一種免疫膠體金試紙條及製備方法及應用的製作方法

2023-06-11 04:40:56 1

一種免疫膠體金試紙條及製備方法及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種免疫膠體金試紙及製備方法和應用，包括硬質聚氯乙烯背襯板、硝酸纖維膜、樣品墊、膠體金結合墊吸水墊，硝酸纖維膜粘貼於在硬質聚氯乙烯背襯板上，在硝酸纖維膜的一端粘貼有膠體金結合墊，在膠體金結合墊上粘貼有樣品墊，吸水墊置於硝酸纖維膜的另一端上；步驟：（1）用檸檬酸三鈉與氯金酸反應製備膠體金；（2）將抗犬腺病毒Ⅱ型單克隆抗體標記在膠體金顆粒上；（3）將兔抗犬腺病毒Ⅱ型抗體包被在硝酸纖維膜上；（4）按順序粘合一起得到膠體金試紙條。一種免疫膠體金試紙條在檢測犬腺病毒Ⅱ型中的應用，該試紙操作簡單、檢測快速、靈敏、結果清晰易於判斷。便於攜帶和使用，節約了疾病檢測成本。
【專利說明】一種免疫膠體金試紙條及製備方法及應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種犬疫病的檢測【技術領域】，具體涉及一種免疫膠體金試紙條，同時還涉及一種免疫膠體金試紙條的製備方法，還涉及一種免疫膠體金試紙條在檢測犬腺病毒II型中的用途。

【背景技術】
[0002]犬腺病毒II型(CAV-1I )能導致犬的呼吸道隱性或者輕微感染，可能會引起犬的傳染性喉氣管炎及肺炎症狀。臨床特徵表現持續性高熱、咳嗽、漿液性至粘液性鼻漏、扁桃體炎、喉氣管炎和肺炎等呼吸道症狀。常發生於半年以下的幼犬。在沒斷奶或剛斷奶的幼犬可以造成全窩或全群咳嗽。CAV-1I可以通過口、鼻感染，病毒在無纖毛的細支氣管上皮細胞，鼻黏膜、咽和扁桃體隱窩的表面細胞、支氣管的黏膜及肺泡2型上皮細胞中進行複製，還能在咽後淋巴結和支氣管淋巴結複製。感染在我國比較普遍。目前CAV-1I的診斷方法有病毒分離、實驗動物感染、包涵體檢查、電鏡觀察、CAV-1I的中和試驗、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、酶標SPA染色法、免疫螢光試驗、鏈式聚合酶反應等方法。但是這些方法各有缺點，病毒分離鑑定及中和試驗過程繁瑣，耗時過長；電鏡技術難以在基礎普應用；分子生物學方法對對技術和設備要求高，這些檢測方法難以在獸醫臨床現場應用。
[0003]免疫膠體金技術自問世以來得到了迅速的發展，在動物疫病檢測領域應用廣泛，特別是膠體金免疫技術具有操作簡單、檢測快速靈敏、結果清晰易於判斷、無需儀器設備等優點，適合臨床的快速診斷和基層流行病學調查大規模應用。將免疫膠體金技術應用於體外檢測犬腺病毒II型在國內還應用較少，本檢測卡敏感性高，特異性好。


【發明內容】

[0004]本發明的目的是在於提供了一種免疫膠體金試紙條，該試紙操作簡單、檢測快速、靈敏、結果清晰易於判斷。
[0005]本發明的另一個目的是在於提供了一種免疫膠體金試紙條的製備方法，試紙條製備過程簡單，原輔料廉價易得，膠體金試紙條操作簡單。
[0006]本發明的再一個目的是在於提供了一種免疫膠體金試紙條在檢測犬腺病毒II型中的應用，臨床使用中不需要任何設備，便於攜帶和使用，檢測快速敏感性高，大大節約了疾病檢測成本。
[0007]為了實現上述的目的，本發明採用以下技術措施:
一種能檢測犬腺病毒II型的免疫膠體金試紙條，所述的試紙條包括有硬質聚氯乙烯背襯板、硝酸纖維膜、膠體金結合墊、樣品墊、吸水墊。其特徵在於:硝酸纖維膜粘貼在硬質聚氯乙烯背襯板上面，在硝酸纖維膜的一端粘貼有膠體金結合墊，在膠體金結合墊上粘貼有樣品墊，吸水墊置於硝酸纖維膜的另一端上面。
[0008]所述的樣品墊具體為緩衝液A處理過的吸水紙。緩衝液A配方為:0.05 mo I/L的Tris-Cl, pH 9.0。
[0009]所述的吸水墊具體為裁切過的吸水紙。
[0010]所述的硝酸纖維膜為試紙條的檢測膜，上面靠左側的是檢測線，質控線位於右側，兩條線的間隔距離是4?6mm。
[0011]所述的膠體金結合墊噴塗有抗犬腺病毒II型單克隆抗體-膠體金標記物。
[0012]所述的硝酸纖維膜上分別噴塗有兔犬腺病毒II型多克隆抗體檢測線和兔抗鼠抗體的質控線。
[0013]一種能檢測犬腺病毒II型的免疫膠體金試紙條的製備方法，其步驟是:
(I)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應製備膠體金:已矽化的瓶子中入100 mL注射用水，再加入1.2 mL I % (w/v)氯金酸，放在電爐上加熱(電爐功率調至1500W，200?300°C)至完全沸騰；迅速一次加入1.8 mL的1.05% (w/v)檸檬酸三鈉水溶液，繼續加熱(電爐功率調至1500ff,200?300°C)至溶液變成穩定的酒紅色，室溫(20?25°C)下自然冷卻至室溫(20?25°C)，即為膠體金溶液。
[0014](2)膠體金的標記:將上述步驟(I)所得的膠體金用0.1 mol/L碳酸鉀調節pH值到7.8?8.2 ;加入抗犬腺病毒II型單克隆抗體(購於Santa公司),緩慢攪拌38?42 min得到抗犬腺病毒II型單克隆抗體-膠體金標記物；在攪動下，加入10% BSA (w/v)溶液封閉38?42 min ;將標記好的膠體金溶液8800 rpm離心28?32 min後重懸噴塗在膠體金結合墊上。
[0015](3)將兔抗犬腺病毒II型多克隆抗體(購於Santa公司)和兔抗鼠IgG抗體(購於武漢博士得生物工程有限公司)稀釋後分別噴塗在硝酸纖維膜上構成檢測線和質控線。
[0016](4)將硝酸纖維膜、膠體金結合墊、樣品墊、吸水墊按順序粘合在硬質聚氯乙烯背襯板上在一起組成得到檢測犬腺病毒II型的免疫膠體金試紙條。
[0017]一種免疫膠體金試紙條在檢測犬腺病毒II型中的應用，其步驟是:
(I)將預處理過的樣品(如犬鼻黏膜拭子、糞便或病死犬的臟器樣品)，取上清液約2?4滴(70?140 μ L)在本發明試紙上，15 min後觀察結果。
[0018](2)結果判定:在質控線、檢測線上均出現紅色時，為犬腺病毒II型陽性，即樣本中含有犬腺病毒II型，檢測線不出現紅色為犬腺病毒II型陰性，即樣本中不含有犬腺病毒II型。若質控線未出現紅色線，則試紙無效。
[0019]本發明利用膠體金標記顯色的免疫反應製備的免疫膠體金試紙條能較靈敏的檢測出犬腺病毒II型，結構合理，應用兔抗犬腺病毒II型抗體作檢測線，建立免疫層析法檢測樣本中是否含有犬腺病毒II型。
[0020]與現有技術相比，本發明具有以下突出優點:
(I)適用於犬腺病毒II型的快速檢測，本試紙條檢測結果特異性強，靈敏度高。本檢測方法與臨床酶聯免疫吸附試驗檢測比較，120份被檢測犬腺病毒II型感染疑似病例犬的糞便、病死臟器的樣本中，用酶聯免疫吸附試驗檢測陽性為79份，陰性41份，用本發明的試紙條檢測陽性為74份，陰性為46份，結果顯示:犬腺病毒II型用本發明試紙條檢測陽性率為61.7%，酶聯免疫吸附試驗的檢測陽性率65.8%，本發明試紙條與酶聯免疫吸附試驗的符合率為95.8%ο
[0021 ] ( 2 )本發明的試紙條不需要任何儀器設備，攜帶方便，檢測成本低。
[0022](3)本發明的試紙條操作簡單易於掌握，無需專業人員操作。
[0023](4)本發明的試紙條保存方便，穩定性好。常溫保存12個月試紙條與4°C保存的檢測結果一致。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為一種檢測犬腺病毒II型的免疫膠體金試紙條的結構示意圖。
[0025]其中:硬質聚氯乙烯背襯板1、硝酸纖維膜2、膠體金結合墊4、樣品墊3、吸水墊5、檢測線6，質控線7。

【具體實施方式】
[0026]實施例1:
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。
[0027]一種檢測犬腺病毒II型的免疫膠體金試紙條，它由硬質聚氯乙烯背襯板1、硝酸纖維膜2、膠體金結合墊4、樣品墊3、吸水墊5、檢測線6，質控線7組成，其特徵在於:硝酸纖維膜2粘貼在硬質聚氯乙烯背襯板I上面，在硝酸纖維膜2上面靠左側由下而上依次粘貼有膠體金結合墊4、樣品墊3，吸水墊5，設置在硝酸纖維膜2上面靠右側的位置。所述的膠體金結合墊4由玻璃纖維製成，該膠體金結合墊4先用緩衝液浸泡30分鐘，37°C烘乾後，噴塗上膠體金標記的抗犬腺病毒II型單克隆抗體。硝酸纖維膜2為試紙條的檢測膜，上面靠左側的是檢測線6，質控線7位於右側，兩條線的間隔距離是4或5或6_，檢測線6和質控線7分別噴塗的是兔抗犬腺病毒II型多克隆抗體和兔抗鼠抗體。當被檢測樣本中含有犬腺病毒II型時，病毒可分別先與金標抗犬腺病毒II型單克隆抗體結合，然後在層析作用下與相應檢測線上的抗體結合而聚集後形成肉眼可見的色帶，進而根據顯色結果進行判定。
[0028]實施例2:
一種檢測犬腺病毒II型的免疫膠體金試紙條的製備方法，其步驟是:
(I)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應製備膠體金:已矽化的瓶子中入100 mL注射用水，再加入1.2 mL I % (w/v)氯金酸，放在電爐上加熱(電爐功率調至1500W，200?300°C)至完全沸騰；迅速一次加入1.8 mL的1.05% (w/v)檸檬酸三鈉水溶液，繼續加熱(電爐功率調至1500ff,200?300°C)至溶液變成酒紅色，室溫(20?25°C)下自然冷卻室溫(20?25°C，)，即為膠體金溶液。製備的膠體金外觀呈清亮透明的酒紅色，通過分光光度計掃描在450?600 nm處光譜，最大吸收波長為520 nm，通過電鏡觀察顆粒大小均勻。
[0029](2)犬腺病毒II型單克隆抗體膠體金標記製備:
(a)確定最佳標記量和最佳標記pH值:將上述步驟(I)所得的膠體金用0.1 mol/L碳酸鉀調節pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 ;取各pH的膠體金溶液I mL於一系列PE管中混勻，在以上各pH條件下用膠體金標記抗犬腺病毒II型單克隆抗體(購於Santa公司，濃度調整為1.0 mg/mL),蛋白標記量分別為I μ g、2 μ g、5 μ g、8 μ g>10 μ g>15μ g、20 μ g，混勻後靜置30 min ;離心去除沉澱後測各個試管的OD52tol,以OD52tlnm值最大時的pH (8.0)為最佳pH值。當膠體金標記的最佳pH值為8.0，膠體金中單克隆抗體添加量為8 μ g時，對應的吸收峰最大，在此基礎上再加20%，即每I mL膠體金溶液的最適當單克隆抗體的標記量為9.6 μ go
[0030](b)犬腺病毒II型單克隆抗體膠體金標記:於廣口瓶中加入100 mL的膠體金，0.1mol/L碳酸鉀調節pH為8.0後，邊磁力攪拌邊滴加犬腺病毒II型單克隆抗體(購於Santa公司),攪拌38或39或40或41或42min ;加入10 % (w/v)牛血清白蛋白(BSA)至終濃度為I %,繼續攪拌38或39或40或41或42min ;分裝於50 mL離心管中，8800 r/min離心28或29或30或31或32min，棄去上清，加入重懸液15 mL。
[0031](3)膠體金結合墊製備:
(a)配製包被液:0.05 mol/L pH 9.0 Tris緩衝液、0.5% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮K40(PVP K40)、l.0% (w/v)蔗糖、0.8% (w/v)吐溫20攪拌均勻後濾紙過濾。
[0032](b)製備膠體金結合墊:將玻璃纖維素膜浸泡在上述包被液中28或29或30或31或32分鐘，37°C烘箱中烘乾；上述步驟(2)製備的膠體金標記的抗犬腺病毒II型單克隆抗體噴塗於處理過膠體金結合墊上，噴量為10 μ L/cm,於37°C烘箱中烘乾2小時，裁切成寬
0.5cm條狀備用。
[0033](4)檢測線和質控線製備:
(a)配製包被液:0.02 mol/L pH 7.2磷酸鹽緩衝液(PBS)、1.0% (w/v)海藻糖、1.0%(w/v)山梨醇、0.3% (w/v)吐溫20、攪拌均勻後0.22 μ m濾膜過濾。
[0034](b)將兔抗犬腺病毒II型多抗(購於Santa公司)用上述包被液稀釋後，噴塗於硝酸纖維膜(Millipore HF135)上作為檢測線，兔抗犬腺病毒II型多抗濃度為1.0 mg/ mL，噴量為0.8 μ L/cm ;噴塗在硝酸纖維膜上質控線上兔抗鼠抗體(購於武漢博士得生物工程有限公司)濃度為1.5 mg/ 1111^噴量為0.8 μ L/cm,檢測線和質控線的距離是5 mm,於37°C烘箱中烘乾2小時備用。
[0035](5)處理樣品墊:將吸水紙浸泡在緩衝液中30 min, 37°C烘箱中烘乾，裁切成寬為1.5 cm條狀備用。上述的緩衝液配方為:0.05 mol/L的Tris-Cl，pH 9.0。
[0036](6)試紙的組裝:將處理好的樣品墊、噴有抗犬腺病毒II型單克隆抗體-膠體金標記物的膠體金結合墊、噴有兔抗犬腺病毒II型抗體的檢測線的硝酸纖維膜、吸水墊按順序依次粘貼在硬質聚氯乙烯上組成試紙條。
[0037]實施例3:
一種免疫膠體金試紙條在檢測犬腺病毒II型中的應用，其步驟是:
(I)樣品的預處理:將收集到的樣品如犬鼻黏膜拭子、糞便或病死犬的臟器樣品，各有陰性樣本作對照。將樣本每份取約0.5 g (mL)左右,加生理鹽水約0.5 mL,製成混懸液(糞便樣本充分混勻後靜置5 min,或者離心)。
[0038](2)檢測:分別取上清液2?4滴(70?140 μ L)滴在本發明試紙上，15 min後觀察結果。
[0039](3)結果判定:在質控線、檢測線上均出現紅色時，為犬腺病毒II型陽性，即樣本中含有犬腺病毒II型，檢測線不出現紅色為犬腺病毒II型陰性，即樣本中不含有犬腺病毒II型。若質控線未出現紅色線，則試紙無效。
[0040]本發明應用效果舉例:
(I)特異性試驗:用生理鹽水對犬腺病毒II型(TCID5tl為10_52/0.1ml)犬細小病毒細胞培養液(TCID5tl 為 10_5_°/0.1ml)、犬腺病毒 I 型(TCID5tl 為 10_5 5/0.Iml)、犬細小病毒(TCID5tl為 ΙΟ-5.9/。.1ml)、犬瘟熱(TCID5tl 為 10_6.3/0.Iml)、犬副流感病毒(TCID5tl 為 10_4 8/0.Iml)培養液倍比稀釋至1:128，分別取120 μ L滴加在樣品墊上，另外設生理鹽水做陰性對照。除犬腺病毒II型細胞培養液呈陽性反應外，其他的樣本皆為陰性反應，重複3次後結果相同，說明該方法有較高的特異性。
[0041](2)敏感性試驗:用生理鹽水對TCID5tl為10_5 2/0.1ml的犬腺病毒II型作倍比稀釋至1:128，分別取120 μ L滴加在樣品墊上，試紙仍呈陽性反應，重複3次後結果相同，本發明試紙敏感性強。
[0042](3)穩定性試驗:將本發明的3批試紙條分別放置在在37°C恆溫培養箱、常溫、4°C，每隔I個月取出同時檢測10份犬腺病毒II型樣本、10份陰性犬腺病毒II型陰性樣本，結果顯示:37°C作用6個月對本發明的試紙條無破壞作用，證明該試紙條在高溫下較為穩定；本發明的試紙條常溫放置12個月仍較為穩定。
[0043](4)與酶聯免疫吸附試驗比較:120份被檢測犬腺病毒II型感染疑似病例犬的糞便、病死臟器的樣本中，用酶聯免疫吸附試驗檢測陽性為79份，陰性41份，用本發明的試紙條檢測陽性為74份，陰性為46份，結果顯示:犬腺病毒II型用本發明試紙條檢測陽性率為61.7%，酶聯免疫吸附試驗的檢測陽性率65.8%，本發明試紙條與酶聯免疫吸附試驗的符合率為95.8%ο
【權利要求】
1.一種免疫膠體金試紙條，包括硬質聚氯乙烯背襯板(I)、硝酸纖維膜(2)、樣品墊(3)、膠體金結合墊(4)吸水墊(5)，其特徵在於:硝酸纖維膜(2)粘貼於在硬質聚氯乙烯背襯板(I)上，在硝酸纖維膜(2)的一端粘貼有膠體金結合墊(4)，在膠體金結合墊(4)上粘貼有樣品墊(3)，吸水墊(5)置於硝酸纖維膜(2)的另一端上； 所述的膠體金結合墊(4)噴塗有抗犬腺病毒II型單克隆抗體-膠體金標記物； 所述的硝酸纖維膜(2)上分別噴塗有兔抗犬腺病毒II型抗體多克隆抗體檢測線(6)和兔抗鼠抗體的質控線(7)。
2.根據權利要求1所述的一種免疫膠體金試紙條，其特徵在於:所述的硝酸纖維膜(2)為試紙條的檢測膜，上面靠左側的是檢測線(6)，質控線(7)位於右側，兩條線的間隔距離是4?6 mm η
3.權利要求1所述的一種免疫膠體金試紙條的製備方法，其步驟是: (1)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應製備膠體金:已矽化的瓶子中入100mL注射用水，再加入1.2 mL I % w/v氯金酸，放在電爐上加熱至完全沸騰；加入1.8 mL的1.05%檸檬酸三鈉水溶液，繼續加熱至溶液變成穩定的酒紅色，室溫下自然冷卻，為膠體金溶液； (2)膠體金的標記:將步驟(I)所得的膠體金用0.1 mol/L碳酸鉀調節pH值到8.0 ；加入單抗，攪拌40 min ;在攪動下,加入穩定劑10% BSA溶液封閉38?42 min得到穩定的犬腺病毒II型單克隆抗體-膠體金標記物；將標記好的膠體金溶液8800 rpm離心28?32min後重懸噴塗在膠體金結合墊上； (3)將兔抗犬腺病毒II型多克隆抗體和兔抗鼠IgG抗體稀釋後分別噴塗在硝酸纖維膜上構成檢測線和質控線； (4)將硬質聚氯乙烯背襯板(I)、硝酸纖維膜(2)、膠體金結合墊(4)、樣品墊(3)、吸水墊(5)按順序粘合在一起組成得到檢測犬腺病毒II型的免疫膠體金試紙條。
4.權利要求1所述的一種免疫膠體金試紙條在檢測犬腺病毒II型中的應用。
【文檔編號】G01N33/569GK104237512SQ201410566391
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年10月23日 優先權日:2014年10月23日
【發明者】徐高原, 賈慧勤, 董曉輝, 但漢並 申請人:武漢科前生物股份有限公司