茚滿醯醯胺在刺激紫杉屬次生代謝中的應用的製作方法

2023-06-10 12:05:51

專利名稱：:茚滿醯醯胺在刺激紫杉屬次生代謝中的應用的製作方法茚滿醯醯胺在刺激紫杉屬次生代謝中的應用發明領域本發明涉及茚滿醯(indanoy1)醯胺和茚滿醯胺基酸輟合物例如coronolone的應用，以及在紫杉烷生成物種的植物細胞培養中聚積紫杉烷類用於生產藥物組合物和治療方法的方法。相關技術綜述紫杉醇及其類似物例如多西紫杉醇在癌症治療中處於開發的前沿，在世界範圍內對這些產品有不斷增長的需求。由於紫杉醇的全化學合成很複雜且不經濟，紫杉醇及其類似物目前在商業上通過半合成或生物合成法生產。半合成需要使用高級的、天然存在的紫杉烷前體(與紫杉醇結構密切相關)，並且要採用複雜的化學作用來實現這些前體向紫杉醇或相關紫杉烷類的結構轉化。這些前體包括10-脫乙醯基漿果赤黴素III、漿果赤黴素III、N-醯化紫杉烷等。多種專利和文獻公開了二闢類化合物母核的合成路線、生物合成基因、酶類或向想要的紫杉烷類的化學轉化。對於這些公開的實例，參見例如美國專利第5，994，114號；美國專利第5，200，534號；美國專利第6，437，154號；美國專利第6，287，835號；美國專利第6，265，639號；"SyntheticRoutestotheDiterpenoidCoresofPhorbolandResiniferatoxin，"Eckelbarger，J.D.2001;"Taxolbiosyntheticgenes,"Walker,K.等人，戶力,由/z/"iT，58(2001)H。通過使用紫杉屬物種的植物細胞培養實現了紫杉醇的生物合成。生物合成路線的優點在於可以以相對純的形式直接生產目標化合物或組合物，而不需要另外的化學作用。若干出版物公開了通過生物合成法生產紫杉烷類的方法。美國專利第5，019，504號(Christen等人，1991)描述了通過短葉紅豆杉的細胞培養生產和回收紫杉醇和紫杉烷樣化合物。W093/171121(Bringi等人，1993)和美國專利第5，407，816號(Bringi等人，1995)描述了通過紫杉屬物種的細胞培養提高了紫杉醇和其它紫杉烷類的生產和回收。Bringi等人最早公開了經濟可行的生產紫杉烷類的植物細胞培養過程。美國專利第6，248，572號(Choi等人，2001)描述了在紫杉屬細胞的半連續培養過程中，通過向培養基中加入糖或糖與AgN03生產紫杉醇的方法。其它相關專利包括例如美國專利第5，665,576號和美國專利第6,428,989號。EP0683232Al(Yukimune，1995)、EP0727492A2(Yukimune等人)和WO97/44476(Bringi等人，1997)描述了在處理增強劑(processenhancementagent)例如重金屬化合物、重金屬絡離子、重金屬離子、胺或抗乙烯劑的存在下，並且在受控制的氧濃度下，通過培養組織或細胞生產紫杉烷類。這些專利申請還公開了茉莉酸和相關化合物在紫杉屬細胞的細胞培養中提高紫杉烷類收率的有益效果。這些專利申請中的處理增強化合物都不含芳環。與茉莉酸相關的化合物和它們的應用描述在例如Haider等人，"Structure-ActivityRelationshipsofSyntheticAnalogsofJasmonicAcidandCoronatineonInductionofBenzo[c]phenanthridineAlkaloidAccumulationin^yc/sc力o/z/sc"/屍則/caCellCultures,"Biol.Chem.，第381巻，第741-748頁，2000年8月；Krumm等人,"LeucineandIsoleucineConjugatesofl-0xo-2，3-dihydro-indene-4-carboxylicAcid:MimicsofJasmonateTypeSignalsandthePhytotoxinCoronatine,"Molecules1996，1，23-26;Miersch等人，"Structure-activityRelationsofSubstituted,DeletedorStereospecificallyAlteredJasmonicAcidinGeneExpressionofBarleyLeaves,'1Phytochemistry50(1999)353-361;Schuler等人，"Coronalon:aPowerfulToolinPlantStressPhysiology'1;Yamada等人，"ProcessforProductionofOximeDerivatives,"EP86102811.6，公開號第0194554B1號；Boudier等人，"SereoselectivePreparationandReactionsofConfigurationallyDefinedDialkylzincCompounds,"Chem.Eur.J.2000，第6巻，第15期，2748-2761中。Haider等人教導了茉莉酸類似物，它們可引起力傳導，常常並不同時引起次生代謝產物的生成。而且，Haider等人，Biol.Chem.，第381巻，第741-748頁，2000年8月(第744頁，第2欄，第1段)還報導了暈斑素(coronatine)的芳構化使它成為平面並且生物學無效。Haider等人指出防禦基因的激活和力傳導基因的激活似乎被沿著茉莉酸生物合成途徑的不同化合物所調節。暈斑素一一12-氧代-植物二烯酸結構相近的類似物，和十八烷類(octadecanoids)是巻須巻曲的強誘導物。另一方面，茉莉酸曱酯在激活笨並[c]菲啶生物鹼聚積方面比十八烷類或暈斑素有效得多。這些結果進一步支持了如下假說被十八烷類途徑激活的各種生理學響應，例如對食草動物(herbivory)或病原體的生理學響應，和其中尤其是力傳導，可以被誘導物分子的化學衍生化作用區分開來(Blechert等人，1997)。在此用Blechert等人(1999)相近類似物例如[茉莉酸酯的三個類似物](都是E.californica中的苯並[c]菲啶生物鹼聚積的強誘導物)進行防禦基因激活，而那些相同的化合物在誘導瀉根力傳導中卻失敗，通過所獲得的這些不同結果強烈地證明了這一點。Boland等人描述了有關植物生理學的一些方面，這些植物已經暴露於茉莉酸和/或暈斑素。參見例如Boland等人，"JasmonicacidandCoronatineInduceOdorproductioninplants'1,爿/7ge^a;7C^eCAe/z^.e—//7feri7af2'o/2a/fcT/f/0/7，43:1600—1602(1995);Krumm等人，"InductionofvolatilebiosynthesisintheLimabean(屍/aseo7us/回"us)bylucine-andisoleucineconjugateofl-oxo-andl-hydroxyindan-4-carboxylicacid:Evidenceforaminoacidconjugatesofjasmonicacidasintermediatesintheoctadecanoidsignalingpathway",卿S丄e".377:523—529(1995);和Schuler等人，"Synthesisof6-azido-l-oxo-indan-4-oylisoleucine;aphotoaffinityapproachtoplantsignaling",7e"a力^/ro"，55:3897-3904(1999)，Lauchli等人，"IndanoylAminoAcidConjugates:TunableElicitorsofPlantSecondaryMetabolism,"TheChemicalRecord,Vol.2，000—000(2002);和Schuler等人，"6-SubstitutedIndanoylAminoAcidConjugatesasMimicstotheBiologicalActivityofCoronatine，"W002/055480A3。WO02/55480描述了6-取代的茚滿醯胺基酸作為植物調節劑。Schuler等人(WO02/55480)指出:"6-乙基-l-氧代-茚滿醯異亮氨酸甲酯是Bryoniadiocia的觸覺敏感性巻須的巻曲反應的有效引發劑"。然而，WO02/55480既沒有公開細胞培養也沒有公開用於紫杉屬以提高紫杉烷類生產的用途。因此，由專利EP727492(Yukimune等人)的教導看來，其中說明了暈斑素誘導紫杉醇和紫杉烷類生物合成，預期暈斑素的平面芳構化類似物對於該目的不會是生物學有效的。發明概述有意義的是，這些以植物細胞培養為基礎的過程中沒有一個公開了使用例如6-乙基-茚滿醯-異亮氨酸(6-EII)用於改善或改變懸浮培養細胞、尤其是紫杉屬物種細胞的紫杉烷類生成。鑑於Schuler等人(WO02/55480)觀察到，茚滿醯胺基酸輟合物是巻須巻曲(力傳導)的有效引發劑，令人驚奇的是這些特定類似物將從紫杉屬細胞培養中引起紫杉烷類次生代謝產物的生成。此外，Haider等人指出，使暈斑素類似物平面化的芳構化也會使它們生物學無活性。然而，6-EII(它包含芳環)既是平面的又是有活性的。因此加倍令人驚奇的是，平面的暈斑素類似物茚滿醯胺基酸輟合物在紫杉屬細胞培養中會是有效的紫杉烷類生成引發劑。本發明的一個實施方案涉及在包含茚滿醯胺基酸的營養培養基中通過培養紫杉屬懸浮細胞生產紫杉烷類的方法。本發明的另一個實施方案涉及包含茚滿醯胺基酸的植物細胞營養培養基。茚滿醯化合物可在培養過程中的任何時刻加到分批補料(fedbatch)加料流(feedstream)中。在優選實施方案中，在補充的碳源;故包括在加料流中以前，懸浮培養中的營養培養基中的碳源被部分消耗。在本發明的各個實施方案中，多種增強劑和/或抑制劑可加到營養培養基中。在優選實施方案中，茚滿醯胺基酸以相對於不含它而言可有效改變培養生成的紫杉烷類譜(profile)的量加入。在另一個實施方案中，茚滿醯胺基酸以相對於不含它而言可有效地選擇性提高漿果赤黴素III的量提供。對於各個列舉的實施方案，茚滿醯胺基酸選自W002/55480中所述的化合物。更優選地，茚滿醯胺基酸是未取代的茚滿醯胺基酸(l-氧代形式)或6-取代的茚滿醯異亮氨酸及其衍生物。最優選地，茚滿醯胺基酸選選自6-乙基茚滿醯異亮氨酸(6-EI1)、6-溴代茚滿醯異亮氨酸(6-BI1)、1-氧代-茚滿-羧基-(L)-異亮氨酸-曱酯醯胺(1-0II)或其混合物。應該理解的是，任何一種茚滿醯胺基酸化合物都可單獨用於引發想要的紫杉烷類的生成。對於各個列舉的實施方案，提高紫杉烷類生成的優選方法包括使用另外的增強劑，更優選自銀化合物和絡合物、茉莉酸甲酯相關的化合物和苯丙烷類(phenylpropanoid)抑制劑。同樣地，可通過在適當階段向培養基中提供那些紫杉烷類的不同生物合成前體而刺激優選的紫杉烷類產物的生成。另外，現有技術公認，快速生物量生長和產物的快速生成可被分開，並且不同的營養培養基配方和不同的培養條件可用於生長和生產階段。在另一個實施方案中，營養培養基包含植物生長素(auxin)，具有植物生長素樣生長調節劑活性的化合物，或其混合物。在另一個實施方案中，營養培養基包含銀離子、銀化合物、銀絡合物或其混合物。在另一個實施方案中，營養培養基包含苯丙烷類代謝的抑制劑。在優選的實施方案中，苯丙烷類代謝抑制劑是含亞甲二氧基的化合物，更優選地，苯丙烷類代謝抑制劑是MDCA(3，4-亞曱二氧基肉桂酸)或相關化合物，例如亞甲二氧基硝基肉桂酸、3，4-亞甲二氧基苯乙酸、亞曱二氧基苯丙酸等。在另一個實施方案中，營養培養基進一步包含胺基酸，更優選地，胺基酸是穀氨醯胺。在優選實施方案中，茚滿醯胺基酸以相對於銀毒性具有保護性的量提供。發明詳述本發明提供了在紫杉烷生成物種的植物細胞培養中增加紫杉烷類聚積的方法，以及分離和純化它的方法。本發明涉及單獨使用或與其它增強劑聯用以改善紫杉烷類如紫杉醇、漿果赤黴素III和其它紫杉烷類似物的收率的特定增強劑(茚滿醯醯胺)。在整篇說明書中引述的各篇文獻都全文引入作為參考，至與本文公開不矛盾的程度。特別地，這些參考文獻提供了優選方法來從愈傷組織培養中開發生長培養基和生產培養基，所述培養基導致紫杉烷類的高收率，包括添加和操縱培養條件來改善收率。紫杉烷類是也被稱為taxoids或紫杉烷二薛類化合物的化合物家族成員。紫杉烷類以三環二萜紫杉烷環係為特徵。目前有超過300種已知的紫杉烷類。術語"紫杉醇樣化合物"或"紫杉烷類"可交換使用來描述具有紫杉烷環的二萜類化合物。紫杉烷類本身可具有抗腫瘤活性或能夠修飾產生生物活性化合物。各種具體紫杉烷也列舉在WO97/44476(Bringi等人，1997)、EP0683232Al(Yukimune，1995)和EP0727492A2(Yukimune等人)中。術語"紫杉烷生成細胞"是指在至少一組培養條件下能夠生成紫杉烷類分子的任何細胞。術語"紫杉烷生成物種"是指在至少一組培養條件下能夠生成紫杉烷類分子的任何物種。術語"紫杉烷生成細胞培養"是指包含"紫杉烷生成細胞"的任何培養。生物合成組織(也就是紫杉烷生成細胞)可選自任何紫杉烷生成物種(或其組合)，這對於本領域技術人員來說是已知的。優選地，該組織選自的紫杉屬物種是短葉紅豆杉、加拿大紅豆杉(Taxuscanadensis)、東北紅豆杉、歐洲紅豆杉、墨西哥紅豆杉、佛羅裡達紅豆杉(Taxusfloridana)、西藏紅豆杉、曼地亞紅豆杉、紅豆杉和Taxusgena。更優選地，紫杉屬組織選自紅豆杉。可選地，該組織可選自一種或多種榧樹屬的物種。榧樹屬物種優選為Torreyagradifolia或Torreyacalifornica。該組織也可選自一種或多種榛屬的物種。優選地，榛屬物種是歐洲榛子。使用來自不同物種、變種、品系和/或屬的細胞以任何方式的組合是本發明所關注的。例如，紫杉屬物種細胞的一種或任何組合可與榧樹屬物種的一種或任何組合相聯合，而不意欲限於此。也打算使用來自雜種和遺傳改變等植物的組織。術語"愈傷組織"用於描述結構未分化的培養的植物細胞團塊，它在固體化培養基上培養。術語"懸浮培養"用於描述分散在液體營養培養基中的結構未分化的細胞。可以理解的是，懸浮培養包含各個聚集階段的細胞。懸浮液中聚集物的大小範圍從直徑數十微米(單細胞或少量聚集細胞)到直徑數毫米的聚集物，後者由數千個細胞組成。術語"營養培養基"用於描述適合於植物細胞愈傷組織培養和懸浮培養的培養基。術語"營養培養基"是概括性的，包括"生長培養基"和"生產培養基"。術語"生長培養基"用於描述有利於培養細胞快速生長的營養培養基。術語"生產培養基"指的是有利於培養細胞中紫杉醇、漿果赤黴素III或總紫杉烷類生物合成的營養培養基。可以理解的是，生長可以發生在生產培養基中，生產也可以發生在生長培養基中，生長和生產都可以發生在單一的營養培養基中。優選地，紫杉烷生成細胞培養的生長階段和生產階段是可區別開的，具有獨立優化的營養培養基。當所有的營養素一開始就都提供，並且包含細胞和產物的培養內容物在培養階段結尾採集的時候，這種操作模式被稱為"單階段批處理"。當批處理分成兩個連續階段一一生長階段和生產階段，在這兩個階段之間要改變培養基時，這種操作模式稱為"兩階段批處理"。在本發明關注的範圍之內，從生長培養基到生產培養基的轉換可通過不連貫的分步變換，或漸進地通過一系列步驟，或通過漸進的連續變換來實現。在一個極端中，漸進的變換是通過遞增改變組成的培養基的漸進置換來實現的。在另一個可選擇的方案中，漸進的變換是通過將生產培養基的一種或多種組分加料到生長期培養物中來實現的。這是分批補料法(fed-batchprocess)的一個實例。在"分批補料"操作中，特殊的培養基組分例如營養素和/或一種或多種增強劑在一階段或兩階段培養的全部過程中或部分過程中定期地或連續地提供。營養素和增強劑的描述可在例如表A或W097/44476(Bringi等人，1997)的表1和2中找到。另外，也可釆用不連貫變換和漸進變換的組合。在一個實例中，一部分營養培養基可不連貫地變換，而其它組分可緩慢加料。根據本發明的一個實施方案，當收穫批培養內容物的相當大部分但不是全部，並且加入用於持續細胞生長和生成的新鮮培養基時，該過程類似於"反覆吸出和填充"操作，被稱為"半連續過程"。根據本發明的一個實施方案，當持續提供新鮮培養基，並且持續或重複除去廢棄培養基時，該過程稱為"連續的"。根據另一個實施方式，如果細胞保留在反應器中，該過程稱為"灌注模式"。根據本發明的一個實施方式，如果細胞隨著廢棄培養基一起被持續移除，該連續過程被稱為"恆化培養"。茚滿醯醯胺本發明關注的茚滿醯醯胺作為特別有用的增強劑用於改進或改變紫杉烷類生成，描述如下。例如在W002/55480中描述了製造該化合物的化合物和方法，它已經被引入作為參考。暈斑素具有下式formulaseeoriginaldocumentpage12[029]如Boland等人所述，認為茚滿醯醯胺是暈斑素類似物。在W002/55480中描述的化合物之中，優選化合物是茚滿醯胺基酸輟合物(也稱為茚滿醯胺基酸)。優選地，本發明考慮使用如下化合物，該化合物可用例如複製如下的Boland等人(WO02/55480)的通式表示雖然Boland描述了R基團的各種取代基，它們中的每一個都考慮用於本發明，然而優選的R基團包括^-雙鍵鍵合的氧；R2-低級烷基，例如曱基或乙基，或卣素，優選溴；R3-甲基或氫；和R4-胺基酸側鏈。優選地，胺基酸是非極性天然或合成胺基酸。更優選地，胺基酸選自甘氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和脯氨酸。在特別優選的實施方案中，胺基酸是異亮氨酸。根據本發明，茚滿醯醯胺用於代替或補充如下所述的引發劑。優選地，茚滿醯衍生物和類似物在10-500nmo1/1的範圍內使用，更優選50-250nmo1/1。細胞培養方法和培養基培養條件的操縱和增強劑可操縱培養條件以有利於所需紫杉烷類的生成。例如，可操縱反應條件，例如溫度、pH、黑暗度、除去或添加營養素或其它試劑、改變營養素或試劑的濃度或其組合。組合物可進一步包含許多另外的組分中的任何一些，例如營養素和增強劑。優選地，組合物包含如下討論的增強劑例如引發劑，茉莉酸酯相關的化合物，影響乙烯生物合成或作用的化合物，尤其是抑制劑，苯丙烷類代謝抑制劑，抗老化劑，前體和植物生長素相關的生長調節劑。在細胞培養啟動之前，可根據其它參數選擇組織，例如在特定條件下有利於形成特定紫杉烷或紫杉烷前體的能力，或處理(例如化學地、遺傳上地或其它方面)組織以有利於形成特定紫杉烷或紫杉烷前體。次生代謝產物的生成是一個複雜的過程，需要很多不同的酶的協同作用來產生並順序修飾最終轉變成目標次生代謝產物的前體。與此同時，如果其它酶對所需代謝產物前體進行代謝，耗盡了構建次生代謝產物所需的前體庫，那麼次生代謝產物產生將會減少。紫杉烷類是通過一系列很多酶促步驟產生的次生代謝產物，已知數類增強劑可改善紫杉烷類的生物合成(參見例如表A,和WO97/44476(Bringi等人,1997)，EP0683232Al(Yukimune，1995)和EP0727492A2(Yukimune等人))。這些增強劑中的一種添加到紫杉烷生成細胞培養中將提高紫杉烷類的生產率。此外，增強劑的使用將在很多紫杉烷生成培養物中具有至少一些增強效果，這意味著總生產率不是由單個限速步驟決定，而是由眾多限制因素之間的複雜相互作用決定。任何一個限制因素的解除將提高紫杉烷類的生成，儘管提高的強度將取決於特定培養條件，該條件決定了紫杉烷類生物合成中其它步驟(一旦特定限制被解除)的相對限制作用。影響各種限制因素之間的相互作用的培養條件包括細胞的遺傳組成、培養基的組成和氣體環境、溫度、照明和操作方案。添加到特定培養中的增強劑將通常根據該培養中的限制因素而選擇，可憑經驗比較本文所列的各增強劑的效果來決定。如果培養中存在一種以上的增強劑，可提高紫杉烷類生成。增強劑種類有抗褐變劑、抗老化劑、抗乙烯劑、植物生長調節劑、前體、抑制劑、引發劑和刺激劑。有代表性的增強劑和典型的需要量已經描述在例如上述背景部分中引用的參考文獻中。在優選的實施方案中，培養基可特別適合於有利生長或紫杉烷類生成。根據本文提供的指導，和考慮到普遍理解的植物細胞生理學和新陳代謝原理，本領域技術人員可以很容易地獨立開發出有利於生長或紫杉醇/紫杉烷類生成的培養基。紫杉烷生成組織的愈傷組織形成和愈傷組織繁殖的方法，連同改變生長形態學、生產能力、產物鐠和其它特徵的優選方法，都是現有技術已知的。在建立了愈傷組織培養以後，然後在生產和/或生長培養基中培養細胞。特別地，通過在懸浮培養中培養紫杉烷生成細胞促進大量紫杉烷類的生成。一般而言，可以使用成功培養愈傷組織的培養基來啟動懸浮培養。然而，對懸浮培養的需求，尤其是對紫杉烷類高效生產的需求可通過修飾培養基來更好地滿足。現已發現，當紫杉烷生成細胞在修飾培養基中培養並處理參數時，得自培養的一種或多種紫杉烷的收率相當大地提高了。當使用合適的營養素和反應條件時，生成紫杉烷類的懸浮培養能夠實現快速生長速率和高細胞密度。對於本領域技術人員來說，根據本文提供的指導和已經全文引入本文作為參考的專利，摻入、修飾和操縱特定種類的組分和來自給定種類的組分，以達到最佳性能，這是一件常規的事情。本發明關注於使用經修飾產生想要的結果的生物合成過程。根據本發明的實施方案，紫杉烷生成細胞在可以產生紫杉烷類的條件下培養。這些條件包括有利於生物量累積和/或紫杉烷類生成的條件。紫杉烷生成細胞的培養詳細描述在例如美國專利第5，407，816號(Bringi等人，1995)和W097/44476中，這些紫杉烷生成條件的修飾描述如下，並在下列實施例1到8中舉例說明。然而，本發明並不旨在限制於此。本領域技術人員可以根據本文提供的指導結合已經引入作為參考的文獻製備適當的紫杉烷生成細胞培養物。各種培養條件和增強作用是本領域已知的，例如在本申請各處描述的參考文獻中；然而，優選條件描述如下。優選的細胞培養實施方案細胞培養啟動包括，例如，植物源材料的表面滅菌，如用潔淨水徹底洗滌，使用消毒劑，如次氯酸鹽，使用潤溼劑，如吐溫或Triton,使用抗生素，和任選使用抗真菌劑。然後，可完整使用植物部分，或可使用它的一部分，例如從種子剝離的胚芽。然後，培養條件使用現有技術已知的適合於紫杉屬愈傷組織形成的典型營養培養基、溫度範圍和pH範圍。類似地，使用膠凝劑、減少色素沉著、活性炭等，以及標準光照/黑暗循環。愈傷組織繁殖是附著於植物部分的基本上未分化細胞團的發育，它被小心地剝離，並作為未分化培養物進行繁殖。與優選培養基、pH範圍、優選碳源、氮源、大量鹽和微量鹽、維生素和生長調節劑有關的培養條件都描述在例如W097/44476中。除了那其中所列的程序以外，優選的膠凝劑包括瓊脂、水凝膠、明膠和gelrite。同樣地，炭優選用於除去廢料和不需要的有機化合物。接種物通常在約0.01-10g/25ml的範圍內。另外，優選地，傳代培養技術用於愈傷組織部分定期連續轉移到新鮮營養素源中。懸浮培養條件描述在例如W097/44476中。除了那其中所列的程序以外，一旦啟動，可如下進一步進行懸浮培養，或者通過從培養基中大體分離細胞(通常通過過濾)，然後再次導入一部分到含營養素的培養基中，或者通過轉移一定體積的培養肉湯(細胞和培養基)到含營養素的培養基中，或者通過使細胞沉降，接著除去已經存在的任何部分培養基並再次導入含營養素的培養基。當細胞被分離和轉移到不同的含營養素的培養基中時，轉移的量可為以新鮮重量為基礎的0.3%到30%，儘管優選1%-25%的新鮮重量。注意，當細胞適應新環境和/或生長時，這個分數可改變。當細胞和培養基按體積轉移時，轉移體積相對於最終體積的比可從1%到基本上所有體積。在這種情況下，為了只導致小量體積增加，新鮮營養素可以濃縮形式提供。因此，培養可分成數個部分。每個部分可任選用於紫杉烷生成。不同部分的包含營養素的培養基的組成不需要相同。可加入不包含在原始培養基中的其它成分，或可省略或在強度方面改變原始培養基中的項目。培養持續時間通常至少2天。另外，可通過補充加入了營養素的部分消耗的培養基延長生長的持續時間。所有濃度都指的是細胞外培養基中的平均最初值。加料溶液中的濃度和因此局部與細胞接觸的濃度可高於所指出的濃度。除了在植物細胞培養中通常採用的營養素以外，其它成分可包括在內，以協助紫杉烷類生產。特別適合於紫杉烷類生產的成分包括選自以下的一種或多種引發劑、刺激劑、前體、抑制劑、生長調節劑、重金屬和/或乙烯抑制化合物。引發劑包括茉莉酸和相關化合物，tuberonicacid和相關化合物，cucurbicacid和相關化合物，暈斑素和相關化合物，6-乙基-茚滿醯異亮氨酸和相關化合物，12-氧代-植物二烯酸和相關化合物，系統素和相關化合物，volicitin和相關化合物，寡糖，殼聚糖，甲殼質，葡聚糖，環狀多糖，包含來自細菌、真菌、酵母、植物、昆蟲的細胞物質的製劑，或包含在昆蟲唾液或分泌物中的物質等，植物中乙烯生物合成或作用的抑制劑，特別是包含銀的化合物或絡合物，鈷，氨基乙氧基乙烯基甘氨酸等，苯丙烷類代謝抑制劑例如已知抑制苯丙氨酸氨裂解酶、肉桂酸羥化酶、香豆酸CoA連接酶的化合物，亞曱二氧基肉桂酸，亞曱二氧基硝基肉桂酸，亞曱二氧基苯丙酸，一般而言，包括亞曱二氧基官能團的其它化合物例如亞甲二氧基苯乙酸，亞甲二氧基苯甲酸等。生長調節劑和/或抑制劑及其組合的非限制性實例包括在表A和W097/44476(Bringi等人，1997)中公開的表格中，這並不是旨在對其進行限制。胺基酸包括用於細胞培養的任何普通胺基酸，例如穀氨醯胺、穀氨酸、門冬氨酸、a-或(5-苯丙氨酸等。引發劑例如茉莉酸相關化合物等通常可以0.01畔o1/1到1mmo1/1的劑量使用。該值優選為1到500nmo1/1。可根據製劑的特定組分的濃度，或作為培養體積的一部分，添加包含細胞物質的製劑。重金屬和乙烯抑制劑例如銀鹽或絡合物可以至多lmmo1/1的濃度使用；然而，範圍為0.01到500nmol/l。可以1jimol/l到5mmo1/1的濃度使用其它抑制劑。包括亞甲二氧基官能團的芳香化合物可以0.1jimol/l到5mmol/1的濃度包括在內，但更通常是1jimol/l到2mmol/l。生長調節劑可以0.001pmol/l到2mmol/1的值使用，但更通常地，它們可以0.01nmol/1到1mmol/1的濃度範圍使用。前體例如胺基酸或萜類前體可以1jimol/l到20mmol/1的濃度範圍使用；然而更通常地，它們以10nmol八到10mmol/1的濃度使用。按照本文提供的指導，對於本領域技術人員來說，通過常規實驗方法來發現在所建議的有用範圍之外單獨使用物質或聯合使用物質的特別益處，這是可能的。這些發現也認為在本發明的範圍之內。可以很多不同方式提供供給細胞的成分。可在生長的特定階段加入成分，例如滯後期、指數期或穩定期。所有成分都可一次提供，然後在適當的時間階段之後，可回收紫杉烷類。可選擇地，不是所有成分都一次全部提供，而是在培養過程的不同時間提供它們中的一種或多種。此外，添加在初始接觸時間方面可能是不連續的或交錯開的，並且該供給的持續時間對於不同成分可有所不同。成分可分多個部分提供。然後可以回收紫杉烷類。一種或多種成分可作為分別與細胞培養或其部分接觸的溶液的一部分進行提供。可從全部培養物或培養物的一部分(只有培養基，只有細胞，或一定量的細胞和培養基一起)中回收紫杉烷類。可在培養期間的任何時間或在培養階段完成以後回收紫杉烷類。可在任何時間或定期性地取出部分培養物，並用於紫杉烷類生產和/或回收或進一步繁殖細胞。這種包含細胞的部分可進一步與營養素或希望的其它成分接觸。在一個實施方案中，包含營養素或其它成分的培養基可加入以補充移除體積的一部分或全部。補充(稀釋)速率(由器皿中液體體積劃分的添加容積率)可為細胞特定生長速率的0.1倍到10倍。部分這種移除物質可加回到原始培養中，例如，可移除細胞和培養基，培養基或細胞可用於紫杉烷類回收，剩餘的細胞或培養基可返還。提供到培養中的成分的提供速率或培養中各種成分的水平可控制以有利於生產和回收紫杉烷類。培養的單獨分開部分可以任何前述方式與成分接觸，然後以經測定有利於紫杉烷類生產的比例合併。培養的細胞含量也可調節至有利於生產紫杉烷類或繁殖細胞的程度。細胞含量的調節可有利地和與營養素或其它成分接觸的策略相結合。氣體例如氧、二氧化碳和乙烯的水平可控制以有利於生產一種或多種紫杉烷，或有利於生物量累積。實驗室規模培養器皿中的常規培養保持在空氣氛中，通常用例如板、塞子或蓋子封閉，導致溶解的氧水平低於空氣飽和度，而C02和乙烯水平高於大氣中存在的C02和乙烯水平。因此常規地，培養物頂部空間中的二氧化碳水平通常大於約0.03%。然而，二氧化碳和/或乙烯濃度可調節至有利於生成紫杉烷類或繁殖細胞的程度。因此，發明人已經發現，為了讓紫杉烷類更好地生成，優選該水平高於0.1%(大約是大氣的3倍)到10%,優選為0.3%到7%的(]02。乙烯可優選低於100ppm，這是在那個溫度下，在與液相平衡的氣相中測定的，優選低於20ppm。可以使用一種或多種方法控制溶解的氣體，包括改變攪動速率、通氣氣體的組成、通氣氣體的補給速率或排氣速率，或通過調節培養器皿中的總壓力。氣體也可獨立提供，例如，氧和C02源可不同。攪動速率可控制在l次到500次每分鐘之間(攪拌器或液體循環的旋轉或振動)。氣體的補給速率可介於0.01到IO體積氣體每體積培養肉湯每分鐘，並且可直接提供到培養液體中，或提供到液體的分離部分中，該液體分離部分隨後與培養的剩餘部分混合，或提供到培養的頂部空間中。典型地，對紫杉烷類生成和紫杉屬細胞生長有利的溶解氧濃度可在操作溫度下控制在10%到200%氣體飽和度之間，優選為氣體飽和度的20%到150%。當然，由於各種操作方面的原因，例如通氣臨時減少，溶解的氧水平可能低至零，並持續數分鐘到數小時，這是有可能的。在這些範圍之外的氧、二氧化碳和乙烯的特別有用的組合可通過常規實驗發現，認為這在本發明的範圍之內。在一個實施方案中，培養基可特別適合有利於生長或紫杉烷類生成。根據以上給出的指導和根據對植物細胞生理學和新陳代謝的一般理解的原理，本領域技術人員能夠設計出有利於生長或紫杉醇/紫杉烷類生成的培養基。例如，人們可改變溫度範圍(如(TC-35X:，優選15'C-35。C，更優選20°C-30'C)。同樣地，人們可改變光照/黑暗循環的周期。在優選的實施方案中，紫杉烷生成細胞從生長培養基轉移到具有更高基本碳源濃度的生產培養基中。生產培養基還包含含銀化合物或絡合物，和含亞甲二氧基的化合物。另外，在細胞和生產培養基首次接觸後0-3天，將茚滿醯胺基酸化合物(如6-EII)、穀氨醯胺和NAA(萘乙酸)引入培養中。甚至更優選地，這些成分在加料流中提供。補充的葡萄糖或麥芽糖優選當需要時加到培養物中。從細胞培養物、植物組織或包含不同紫杉烷的混合物中純化、重結晶、分離、提取紫杉烷類的方法描述在例如美國專利第6，452，024號;美國專利第6，215，000號；美國專利第6，136，989號；美國專利第6,124,482號；美國專利第5，281，727號；美國專利第5，380'916號;美國專利第5，969，165號；美國專利第5，900，367號；美國專利第5,393,896號；美國專利第5，393，895號；美國專利第5,549，830號；美國專利第5，654，448號；美國專利第5，723，635號；美國專利第5，736，366號；美國專利第5,744,333號；美國專利第5，756，098號和美國專利第6，008，385號中。在使用分批補料的過程中，已經發現細胞可以保持在生產狀態持續延長的時間，事實上，細胞的生產能力是能夠增強的。對於技術人員來說顯然的是，可改變進料組成，以獲得所需的結果，例如延長生產階段以提高紫杉烷類收率，或延長生長階段以獲得較高的生物量密度。選擇適當的條件來達到最佳的生產能力和性能，這在本領域普通技術人員考慮到本文所述的教導是很容易的。類似地，其它操作參數例如添加的定時和持續時間和分批補料組分的添加速率的變化，來達到所需的結果，這也是技術人員考慮到本文所述的教導能夠達到的。如所引證的，例如在Bringi的W097/44476中，用過的培養基的周期性去除和新鮮培養基的周期性補充，例如每隔數日，促成了總紫杉烷類和紫杉醇生產的顯著增加，以及細胞外產物的量的提高。培養基交換的刺激作用可能是由於就地移除了產物，這能防止反饋抑制和產物降解。就地產物移除對於不相關植物懸浮培養中次生代謝產物生成和分泌的這種正面影響除了別人以外已經由Robins和Rhodes(1986)以及Asada和Shuler(1989)證明了。周期性的除去用過的培養基也有以上優點，另外，通過從培養基中移除其它的非紫杉烷類抑制性組分(例如酚類化合物)可用於使繼發生物合成去抑制。通過提供已經耗盡的基本營養素，新鮮培養基補充到正在進行活躍生物合成的細胞中也可增強生產。例如，Miyasaka等人(1986)只是通過添加蔗糖到培養基中就能夠刺激丹參的穩定期細胞生成二薛類代謝產物隱丹參酮和彌羅松酚。也許，由於穩定期中碳的限制，生物合成已經停止了。作為任何以上因素的結果，本發明所用的周期性培養基交換方案可能是有益的。消耗的培養基組分的補充也可以通過包含所述組分的加料流(分批補料)來完成。可以預期的是，交換的培養基的量、交換頻率、補充的培養基的組成是可根據本發明的不同實施方案改變的。通過培養基交換刺激生物合成和分泌的能力對於連續、半連續或分批補料模式的有效商業工藝過程的設計和操作具有重要含義。儘管可單獨使用以上描述的在培養中生產紫杉烷類的任何實施方案，然而所述技術也可彼此組合使用。實施例下列實施例是非限制性實施例。對於本領域普通技術人員來說顯而易見的是，可以對它們作出很多改變和修飾，而不背離本文所述的本發明的精神或範圍。實施例1-紫杉屬細胞的培養使用植物細胞培養的公認技術從紫杉屬植物任何合適的部分開始紫杉屬細胞培養。除了在固體化培養基上培養的細胞不需要攪動以外，基本上未分化的細胞在下述條件下在固體化或液體營養培養基上繁殖。紫杉屬細胞在溫度22-28攝氏度下培養，pH4-7，暗處，使用攪動來混合培養物並提供氧和其它氣體，將含氧氣體與細胞懸浮液接觸來換氣。在操作溫度下將氧保持在10%到150%空氣飽和度，二氧化碳保持在高於0.05%。通過調節攪動、壓力、氣體組成、氣體的換氣速率或補料速率的方式控制氧和其它氣體的水平。培養基包含能夠支持紫杉屬細胞生長的組分，例如1-100g/1的糖，l-100腿o1/1的累積量氮源，並且可包括生長調節劑，例如植物生長素和/或細胞分裂素樣化合物，例如萘乙酸(NAA)、苯氧乙酸和卣素取代的苯氧乙酸、毒莠定、二氯甲氧苯酸、苯曱酸嘌呤、激動素、玉米素、苯基噻二唑脲、吲哚乙酸等。培養基可任選包含紫杉烷類物質，例如漿果赤黴素III或10-脫乙醯基漿果赤黴素III，胺基酸例如穀氨醯胺、a-或p-苯丙氨酸或其它，亞甲二氧基肉桂酸(MDCA)，或亞曱二氧基硝基肉桂酸或亞甲二氧基苯乙酸或a-氨基苯乙酸或相關化合物，銀離子源，例如以硝酸銀或硫代硫酸銀的形式，或其它能夠影響乙烯生物合成或作用的成分。紫杉屬細胞的接種濃度可為10g新鮮細胞重量/1到300g新鮮細胞重量/1。培養基還包含本申請所述的茚滿醯醯胺，任選與一種或多種茉莉酸相關物質聯合，這些物質可在培養開始加入，在指數生長期以後加入，或在整個培養過程中間歇加入。培養基的其它成分可在培養過程中的一個時間全部加入，或在不同時間加入，可連續進料或間歇進料。可在培養肉湯中包括植物細胞之前或之後加入這些成分。此外，如果認為有用的話，可在培養過程中另外加入營養素或其它成分。任選地，可在培養適當階段之後變更培養基，藉此將細胞新鮮暴露於包含上述類似成分的培養基中。這種變更可以包括改變糖例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等的量，改變氮源例如硝酸鹽、銨的量，或改變胺基酸或水解酪蛋白胺基酸等的量。經過一段時間的培養之後，收穫培養物，並用HPLC對紫杉烷類水平進行定量，使用LC/MS/MS鑑定特定的紫杉烷。可以從這些培養物中通過適當的提取和純化過程回收紫杉烷類。對於實驗2-8來說，紫杉屬細胞在固體培養基上作為愈傷組織培養物培養，然後進一步在液體培養基中培養成細胞團塊懸浮液。儘管可以在固體培養基上通過培養生成紫杉烷類，但優選使用液體培養基。培養溫度控制在20到30攝氏度之間。實施例2根據下列參數進行本實驗。12天分批補料處理的結果描述在表l中，證明了6-EII和茉莉酸甲酯具有相當的活性。根據上述方法，將紅豆杉細胞作為愈傷組織培養，然後作為懸浮細胞培養在包含1%麥芽糖和B5鹽的生長培養基(表B中所示的培養基A)中。在該培養基中培養了7天以後，從該培養基中大體分離出懸浮細胞，並以約20%(w/v)新鮮細胞置於生產培養基中，生產培養基由約20°/(v/v)用過的生長培養基和80%(v/v)基礎生產培養基(表B中所示的培養基B，但濃縮1.25倍)組成，最初pH為5.8，包含20jimol/lMDCA和50jimo1/1SLTS(硫代硫酸銀)。NAA(萘乙酸)、GLN(穀氨醯胺)和MJS(茉莉酸曱酯)或6-EII(6-乙基-茚滿醯-異亮氨酸)作為加料流的一部分以下列速率進行補料1.66pmol/l/d歸)，0.84mmo1/1/d(GLN),和MJS(2.51nmol/l/d)或6-EII(0.832、1.665、4.17或6.25一ol/l/天)。氣相控制在25%氧和4.5%C02(平衡氮)，溫度控制在25±2攝氏度。在暗處培養細胞，在實驗過程中以100-150rpm攪動。在生產培養基中培養了12天以後，在培養物中收穫紫杉烷類。下列結果證明了在補充了6-EII(即20-100jimol/l的累積劑量)增量或茉莉酸甲酯(MJS)的培養基中，紫杉烷類生成以類似於茉莉酸甲酯的方式響應6-EII。表l:6-EII的分批補料添加對紫杉烷類生成的作用tableseeoriginaldocumentpage24實施例3數據顯示，6-EII和MJS在提高紫杉烷類生成方面具有相當的活性。因此，當它本身使用時，6-EII無疑是有效的。然而，數據還指出培養基的組分之間有若干正相互作用。數據顯示，6-EII與銀協同作用增加紫杉烷類的總產量。特別地，結果證明了6-EII改善漿果赤黴素-III生產而不降低所生產的紫杉醇的量的能力。6-EII和植物生長素型生長調節劑NAA也能積極相互作用改進紫杉烷類的生產。6-EII和植物生長素型生長調節劑的組合令人意想不到地優於單獨各組分的使用。數據證明了6-EII和胺基酸穀氨醯胺有利地相互作用改進紫杉烷類生成。數據還令人驚奇地證明了6-EII、銀(以SLTS提供)和植物生長素型生長調節劑NAA相互作用改進了紫杉烷類的生成。因此，6-EII與其它增強劑的聯用，例如NAA——植物生長素型生長調節劑、SLTS—一含銀化合物/絡合物的實例(乙烯作用的抑制劑)、含亞甲二氧基的化合物(苯丙烷類代謝抑制劑)和穀氨醯胺(胺基酸的實例)，連同適當配方的培養基(例如表B的培養基B)—起，導致了紫杉烷類生成的改進。實施例4根據下列參數進行本實驗。根據上述方法，將紅豆杉細胞培養成愈傷組織，然後作為懸浮細胞培養在生長培養基A(表B)中。在該培養基中培養了7天以後，從該培養基中大體分離出懸浮細胞，並以約20%(w/v)新鮮細胞置於最初pH為5.8的基礎生產培養基(表B的培養基B)中。除了培養基B中所列的成分以外，培養基還另外包含5ramol/l穀氨醯胺。氣相控制在氧為空氣中值的90-97%，和2.5-6%C02;溫度保持在25±2攝氏度。在暗處培養細胞，在實驗過程中以150-200rpm攪動。在生產培養基中培養了14天以後，在培養物中收穫紫杉烷類。測試響應培養基的特定組分組合的紫杉烷類收率，並與在發現5-500nmo1/1的6-EII本身的摻入導致了紫杉烷類收率的提高。然而，當與20NAA(—種植物生長素型生長調節劑)聯用時，收率提高量顯著更高。當50jimol/l銀(一種乙烯作用的抑制劑，以硫代硫酸鹽絡合物提供)加到6-EII和NAA的聯合中時，收率進一步提高了。並且，當20nmol/1MDCA(3，4-亞甲二氧基肉桂酸，已知是苯丙烷類代謝抑制劑)加到該聯合中時，收率甚至更進一步提高了。這些令人驚訝的活性從單獨組分的活性中是無法預測的。在特定條件下，通過滴定使組分濃度最優化，例如使用50-200jimol/1茚滿醯胺基酸如6-EII,與20nmol/1NAA聯用或與20jimol/1NAA和50jimol/1SLTS聯用，或與20junol/lNAA、50pmol/lSLTS和20拜o1/1MDCA聯用，以使想要的結果最大化，這也是可能的。實施例5-硝酸銀和6-EII對紫杉烷類生成的影響[O70]根據以上實施例1和2中所述的方法，將紅豆杉細胞培養成愈傷組織，然後作為懸浮細胞懸浮在生長培養基(表B的培養基A)中。在該培養基中培養了7天以後，從該培養基中大體分離出懸浮細胞，並以約20%(w/v)新鮮細胞置於最初pH為5.8的培養基B(表B)中。除了表B中所列的成分以外，將20fimol/1NAA、20fimol/1MDCA、5mmol/1GLN、MJS或6-EII,和作為硝酸鹽或硫代硫酸鹽絡合物的銀以多種水平加到培養基中。氣相控制在氧為空氣中水平的90-97%，和C02為2.5-6%;溫度保持在25±2攝氏度。在暗處培養細胞，在實驗過程中以150-200rpra攪動。在生產培養基中培養了H天以後，在培養物中收穫紫杉烷類。數據證明了6-EII和銀協同作用。因此，單獨使用的6-EII或銀都不能產生當細胞暴露於這些試劑聯合存在時所觀察到的作用的強度。在該實施例中，硝酸銀和硫代疏酸銀被用作含銀化合物或絡合物的說明性的實例。發明人已經發現了也可使用數種其它的含銀化合物或絡合物。其它適當的銀絡合物的實例可在例如背景部分中討論的公開內容中找到，例如W097/44476和美國專利第6，428，989號。實施例6根據下列參數進行本實驗。根據上述方法，將紅豆杉細胞培養成愈傷組織，然後作為懸浮細胞懸浮在生長培養基(表B的培養基A)中。在該培養基中培養了7天以後，從該培養基中大體分離出懸浮細胞，並以約20%(w/v)新鮮細胞置於最初pH為5.8的基礎生產培養基(表B的培養基B)中。除了表B中所列的成分以外，培養基還包含20,1/1NAA、20,1/1MDCA、5mmo1/1GLN，和50拜o1/1作為硫代硫酸鹽絡合物的銀。將6-BII以下表2中標明的水平加到生產培養基中。氣相控制在氧為空氣中水平的90-97%，和C02為2.5-6%;溫度保持在25±2攝氏度。在暗處培養細胞，在實驗過程中以150-200rpm攪動。在生產培養基中培養了14天以後，在培養物中收穫紫杉烷類。數據顯示，像6-EII—樣，6-BI1(閨素取代的衍生物)也是紅豆杉細胞培養物生成紫杉烷類的有效誘導劑。數據還舉例說明了最佳6-BII水平的確定，它同樣可通過在紫杉烷生成細胞培養物中滴定其它茚滿醯醯胺來確定。表2:6-溴代茚滿醯異亮氨酸(6-BII)對紫杉烷類生成的影響tableseeoriginaldocumentpage27實施例7根據下列參數進行本實驗。根據上述方法，將紅豆杉細胞培養成愈傷組織，然後作為懸浮細胞懸浮在生長培養基(表B的培養基A)中。在該培養基中培養了7天以後，從該培養基中大體分離出懸浮細胞，並以約20%(w/v)新鮮細胞置於最初pH為5.8的基礎生產培養基(表B的培養基B)中。除了表B中所列的成分以外，培養基還包含20,1/1NAA、20,1/1MDCA、5mmol/1GLN，和50junol/1作為硫代疏酸鹽絡合物的銀。將1-0II以下表中標明的水平加到基礎生產培養基中。氣相控制在氧為空氣中值的90-97%，和0)2為2.5-6%;溫度保持在25±2攝氏度。在暗處培養細胞，在實驗過程中以150-200rpm攪動。在生產培養基中培養了14天以後，在培養物中收穫紫杉烷類。數據顯示，像6-取代的衍生物一一以上討論的6-EII和6-BII—樣，6-未取代的茚滿醯異亮氨酸在紫杉屬懸浮培養中也是紫杉烷類生成的有效誘導劑。表3:l-氧代-茚滿-羧基-(L)-異亮氨酸-甲酯醯胺(l-OII)對紫杉屬細胞懸浮培養總紫杉烷類蓄積的影響tableseeoriginaldocumentpage28實施例8一6-EII的分批補料供應的效果和與向培養物中補充另外的糖相聯合的效果根據上述方法，將紅豆杉細胞培養成愈傷組織，然後作為懸浮細胞懸浮在生長培養基A(表B)中。在該培養基中培養了7天以後，從該培養基中大體分離出懸浮細胞，並以約20%(w/v)新鮮細胞置於最初pH為5.8的濃縮了1.25倍的培養基B(表B)中，向其中加入20%(v/v)培養基A培養結束時用過的培養基。另外還加入20jimol/lMDCA和50nmo1/1作為硫代硫酸鹽絡合物的銀。以下列速率作為加料流一部分補充NAA、GLN和6-EII:1.66jimol/l/d(MA)、0.84mmol/l/d(GLN)和4nmol/l/天(6-EI1)。氣相控制在25%氧和4.5%CO"平衡氮)，溫度保持在25士2攝氏度。在暗處培養細胞，在實驗過程中以100-150rpm攪動。在這些條件下培養了一段時間以後(在該案例中是12天)，培養物部分耗盡了主要的碳源。這時，向包含NAA、GLN和6-EII的加料流以400g/l補充葡萄糖，以向細胞提供充足的碳源補給，使得紫杉烷類生成的持續時間可得以延長。因此，額外持續培養16天。這時收穫培養物中的紫杉烷類，用建立的分析方法確定紫杉烷類的量。結果表明，與其中培養基成分的利用度可限制紫杉烷類生成的持續時間的批量模式培養相比，以分批補料模式補充額外的糖能夠延長該持續時間。此外，通過以分批補料模式少量添加補充糖，而不是一次突然性的加入全量，可以實現高紫杉烷類產量。以上描述了本發明的優選實施方案，連同許多可能的供選方案。然而這些實施方案只是作為舉例，本發明不受其限制。因此，實施例的結果可以適用於總體的紫杉屬物種，而不只限於紅豆杉。另外，實施例的條件，例如添加組分的濃度，不受限制。表A(1-氨基-2-苯乙基)膦酸(APEP)2_氟-6-碘苯曱酸(1-氨基-2-苯乙基)亞膦酸(APEPi)2-氟苯甲酸(3,5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸2-氟-p-丙氨酸(E)-2-氨基曱基-3-苯丙烯酸2-羥基-4，6-二曱氧基苯曱酸(S)-2-氨基氧-3-苯丙酸2-羥苯基氨基亞磺醯乙酸(S)-4-硝基-苯丙氨酸1，1-二曱酯(OH—PAS)(S)-a-氨基氧-p-苯丙酸2-碘苯甲酸l-氨基-3'，4'-二氯千基膦酸2-曱氧基肉桂酸l-氨基-3-苯丙基膦酸2-萘曱酸1-氨基苯並三唑2-硝基肉桂酸l-氨基苄基膦酸3-(2-羥苯基)丙酸2，3，4,5-四氟苯曱酸3-(3,4-亞甲二氧基苯基)丙酸2,3,5-三氯苯曱酸3-(3-氟-4-曱氧基苯甲醯基)丙酸2,3,5-三碘苯甲酸3-(3-甲氧基苯基)-p-丙氨酸2,3，6-三氟苯曱酸3-(4-溴苯曱醯基)丙酸2,3-二氯苯甲酸3-(4-氯苯曱醯基)丙酸2，3-二氟苯曱酸3，4-(亞曱二氧基)-6-硝基-肉桂酸2,4，6-三氯苯曱酸3，4-(亞曱二氧基)肉桂酸2，4-羰基二苯甲酸3，4-二氯苯甲酸2,4-二氯苯氧乙酸3,4-二曱氧基-6-硝基肉桂酸2，4-二氯苯甲酸3,4-二曱氧基苯乙酸2,4-二氟苯曱酸3,4-亞曱二氧基苯曱酸2,4-二曱氧基苯曱酸3,4-亞曱二氧基苯乙酸2，5-二氯苯曱酸3,4-反式-二曱氧基肉桂酸2,5-二氟苯曱酸3，5-二氨基苯曱酸2，5-二曱氧基苯曱酸3-亞硝基苯曱酸2,6-二氯苯曱酸4-亞硝基苯曱酸2，6-二甲氧基-3-硝基苯曱酸亞硝基苯曱酸2,6-二曱氧基苯曱酸3，5-二溴苯曱酸2-氨基-2,5-二氯苯甲酸3，5-二氯-4-羥基苯曱酸2-氨基茚滿-2-膦酸(AIP)3,5-二氟苯曱酸2-氨基-茚-2-膦酸3,5-二甲氧基-4-羥基千基醯肼2-溴-5-曱氧基苯曱酸3，5-二曱氧基苯曱酸2-氯苯曱酸3-氨基苯曱醯胺3-氯苯甲酸3-苯曱醯基丙酸3-氟苯曱酸3-氯-4-羥基苯甲酸3-碘苯曱酸+/--2-氨基曱基-3-苯丙酸3-硝基苯曱酸溴苯甲酸3-硝基肉桂酸咖啡酸4-氨基苯曱酸苄氧羰基-p-丙氨酸4-(二曱氨基)肉桂酸氯原酸4-(羥苯基)丙酮酸肉桂酸4-氨基-DL-苯丙氨酸肉桂腈4-氟-(l-氨基-2-苯乙基)膦酸肉桂醇4-氟-2-(三氟甲基)笨曱酸Cinnamyledeneacetophenone4-氟苯曱酸肉桂叉丙二酸可選擇的苯曱醯基CoA底物Co"(鈷)鹽4-氟肉桂酸香豆酸4-氟-D-笨丙氨酸Cu"(銅)鹽4-氟-L-苯丙氨酸二乙基二硫代氨基曱酸(Na)4-羥基苯曱酸二氬咖啡酸4-羥基肉桂酸二硫蘇糖醇4-碘笨曱酸DL-3,4-二羥基笨丙氨酸4-碘苯氧乙酸DL-3-氨基丁酸4-甲氧基苯曱酸DL-3-氟苯丙氨酸4-曱氧基肉桂酸DL-門冬氨酸4-硝基肉桂醛4-硝基肉桂酸5-氟-2-甲基苯曱酸5-硝基-2-(3-笨丙氨基)-苯曱酸6-氟-2-羥基苯曱酸6-曱氧基-2-苯並噁唑啉含Ag的化合物或絡合物a-氨基氧乙酸(AOA)草酸銨苯曱酸笨甲跣氯肉桂酸卡酯p-(2-羥基-3-甲苯基)丙氨酸p-(2-羥基-5-曱苯基)丙氨酸卩-氯乙基三甲銨P-苯基-DL-絲氨酸P-苯乙基丙氨酸L-jJ-高-苯丙氨酸LiCl(氯化鋰)L-苯丙氨酸-2-萘醯胺L-苯丙氨酸-對硝基苯胺L-酪氨酸千酯丙二酸衍生物MDCA(3，4_亞甲二氧基肉桂酸)苯甲酸曱酯Mg2+(鎂)間甲基肉桂酸茉莉酸曱酯DL-鄰氯苯丙氨酸DL-對氯苯丙氨酸苯甲酸乙酯3-硝基肉桂酸乙酯乙基-4-硝基肉桂酸阿魏酸煙麴黴毒素沒食子酸甘氨醯-p-丙氨酸甘氨醯-L-苯丙氨酸草甘膦含Hg^(汞)的鹽或化合物羥胺異煙酸酯茉莉酸和衍生物山柰酚D(+)-l-氨基-2-苯乙基膦酸L-3,4-二輕基苯丙氨酸L-a-氨基氧-p-苯丙酸(A0PP)L-a-氨基氧苯丙酸鑭鄰二氮菲鄰磺基苯曱酸對-氨基苯甲酸對-氨基-L-苯丙氨酸對-氯苯曱酸汞對-香豆酸噴司他丁N-(2-羥基-3-曱氧基-5-硝基苯亞曱基)p-丙氨酸對-氟-DL-笨丙氨酸N-U-羥乙基)-p-丙氨酸對-氟-D-苯丙氨酸N-(3,4，5，6-四氫-2H-氮雜革-7-基)-p-丙氨酸苯乙酸和類似物n-(4-氯苯基)-N-曱苯磺醯基-p-丙氨酸苯肼N-("pL-穀氨醯基)笨丙氨酸N,N-二環己基碳二亞胺N,N-二甲基-L-苯丙氨酸N-乙醯基-咪唑n-乙醯基-1-門冬氨酸n-乙醯基-L-苯丙氨酸N'-苯甲醯基-p-丙氨酸曱酯N-肉桂醯基哌。秦N-環己基-p-丙氨酸含Ni"(鎳)的鹽或化合物煙酸鹽硝基肉桂醯醇N-馬來醯基-p-丙氨酸苯乳酸苯丙炔酸苯丙酸苯基丙酮酸對-羥基苯曱酸對-羥基苯曱酸汞鄰吡。定甲酸酯對-碘-苯丙氨酸對-苯甲酸汞對-氨磺醯基苯曱酸對位-取代的笨甲酸水楊酸氨基脲N-丙基-4-penenoicacid(VPA(丙戊酸)的代謝產物)硝酸銀或其它銀鹽0-苄基羥胺(0B-HA)鄰-氯肉桂酸鄰-羥基肉桂酸鄰-甲基肉桂酸硫代硫酸銀亞精胺(Spd3+)精胺(Spm")笨甲醯碌胺t-肉桂酸鹽tetcyclacis硫代苯甲酸反式-2，4-二曱氧基肉桂酸反式-3，4-二氟肉桂酸反式-香豆酸反式-肉桂酸曱酯香草酸Zn2+(鋅)表B:培養基A和培養基B的組成tableseeoriginaldocumentpage3333權利要求1.通過在營養培養基中懸浮培養紫杉屬細胞生成紫杉烷類的方法，改進在於其中將茚滿醯胺基酸加到營養培養基中。2.權利要求1的方法，其中，茚滿醯胺基酸在分批補料加料流中提供。3.權利要求2的方法，其中，在補充的碳源包括在加料流中之前，懸浮培養基中的碳源被部分消耗。4.權利要求1的方法，其中，茚滿醯胺基酸以相對於不存在茚滿醯胺基酸時生成的比率有效改變通過培養生成的紫杉烷類之間的比率的量加到營養培養基中。5.權利要求1的方法，其中，茚滿醯胺基酸以相對於不存在茚滿醯胺基酸時生成的量有效地選擇性增加漿果赤黴素III的量加到營養培養基中。6.權利要求l的方法，其中，茚滿醯胺基酸是6-取代的茚滿醯胺基酸。7.權利要求l的方法，其中，茚滿醯胺基酸選自6-乙基茚滿醯異亮氨酸(6-EII)、6-溴代茚滿醯異亮氨酸(6-BII)和1-氧代-茚滿-羧基-a)-異亮氨酸-曱酯醯胺(l-OII)。8.權利要求l的方法，其中，營養培養基包含至少一種增強劑和/或抑制劑。9.權利要求1的方法，其中，營養培養基包含植物生長素，有植物生長素樣生長調節活性的化合物，或這兩者。10.權利要求1的方法，其中，營養培養基包含銀離子、銀化合物、銀絡合物或其混合物。11.權利要求l的方法，其中，茚滿醯胺基酸以相對於銀毒性具有保護性的量提供。12.根據權利要求l的方法，其中，營養培養基包含苯丙烷類代謝的抑制劑。13.根據權利要求12的方法，其中，抑制劑是含亞曱二氧基基團的化合物。14.根據權利要求13的方法，其中，化合物是3，4-亞甲二氧基肉桂酸、亞甲二氧基硝基肉桂酸、亞曱二氧基苯丙酸或3，4-亞甲二氧基苯乙酸。15.權利要求l的方法，其中，營養培養基進一步包含胺基酸。16.根據權利要求15的方法，其中，胺基酸是穀氨醯胺。17.包含茚滿醯胺基酸的植物細胞培養營養培養基。18.權利要求17的培養基，其中，茚滿醯胺基酸以相對於不存在茚滿醯胺基酸時生成的比率有效改變培養基中培養的細胞生成的紫杉烷類之間的比率的量加到培養基中。19.權利要求17的培養基，其中，茚滿醯胺基酸以相對於不存在茚滿醯胺基酸時生成的量有效地選擇性增加漿果赤黴素III的量加到培養基中。20.權利要求17的培養基，其中，茚滿醯胺基酸選自6-乙基茚滿醯異亮氨酸(6-EI1)、6-溴代茚滿醯異亮氨酸(6-BII)和l-氧代-茚滿-羧基-(L)-異亮氨酸-曱酯醯胺(1-0II)。21.權利要求17的培養基，其中，培養基包含至少一種增強劑和/或抑制劑。22.權利要求17的培養基，其中，培養基包含植物生長素，有植物生長素樣生長調節活性的化合物，或這兩者。23.權利要求17的培養基，其中，培養基包含銀離子、銀化合物、銀絡合物或其混合物。24.權利要求17的培養基，其中，茚滿醯胺基酸以相對於銀毒性具有保護性的量提供。25.權利要求17的培養基，其中，培養基包含苯丙烷類代謝的抑制劑。26.權利要求25的培養基，其中，抑制劑是含亞甲二氧基基團的化合物。27.權利要求26的培養基，其中，化合物是3，4-亞甲二氧基肉桂酸、亞曱二氧基硝基肉桂酸、亞甲二氧基苯丙酸或3，4-亞曱二氧基苯乙酸。28.權利要求17的培養基，其中，培養基進一步包含胺基酸。29.權利要求28的培養基，其中，胺基酸是穀氨醯胺。專利摘要本發明涉及在包含茚滿醯胺基酸的營養培養基中通過培養紫杉屬懸浮細胞生產紫杉烷類的方法。茚滿醯胺基酸可在培養的任何時刻以批量模式加入或在加料流中加入。特別地，已經發現合成化合物6-乙基-茚滿醯-異亮氨酸、6-溴代茚滿醯異亮氨酸和1-氧代-茚滿-羧基-(L)-異亮氨酸-甲酯醯胺(1-OII)能增加紫杉屬細胞培養物中的紫杉烷類生成。文檔編號C12P17/02GKCN101421392SQ200580008687公開日2009年4月29日申請日期2005年2月14日發明者B·羅奇,H·黑肯米勒,J·奧爾福德,V·斯裡尼瓦桑申請人:菲託生物技術公司導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan