在轉化的酵母細胞中生產蛋白質的方法
2023-06-10 12:18:16
專利名稱：在轉化的酵母細胞中生產蛋白質的方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質在轉化的酵母細胞中的表達、DNA構建體和用於該過程的載體以及用該載體轉化的酵母細胞。
上述方法的共有特性在於酵母生產質粒含有用於抗生素標記的基因。這樣的標記基因是由大腸桿菌中的起始克隆步驟產生的，其中將它用於篩選轉化的細胞或維持用作載體的質粒。據認為所述的抗生素標記基因對轉化的酵母細胞的培養沒有任何不良影響，因此通常的做法是不採取任何步驟來缺失這樣的DNA。此外，通常通過從所述轉化的酵母細胞中分離質粒並將分離的質粒轉化入大腸桿菌、隨後進行抗生素選擇來進行質粒構建體的表徵。因此，它適合於保持抗生素抗性標記基因的實際目的。
儘管研究實驗室和工業化生產工廠都受到極為嚴格的安全性管理制度的控制，但是仍然存在小的危害，即少量細胞將偶然被釋放到環境中。由於它們極為複雜的特性，這類基因工程微生物僅能存活極短的期限並且對環境的危害程度極低。這當然就是為什麼已經批准這類轉化的微生物可用於研究和大規模操作的原因。
儘管細胞快速死亡，但是含有抗生素抗性基因的質粒仍然可能偶然被處理到環境中，且如果質粒自然被吸收，那麼在理論上存在細菌中引入了抗生素耐受性的危害。
抗生素對於治療人和動物細菌感染來說是極為重要的。如果可能，應將使用使抗生素產生耐受性的基因導致的任何潛在環境汙染的危害降到最低限度。
因此，對開發甚至比迄今為止所用方法更為安全的方法存在一種需求且本發明的目的就是提供這類改進的方法。
本發明的一個方面涉及一種重組酵母表達載體，它不能夠使細菌細胞產生抗生素抗性並且包括編碼異源蛋白質的基因和已經通過體外修飾而成為非功能性的抗生素抗性標記基因。
本發明的另一方面涉及一種用於生產所需多肽或蛋白質的方法，所述的方法包括培養一種酵母菌株和從培養基中分離所需產物的步驟，其中所述的酵母菌株含有不能夠使細菌細胞產生抗生素抗性並且包括編碼異源蛋白質的基因和抗生素抗性標記基因，該標記基因已經在轉化酵母宿主前通過體外修飾而成為非功能性的。
本發明的方法一般包括培養一種酵母菌株的步驟，所述的酵母菌株含有一種酵母表達質粒，在該質粒中，用於細菌中起始克隆步驟的功能性抗生素標記基因已經在插入用於表達和分泌所需多肽或蛋白質的酵母宿主前通過體外缺失部分標記基因或整個標記基因而成為非功能性的。
抗生素標記基因的缺失優選通過在抗生素抗性標記基因的每一側上插入合適的限制切割位點來進行，由此通過用合適的限制酶的體外處理而使所述的標記基因缺失。
本發明還涉及轉化的酵母菌株，它含有不能夠使細菌細胞產生抗生素抗性的載體並含有編碼異源蛋白質的基因和已經在轉化酵母宿主前通過體外修飾而使抗生素抗性標記基因成為非功能性的。
酵母菌株優選是酵母屬的菌株，且特別是優選釀酒酵母菌株。
本文所用的措詞「抗生素標記基因」或「抗生素抗性標記基因」指的是允許對轉化的細菌細胞進行表型選擇和質粒擴增的基因。
在大腸桿菌中最常用的抗生素抗性標記基因是使氨苄西林(AMP)、氯黴素、新黴素、卡那黴素和四環素產生耐受性的標記基因。
本文所用的措詞「非功能性標記基因」指的是標記基因已經缺失或通過缺失部分基因而成為非功能性的。優選所述的基因是完全缺失的。
本文所用的「體外修飾」指的是在細胞環境外的載體上進行的修飾步驟。
本文所用的「不能夠使細菌細胞產生抗生素抗性」指的是抗生素抗性基因由於所述的基因操作而在任何生物體中是非功能性的。
本文所用的「酵母宿主」指的是欲用表達質粒或載體轉化或轉染的酵母生物體。
發明詳述通過使用可得到的限制位點或通過使用PCR引入合適的限制位點、位點特異性誘變或其它眾所周知的用於操作DNA序列的技術、隨後用合適的限制酶處理來進行抗生素抗性標記基因的體外缺失。
構建了4種修飾的NN729菌株以評估質粒中的各種缺失是否會影響長期發酵過程中的胰島素前體發酵產率或菌株穩定性(表Ⅰ)。比較了菌株與原始NN729菌株的發酵產率和發酵穩定性(表Ⅱ)。此外，構建了3種修飾的產生GLP-1變體Arg34GLP-1(7-37)的酵母菌株以評估含有AMP基因的質粒pKV228中的各種缺失是否會影響Arg34GLP-1(7-37)的發酵產率(表Ⅲ)。
將AMP基因和可能的周邊序列已經缺失的質粒和菌株均命名為「ΔAMP」。
通過轉化pAK729或pKV228修飾的質粒至釀酒酵母菌株MT663(E2-7B XE11-36a/α,ΔtpiΔtpi,pep4-3/pep4-3)或ME1719(MATa/αΔyap3::ura3/Δyap3::URA3pep4-3/pep4-3Δtpi::LEU2/Δtpi::LEU2 leu2/leu2 Δura3/Δura3)製備了修飾的酵母菌株，在所述的修飾的質粒中，AMP標記基因和來自原始質粒的可能的其它DNA序列已經缺失。
通過使用已經存在於質粒中的合適限制酶位點或通過以AMP基因可以被缺失的方式插入合適的限制酶位點製備了修飾的質粒。在以AMP基因被缺失或使AMP基因成為非功能性的這樣的方式轉化至釀酒酵母(菌株MT663)前可以在體外操作修飾的質粒且由此所得的酵母菌株缺乏AMP基因。因此，在處理酵母細胞的過程中由AMP基因產生的對環境的汙染的潛在危險得以消除。
將修飾的pAK729或pKV228質粒用合適的限制酶消化、進行瓊脂糖凝膠電泳、分離、再連接且隨後分別轉化至感受態MY663和感受態ME1719 WO98/01535的釀酒酵母細胞。
由本發明方法生產的蛋白質或多肽可以是任意的可以有利地在酵母細胞中生產的異源蛋白質或多肽。這類蛋白質的實例是抑酶肽、組織因子途徑抑制劑或其它蛋白酶抑制劑、胰島素、胰島素前體或胰島素類似物、胰島素樣生長因子Ⅰ或Ⅱ、人或牛生長激素、白細胞介素、組織纖溶酶原激活物、轉化生長因子a或b、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽1(GLP-1)、胰高血糖素樣肽2(GLP-2)、GRPP、因子Ⅶ、因子Ⅷ、因子XⅢ、血小板衍生的生長因子和酶類諸如脂酶類。
所謂「胰島素前體」或「胰島素類似物前體」可以理解為單鏈多肽，包括胰島素原，可以將它通過一種或多種隨後進行的化學和/或酶促反應而轉化成具有如在天然人胰島素中發現的3個二硫橋的正確構象的雙鏈胰島素或胰島素類似物分子。所述的胰島素前體一般含有橋連胰島素A與B鏈的修飾的C-肽。此外，優選的胰島素前體缺乏B(30)胺基酸殘基。最優選的胰島素前體是在例如EP163529和PCT申請95/00550以及95/07931中所述的那些胰島素前體。胰島素的實例是人胰島素、優選脫(B30)人胰島素和豬胰島素。優選的胰島素類似物是一個或多個天然胺基酸殘基、優選一個、兩個或三個胺基酸殘基已經被另一種可編碼的胺基酸殘基所取代的這樣的胰島素類似物。因此，在親代胰島素的A21位上可以帶有一種選自於包括Ala、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val在內的組的胺基酸殘基，特別是選自於包括Gly、Ala、Ser、和Thr在內的組的胺基酸殘基來代替Asn。同樣，在親代胰島素的B28位上可以帶有一種選自於包括Asp、Lys等在內的組的胺基酸殘基來代替Pro；而在親代胰島素的B29位上可以帶有胺基酸Pro來代替Lys。
本文所用的措詞「可編碼的胺基酸殘基」表示可以通過遺傳密碼即核苷酸的三聯體(「密碼子」)編碼的胺基酸殘基。
通過已經確立的標準方法，例如由S.L.Beaucage和M.H.Caruthers在《四面體通訊》(Tetrahedron Letters)22,1981,pp.1859-1869中所述的亞磷醯胺法或由Matthes等在《歐洲分子生物學協會雜誌》(EMBO Journal)3,1984,pp.801-805中所述的方法可以製備DNA構建體。根據亞磷醯胺法，例如在自動DNA合成儀中合成寡核苷酸、將它們純化、形成雙鏈並連接以形成合成的DNA構建體。目前優選的製備DNA構建體的方式是通過聚合酶鏈反應(PCR)，例如如Sambrook等在《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning:ALaboratory Manual),Cold Spring Harbor,NY,1989中所述。
編碼所需蛋白質的DNA還可以來源於基因組或cDNA，例如按照標準技術(參見Sambrook等在《分子克隆實驗室手冊》(MolecularCloning:A LaboratoryManual),Cold Spring Harbor,1989)通過製備基因組或cDNA文庫並經使用合成寡核苷酸探針的雜交法篩選編碼本發明全部或部分多肽的DNA序列來獲得。
最後，編碼所需蛋白質的DNA可以來源於通過按照標準技術使合成的、基因組的或cDNA來源的(如果合適)的片段退火製備的合成與基因組的混合型、合成與cDNA的混合型或基因組與cDNA的混合型，所述的片段符合完整DNA構建體的不同部分。
重組表達載體可以是自主複製載體，即作為染色體外本體存在的載體，例如質粒、染色體外因子、微型染色體或人工染色體，其複製與染色體的複製無關。該載體可以含有確保自複製的任意形式。另一方面，當將該載體引入宿主細胞時，它可以是一種整合入基因組並與所整合入的染色體共同複製的載體。載體系統可以是單一載體或質粒或兩種或多種共同含有將被引入宿主細胞基因組的總DNA或轉座子的載體或質粒。
重組表達載體可能會含有編碼可操作地與合適的啟動子序列連接的所需蛋白質或多肽的DNA序列。所述的啟動子可以是在酵母中具有轉錄活性的任意DNA序列並可以來源於編碼與酵母同源或異源的蛋白質的基因。該啟動子優選來源於編碼與酵母同源的蛋白質的基因。合適的啟動子的實例是釀酒酵母Mal、TPI、ADH或PGK啟動子。
編碼所需蛋白質或多肽的DNA序列還可以可操作地與合適的終止子連接，例如TPI終止子(參見T.Alber和G.Kawasaki，《實用分子遺傳學雜誌》(J.Mol.Appl.Genet.)1,1982,pp.419-434)。
本發明的重組表達載體還包含使載體能夠在酵母中複製的DNA序列。這類序列的實例是酵母質粒2μ複製基因REP1-3和複製起點。所述載體還可以包含選擇性標記，例如由P.R.Russell在《基因》(Gene)40,1985,pp.125-130中所述的粟酒裂殖酵母TPI基因。
最後，表達載體優選含有信號/前導序列以便確保所需蛋白質或多肽分泌入培養基。信號序列是編碼多肽(「分泌肽」)的DNA序列，所編碼的多肽作為一種較大多肽的成分可指導較大多肽通過合成它的細胞的分泌途徑。通常將較大多肽裂解以便在通過分泌途徑轉運的過程中除去分泌肽。
分泌信號序列可以編碼確保有效指導所表達的多肽進入細胞分泌途徑的任意信號肽。所述的信號肽可以是天然存在的信號肽或其功能部分或它可以是一種合成肽。用於酵母宿主細胞的信號肽類獲自釀酒酵母a-因子和釀酒酵母轉化酶的基因、小鼠唾液澱粉酶的信號肽(參見O.Hagenbuchle等《自然》(Nature)289,1981,pp.643-646)、修飾的羧肽酶信號肽(參見L.A.Valls等《細胞》(Cell)48,1987,pp.887-897)、酵母BAR1信號肽(參見WO87/02670)或酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信號肽(參見M.Egel-Mitani等《酵母》(Yeast)6,1990,pp.127-137)。
為了在酵母中進行有效分泌，編碼前導肽的序列也可以被插入信號序列的下遊和編碼該多肽的DNA序列的上遊。前導序列的功能是使得所表達的多肽從內質網定向於高爾基體並進一步定向於分泌小泡以便分泌入培養基(即多肽穿過細胞壁或至少通過細胞膜排入酵母細胞的壁膜間隙)。前導肽可以是酵母a-因子的前導區(其應用在例如美國專利4,546,082、EP16 201、EP123 294、EP123 544和EP163 529中描述)。另一方面，前導肽可以是一種合成的前導肽，它是一種未在自然界被發現的前導肽。可以如WO89/02463或WO92/11378中所述和由Kjeldsen等在「蛋白質的表達和純化」(「Protein Expressionand Purification」)9,331-336(1997)中所述構建前導肽類。
可以將措詞「前導肽」理解為表示前肽序列形式的肽，所述的前肽序列的功能是使得所分泌的異源蛋白質從內質網定向於高爾基體並進一步定向於分泌小泡以便分泌入培養基，(即所表達的蛋白質或多肽穿過細胞膜和細胞壁(如果存在)或至少通過細胞膜排入具有細胞壁的細胞的壁膜間隙)。
用於分別連接編碼所需蛋白質或多肽的DNA序列、啟動子和終止子以及將它們插入含有酵母複製所必需的信息的合適的酵母載體的步驟對於本領域技術人員來說是眾所周知的(參見例如Sambrook等，在所引用的文獻中所述)。應該理解的是可以通過首先製備含有編碼本發明多肽的完整DNA序列的DNA構建體且隨後將該片段插入合適的表達載體或通過順序插入含有用於各元件(諸如信號、前導區或異源蛋白質)的遺傳信息的DNA片段、隨後連接可以構建所述的載體。
用於本發明方法的酵母生物體可以是任意合適的酵母生物體，在培養時它們產生令人滿意數量的所需蛋白質或多肽。合適的酵母生物體的實例可以選自下列酵母菌種的菌株釀酒酵母、克魯弗酵母、粟酒裂殖酵母、葡萄汁酵母、乳酸克魯維酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、Pichia methanolica、克魯弗畢赤酵母、Yarrowialipolytica、假絲酵母屬的菌種、可可假絲酵母、地黴屬的菌種和Geotrichum fermentans；優選的酵母菌種是釀酒酵母。
例如，通過原生質體形成、隨後以本身已知的方式轉化可以實現酵母細胞的轉化。用於培養所述細胞的培養基可以是任意適合於使酵母生物體生長的常規的培養基。可以通過常規步驟從培養基中回收以正確加工形式和顯著的比例存在於培養基中的分泌的異源蛋白質，所述的常規步驟包括通過離心或過濾從培養基中分離酵母細胞，藉助於一種鹽，例如硫酸銨沉澱上清液或濾液中的蛋白質成分，隨後通過各種色譜程序，例如離子交換色譜法、親和色譜法等進行純化。當所述的蛋白質分泌至壁膜間隙時，通過酶促方式或機械方式使細胞破裂。
可以將所需的蛋白質或多肽表達和分泌為如WO97/22706中所述的N-末端延伸的融合蛋白。然後可以通過本領域中眾所周知的化學或酶促裂解在體外從回收的蛋白質中除去N-末端延伸的部分。優選使用酶進行裂解。這類酶的實例是胰蛋白酶或水解無色桿菌蛋白酶Ⅰ。
在下列實施例中更詳細地描述本發明，這些實施例不以任何方式來限制所要求保護的本發明的範圍。
將pAK729質粒用ApaLⅠ限制酶消化、進行瓊脂糖凝膠電泳、分離、重新連接且隨後轉化至感受態釀酒酵母細胞(MT663，參見EPBO163529)以便得到轉化的酵母菌株NN729.1-ΔAMP。從酵母菌株NN729.1-ΔAMP中重新分離修飾的表達質粒並在PCR發生後檢驗DNA序列，隨後亞克隆以缺失為特徵的DNA區。同樣，在從酵母菌株NN729.1-ΔAMP中重新分離的質粒DNA上檢驗編碼胰島素前體的DNA序列。
在30℃下，在YPD培養基中將酵母菌株NN729.1-ΔAMP培養72小時。通過RP-HPLC測定胰島素前體的發酵產率。
將質粒pAK729.5用XhoⅠ限制酶消化、進行瓊脂糖凝膠電泳、分離、重新連接且隨後轉化至感受態釀酒酵母細胞，從而得到酵母轉化體NN729.5-ΔAMP。從酵母菌株NN729.5-ΔAMP中重新分離修飾的表達質粒並在PCR發生後檢驗DNA序列，隨後亞克隆以缺失為特徵的DNA區。同樣，在從酵母菌株NN729.5-ΔAMP中重新分離的質粒DNA上檢驗編碼胰島素前體的DNA序列。就破壞β-內醯胺酶活性而言，結果是pAK729.5-ΔAMP中44個核苷酸的缺失與AMP基因的完全缺失同樣有效。
在30℃下，在YPD培養基中將酵母菌株NN729.5-ΔAMP培養72小時。通過RP-HPLC測定胰島素前體的發酵產率。
將pAK729.6質粒用DNA限制酶AatⅡ消化、進行瓊脂糖凝膠電泳、分離、重新連接且隨後轉化至感受態MT663釀酒酵母細胞。從酵母菌株NN729.6-ΔAMP中重新分離修飾的表達質粒並在PCR發生後檢驗DNA序列，隨後亞克隆以缺失為特徵的DNA區。同樣，在從酵母菌株NN729.6-ΔAMP中重新分離的質粒DNA上檢驗編碼胰島素前體的DNA序列。缺乏AMP基因的質粒NN729.6-ΔAMP如附圖
4中所示。
在30℃下，在YPD培養基中將酵母菌株NN729.6-ΔAMP培養72小時。通過RP-HPLC測定胰島素前體的發酵產率。實施例4通過PCR將pAK729.7質粒中的新酶的限制位點AatⅡ(3801)引入原始pAK729質粒。隨後檢驗pAK729.7質粒的選擇的DNA序列。在pAK729.7中，限制酶位點AatⅡ(3801)和AatⅡ(5978)之間的DNA片段可以被缺失，從而從該表達質粒中除去了2177個核苷酸。將pAK729.7質粒設計成AMP基因和大腸桿菌複製起點均可以被缺失。pAK729.7的限制質粒圖譜如附圖5中所示。
將pAK729.7質粒用DNA限制酶AatⅡ消化、進行瓊脂糖凝膠電泳、分離、重新連接且隨後轉化至感受態MT663釀酒酵母細胞。從酵母菌株NN729.7-ΔAMP中重新分離修飾的表達質粒並在PCR發生後檢驗DNA序列，隨後亞克隆以缺失為特徵的DNA區。同樣，在從酵母菌株NN729.7-ΔAMP中重新分離的質粒DNA上檢驗編碼胰島素前體的DNA序列。在30℃下，在YPD培養基中將酵母菌株NN729.7-ΔAMP培養72小時。通過RP-HPLC測定胰島素前體的發酵產率。
表Ⅰ以帶有非功能性或缺失的AMP基因的pAK729質粒為基礎的NN729菌株的概要
將新的NN729-ΔAMP菌株與原始的NN729菌株的胰島素前體的發酵產率進行了比較(表Ⅱ)。
表Ⅱ用帶有非功能性或缺失的AMP基因的質粒轉化的NN729-ΔAMP菌株的發酵產率
從上述結果中可以看出包括部分或完全缺失AMP標記基因的表達質粒的酵母菌株表達的胰島素前體比包括含有AMP基因的表達質粒的原始酵母菌株表達的胰島素前體多10-20％。
用對NN729.1(實施例1)、NN729.5(實施例2)和NN729.6(實施例3)所述的AMP抗性基因破壞法構建了三種Arg34GLP-1(7-37)表達質粒且隨後將它們轉化至感受態ME1719(參見WO98/01535)釀酒酵母細胞，從而分別得到酵母轉化體YES2076、YES2079和YES2085。
已經用於表達Arg34GLP-1(7-37)的宿主菌株是一種二倍體菌株並且具有缺乏兩種天冬氨酸蛋白酶的表型，所述的天冬氨酸蛋白酶即(1)裂解一元或二元胺基酸殘基C-末端的酵母天冬氨醯蛋白酶3(YAP3)(Egel-Mitani等《酵母》(YEAST)6:127-137,1990)和(2)導致其它蛋白酶諸如蛋白酶B、羧肽酶Y、氨肽酶I、RNA酶、鹼性磷酸酶、酸性海藻糖酶和聚磷酸外切酶活化的液泡蛋白酶A。此外，丙糖磷酸異構酶基因(TPI)已經被破壞，其表型使得在生長於含有葡萄糖的培養基上的轉化體中利用葡萄糖成為可能。ME1719的遺傳背景是MATa/aDyap3::ura3/Dyap3::URA3 pep4-3/pep4-3 tpi::LEU2/Dtpi::LEU2 leu2/leu2 Dura3/Dura3。
從酵母菌株中重新分離修飾的表達質粒pKV301、pKV307和pKV304並在PCR發生後檢驗DNA序列，隨後亞克隆以缺失為特徵的DNA區。同樣，在從所述的酵母菌株中重新分離的質粒DNA上檢驗編碼Arg34GLP-1(7-37)的DNA序列。表Ⅲ顯示了修飾的與未修飾的菌株的比較結果。
表Ⅲ以帶有用於表達Arg34GLP-1(7-37)的非功能性或缺失的AMP抗性基因的質粒為基礎的YES菌株的概要
在30℃下，比較YPD中進行72小時的5ml實驗室規模的發酵的產率。使用HPLC估計產率。
權利要求
1．不能夠使細菌細胞產生抗生素抗性的重組酵母表達載體，所述的載體包括編碼異源蛋白質的基因和已經通過體外修飾而成為非功能性的抗生素抗性標記基因。
2．根據權利要求1所述的重組酵母表達載體，其中所述的抗生素標記基因是AMP基因。
3．用於生產所需多肽或蛋白質的方法，該方法包括在合適的條件下培養含有權利要求1-2所述載體的酵母菌株並從培養基中分離所需產物的步驟。
4．用於生產所需多肽或蛋白質的方法，該方法包括在合適的條件下培養含有酵母表達質粒的酵母菌株的步驟，在所述的質粒中，在插入酵母宿主前已經通過體外缺失部分標記基因或整個標記基因而使用於細菌中起始克隆步驟的功能性抗生素標記基因成為非功能性的。
5．根據權利要求4所述的方法，包括在抗生素抗性標記基因周圍插入合適的限制位點並通過用合適的限制酶進行的體外處理而使所述標記基因缺失的步驟。
6．根據權利要求3-5所述的方法，其中所述的酵母菌株是酵母屬的菌株，優選釀酒酵母菌株。
7．含有權利要求1-2所述載體的轉化酵母細胞。
8．根據權利要求7所述的轉化酵母菌株，它是一種酵母屬的菌株，優選釀酒酵母菌株。
全文摘要
本發明涉及一種用於在酵母中表達異源蛋白質或多肽的方法,該方法通過培養一種不含功能性抗生素抗性標記基因的轉化酵母菌株來進行。
文檔編號C12P21/00GK1309712SQ9980870
公開日2001年8月22日 申請日期1999年7月2日 優先權日1998年7月16日
發明者T·傑爾德森, K·瓦德 申請人:諾沃挪第克公司