極性或中極 性中的任意一種大孔樹脂分離柱進行純化，大孔樹脂用量為藥材量的2 40倍重量份，分 離柱的徑高比為1 :3 30，吸附流速為1 10BV/h ；先用體積比為0. 1% 50%的乙醇和水 洗脫1 20BV，流速1 20BV/h ；再用體積比為50% 100%的乙醇和水洗脫1 30BV，流 速1 30BV/h，收集體積比為50% 100%的乙醇和水洗脫部分，回收乙醇，得到總提物純化 部分；C 取步驟B中總提物純化部分，拌入1 10倍重量份100 200目矽膠，將溶劑揮幹 得到拌樣矽膠；另取10 100倍重量份100 200目矽膠，幹法裝柱，徑高比為1:3 30， 將拌樣矽膠加入柱頂，上加矽膠做保護層，以氯仿-甲醇混合溶劑系統進行梯度洗脫，收集 體積比為99:1 50:50的氯仿和甲醇洗脫液部分，薄層檢識，薄層色譜條件為正向矽膠G預製板；展開劑為99:1 80:20的氯仿-甲醇，合併並回收洗脫溶劑，得到濃縮物；D 取步驟C中濃縮物，拌入1 10倍重量份100 200目矽膠，將溶劑揮幹得到拌樣 矽膠；另取10 100倍重量份100 200目矽膠，幹法裝柱，徑高比為1:3 30，將拌樣矽 膠加入柱頂，上加矽膠做保護層，以石油醚-乙酸乙酯混合溶劑系統進行梯度洗脫，收集體 積比為99:1 50:50的石油醚和乙酸乙酯洗脫液部分，薄層檢識，薄層色譜條件為正向矽膠G預製板；展開劑為99:1 80:20的氯仿-甲醇，合併並回收洗脫溶劑，得到濃縮物；E 取步驟D中濃縮物，溶解於體積比為99:1 1:99的氯仿和甲醇混合溶劑中，上 Sephadex LH-20凝膠色譜柱進行純化，溶解後濃縮物上樣體積為凝膠柱保留體積的5% 20%,採用體積比為99 1 1 99的氯仿和甲醇混合溶劑進行等度洗脫，收集不同流份，薄層 檢識，薄層色譜條件為正向矽膠G預製板；展開劑為99:1 80:20的氯仿-甲醇，合併含有金色醯胺醇酯的流份，回收氯仿和甲醇，得到金色醯胺醇酯純品。
2.根據權利要求1所述的一種從藥用植物圓錐鐵線蓮中分離純化生物活性成分金色 醯胺醇酯的方法，其特徵是所述步驟A為將新鮮採摘的毛茛科圓錐鐵線蓮藥材全草或莖 葉於室溫下陰乾，切段，加入5 30倍體積份濃度為10% 100%的乙醇，採用冷浸、滲漉、 煎煮、超聲、加熱回流或微波進行提取，提取時間為0. 5 3小時，過濾，藥渣用上述方法再 提取2 6次，合併提取液，回收乙醇，得到總提物浸膏。
3.根據權利要求1所述的一種從藥用植物圓錐鐵線蓮中分離純化生物活性成分金 色醯胺醇酯的方法，其特徵是所述步驟B為取步驟A中總提物浸膏用3 10倍體積份的 水稀釋，上裝有非極性、弱極性或中極性中的任意一種大孔樹脂分離柱進行純化，大孔樹脂 用量為藥材量的2 20倍重量份，分離柱的徑高比為1 :5 10，吸附流速為1 5BV/h ；先用體積比為0. 5% 50%的乙醇和水洗脫2 10BV，流速2 10BV/h ；再用體積比為60% 100%的乙醇和水洗脫2 15BV，流速2 15BV/h，收集體積比為60% 100%的乙醇和水洗 脫部分，回收乙醇，得到總提物純化部分。
4.根據權利要求1所述的一種從藥用植物圓錐鐵線蓮中分離純化生物活性成分金 色醯胺醇酯的方法，其特徵是所述步驟C為取步驟B中總提物純化部分，拌入2 4倍重 量份100 200目矽膠，將溶劑揮幹得到拌樣矽膠；另取30 70倍重量份100 200目矽 膠，幹法裝柱，徑高比為1:5 20，將拌樣矽膠加入柱頂，上加矽膠做保護層，以氯仿-甲醇 混合溶劑系統進行梯度洗脫，收集體積比為99 1 80 20的氯仿和甲醇洗脫液部分，薄層 檢識，薄層色譜條件為正向矽膠G預製板；展開劑為99:1 90:10的氯仿-甲醇，合併並 回收洗脫溶劑，得到濃縮物。
5.根據權利要求1所述的一種從藥用植物圓錐鐵線蓮中分離純化生物活性成分金色 醯胺醇酯的方法，其特徵是所述步驟D為取步驟C中濃縮物，拌入2 4倍重量份100 200目矽膠，將溶劑揮幹得到拌樣矽膠；另取30 70倍重量份100 200目矽膠，幹法裝 柱，徑高比為1 5 20，將拌樣矽膠加入柱頂，上加矽膠做保護層，以石油醚-乙酸乙酯混合 溶劑系統進行梯度洗脫，收集體積比為99:1 60:40的石油醚和乙酸乙酯洗脫液部分，薄 層檢識，薄層色譜條件為正向矽膠G預製板；展開劑為99 1 90 10的氯仿-甲醇，合併並回 收洗脫溶劑，得到濃縮物。
6.根據權利要求1所述的一種從藥用植物圓錐鐵線蓮中分離純化生物活性成分金色 醯胺醇酯的方法，其特徵是所述步驟E為取步驟D中濃縮物，溶解於體積比為80:20 20:80的氯仿和甲醇混合溶劑中，上kphadex LH-20凝膠色譜柱進行純化，溶解後濃縮物 上樣體積為凝膠柱保留體積的8% 10%，採用體積比為80:20 20:80的氯仿和甲醇混合 溶劑進行等度洗脫，收集不同流份，薄層檢識，薄層色譜條件為正向矽膠G預製板；展開劑 為99:1 90:10的氯仿-甲醇，合併含有金色醯胺醇酯的流份，回收氯仿和甲醇，得到金色 醯胺醇酯純品。
全文摘要
本發明公開了一種從藥用植物圓錐鐵線蓮中分離純化生物活性成分金色醯胺醇酯的方法，通過不同的中藥提取方法得到圓錐鐵線蓮總提物，然後經過大孔樹脂進行初步純化，再經過兩次矽膠柱色譜進行進一步分離得到金色醯胺醇酯粗品，金色醯胺醇酯粗品採用凝膠柱色譜純化得到金色醯胺醇酯純品。圓錐鐵線蓮具有多種生理活性，如抗腫瘤、治療前列腺炎。本發明可以從圓錐鐵線蓮中分離得到一種醯胺類化合物金色醯胺醇酯，初步體外藥理研究發現此化合物具有一定的抗腫瘤活性，另有研究報導此活性成分具有抗炎鎮痛作用，該方法能夠有效地分離得到金色醯胺醇酯單體，為進一步藥理研究提供了基礎。
文檔編號C07C231/24GK102070485SQ201010606380
公開日2011年5月25日 申請日期2010年12月27日 優先權日2010年12月27日
發明者傅之容, 崔磊, 應弘梅, 龐亞京, 張琳, 戚中傑, 田景奎, 翟興英, 陳潤澤 申請人:浙江大學