使用泛dr結合肽改變免疫應答的製作方法

2023-06-10 22:05:46

專利名稱：使用泛dr結合肽改變免疫應答的製作方法
背景技術：
本發明是1993年9月14日申請的尚未授權的美國專利申請No.08/121,101的部分繼續申請，上述申請在此被引作參考。
本發明涉及用於防止、治療或診斷如自身免疫疾病、病毒病和癌症等病理狀態的組合物和方法。尤其是，它提供了能夠與特定的主組織相容性複合體(MHC)分子結合併誘導或抑制某種免疫應答的新型肽。
MHC分子被分為I類或II類分子。II類MHC分子由如巨噬細胞、樹狀細胞或B細胞等特化的抗原提供細胞(APC)表達。II類MHC分子通常與由來自外部的APC進入內吞路徑的蛋白抗原被加工後產生的肽片段結合。然後，這些MHC-肽複合物被用以查找CD4＋T輔助細胞，後者由此被激活、增殖並擴增對被顯示出的免疫原性肽的免疫應答。T細胞的激活要求T細胞受體(TCR)被它的配體，一種一個MHC分子和一個肽抗原形成的雙分子複合體所結合(Shimonkevitz等，J.Immunol.133，2067-2074(1984)；Babbitt等，Nature 317，359-361(1985)；Buus，H.、Annu.Rev.Immunol.7，601-624)。
T細胞的不適當的激活是如自身免疫、同種移植排斥反應和過敏性應答等一系列免疫病理反應的原因之一。自身免疫病的實例有類風溼關節炎、多發性硬化和重症肌無力。涉及T細胞激活的過敏性應答有對各種花粉、塵蟎等的過敏。另外，外源感染疾病會導致免疫病理反應(如萊姆病、肝炎、LCMV、鏈球菌感染後的心內膜炎或腎小球性腎炎)。人們已將如腹腔疾病和Crohn病那類食物過敏以及其它過敏性疾病與特定的MHC等位基因相關聯或懷疑其具有自身免疫成分。
最常用的治療這些症狀的方法是抑制免疫系統，通常是靠使用免疫抑制藥物。已有人提出與病症相關的MHC等位基因為已知情況下另一的治療方法，它涉及對特定MHC等位基因的選擇性封閉。但是，當涉及一些MHC限制時，必須有除選擇性封閉以外的方法。
要求結合II類分子的肽的免疫化學研究已有開展。已經確定了幾種小鼠和人的II類MHC等位基因的結合序列，最近，通過對天然加工過的肽的測序來進行的各種II類類型的結合區分析也有所描述(Rudensky等，Nature353，622-627(1991)；Chicz等，Nature358，764-768(1992)；Hunt等，Science256，1817-1820(1992)；Rudensky等，Nature359，429-431(1992))。
尤其是DR分子，已發現(Brown等，Nature364，33-39(1993))，佔據MHC結合溝區一個相應的疏水穴的一個大疏水錨狀結構是肽-DR相互反應的關鍵決定因子。其它幾種錨結構也起著一定但較次要的作用，並幫助決定等位基因的特異性。最近，也有人Q強調肽分子C-末端半段的肽骨架直接以氫鍵與MHC結合溝區的璧結合(Krieger等，J.Immunol.146，2331-2340(1991)；O』Sullivan等，J.Immunol.146，1240-1246(1991)；O』Sullivan等，J.Im-munol.147，2663-2669(1991)；)。
雖然沿MHC等位基因產物的結合穴排列的等位基因特異性多型殘基傾向於賦予每個等位基因結合唯一一組肽的能力，但在許多情況中，一個特定肽被證明可與一個以上的MHC特異型結合。記載得最好的是人的DR同種型的例子，其中指出，幾個DR等位基因產物似乎能識別相似的結合區，而且，幾個研究者分別報導了多種DR類型情況中某些抗原決定基的變性結合和/或識別，從而產生了某些肽可能代表著「通用」抗原決定基的概念(Busch等、Int.Immunol.2，443-451(1990)；Panina-Bordignon等，Eur.J.Immunol.19，2237-2242(1989)；Sinigaglia等，Nature336，778-780(1988)；O』Sullivan等，J.Immunol.147，2663-2669(1991)；Roache等，J.Immunol.144，1849-1856(1991)；Hill等，J.Immunol.147，189-197(1991))。但是，雖然以前報導的幾種抗原決定基確實具有結合幾種DR等位基因產物的能力，它們決不是通用的。
所以，本發明提供了被稱為「泛DR結合肽」的DR結合肽，它們可以被多種DR等位基因產物識別。根據本發明，這類泛DR結合肽可被用作II類分子限定的T細胞的強免疫原，並可被用作有用的以肽為基礎的人用免疫抑制劑、疫苗或治療劑。
發明概述本發明提供了抑制或誘導病人體內T細胞活化的組合物和方法。這些方法包括服用治療有效量的藥物組合物，該組合物含某種藥用載體和約4至20殘基之間的肽，該肽可結合基本上被DR位點的所有等位基因編碼的MHC分子上的抗原結合位置。這些肽被歸為泛DR結合肽。泛DR結合肽可被用於抑制與免疫病理有關的免疫應答，如自身免疫、同種移植排斥反應和過敏性應答。
當被用於加強免疫應答時，泛DR肽可起到T輔助肽的作用並與CTL誘導肽一起服用。T輔助肽可與CTL誘導肽結合以形成抑制CTL/T輔助肽結合物。該結合物還可以進一步被修飾。例如，該結合肽可以被乙醯化、十六醯化或被某種脂肪酸醯化，或與載體結合。CTL肽也可以通過一間隔分子，如Ala-Ala-Ala與T輔助肽結合。或者，泛DR結合肽可被用於加強抗體應答。就CTL應答的誘導而言，泛DR肽可以與抗體誘導決定子結合或混合服用。
可用各種常規方法對泛DR肽進行描述。例如，優選的泛DR肽的結構式為R1-R2-R3-R4-R5，其方向為由肽的氨基端(R1)至肽的羧基端(R5)，其中R1是D-胺基酸，後面跟有一個丙氨酸或賴氨酸；R2是環己基丙氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸；R3是3或4個胺基酸，其中每個分別選自丙氨酸、異亮氨酸、絲氨酸和纈氨酸組；R4是蘇氨酸-亮氨酸-賴氨酸、賴氨酸-蘇氨酸或色氨酸-蘇氨酸-亮氨酸-賴氨酸這一組；R5由2至4個胺基酸構成，其後跟有一個D-胺基酸，2或4個胺基酸中的每一個分別選自丙氨酸、絲氨酸和纈氨酸這一組。根據這個結構式，更為優選的泛DR肽的結構式為R1-R2-R3-R4-R5，其中R1是D-丙氨酸，後面跟有一個丙氨酸或賴氨酸；R2是環己基丙氨酸、或苯丙氨酸；R3是3或4個胺基酸，其中每個分別選自丙氨酸、異亮氨酸和纈氨酸組；R4是蘇氨酸-亮氨酸-賴氨酸、賴氨酸-蘇氨酸或色氨酸-蘇氨酸-亮氨酸-賴氨酸；R5是2至4個丙氨酸，其後跟有一個D-丙氨酸。
對泛DR肽的描述還可以使用蛋白質中常見胺基酸的單字母密碼，並特別標示出D-胺基酸或非常見胺基酸。用這種常規法，本發明的優選泛DR肽包括如下這些oZXZZZKTZZZZo、oZXZZZZTLKZZo、oZXVZZZTLKZZo、oZXIZZZTLKZZo、oKXVZZWTLKZZo和oKFVZZWTLKZZo其中o是一個D-胺基酸，Z是丙氨酸、絲氨酸或纈氨酸，K是賴氨酸，T是蘇氨酸，L是亮氨酸，W是色氨酸，X是環己基丙氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸。最優選的泛DR肽有aAXAAAKTAAAAa、aAXAAAATLKAAa、aAX-VAAATLKAAa、aAXIAAATLKAAa、aKXVAAWTLKAAa和aKFVAAWTLKAAa其中的a是一個D-丙氨酸，A是丙氨酸，X是環己基丙氨酸，K是賴氨酸，T是蘇氨酸，L是亮氨酸，V是纈氨酸，I是異亮氨酸，W是色氨酸。
附圖簡述

圖1A-1F所示的是對12個不同供者中3個的代表性應答。所測試的人PBMC T細胞系產生的抗原特異性T細胞應答發生在加入肽965.10(實心方框)、906.09(空心方框)、760.50(實心園)或破傷風類毒素830-843(空心園)的當天，第14天(第二次刺激，圖1A、1B、1C)和第28天(第三次剌激，1D、1E、1F)。所示的是兩個各自獨立的試驗。
圖2A和2B所示的是人PBMC產生的抗原特異性T細胞應答的概括。圖2A顯示了第二次刺激的結果，圖2B顯示了第三次刺激的結果。所得的最大Δcpm標在縱坐標上。
圖3A-3F顯示了通過測定已接觸抗原的小鼠淋巴結T細胞的增殖能力來反映的各種肽抗原決定基的體內免疫原性。給C57BL/6J小鼠注射20μg/鼠(空心三角)、1μg/鼠(實心方框)、50ng/鼠(空心方框)、2.5ng/鼠(實心園)或0.125ng/鼠(空心園)的TT830-843(圖3A)、Ova323-336(圖3B)、HBVc128-140(圖3C)、965.10(圖3D)、1024.03(圖3E)和760.50(圖3F)。10天後，取出膿腫的淋巴結並如實施例9所示檢測T細胞的增殖。所表示的是二個獨立實驗的代表。
定義本文中的寡聚肽或肽指至少4個胺基酸或胺基酸類似物的鏈，以至少6個為佳，更好的是8至10個，有時是11至14個殘基，但通常少於30個殘基，更為通常的是少於約25個殘基，以少於15個為佳，如8至14個殘基。寡聚肽或肽的長度各異，可以是中性態的(不帶電)也可以是其鹽形式的，可以未經糖基化、側鏈氧化或磷酸化修飾，也可以含有上述修飾，只要修飾作用不損害在此所述的多肽的生物活性。
當提及某肽、寡聚肽或蛋白質中的胺基酸殘基時，「胺基酸殘基」、「胺基酸」和「殘基」被互換使用，在本文中指通過一個醯胺鍵或一個類醯胺鍵與至少一個其它胺基酸或胺基酸類似物共價連接的胺基酸或胺基酸類似物。
本文中，如不加限定，「胺基酸」指「L-胺基酸」或L-胺基酸類似物。
雖然肽中最好基本不含其它天然蛋白及其片段，但在有些實施例中可以通過合成將肽與天然片段或顆粒複合。生物活性指與某相當的MHC分子結合的能力，以及對用於刺激CTL應答的肽而言的誘導T輔助細胞應答然後由此輔助誘導抗某靶抗原或抗原類似物的CTL應答的能力。對肽類似物拮抗劑而言，如果它能與天然肽競爭與MHC分子的結合併由此大大降低天然肽刺激T細胞應答的能力，它就是具有生物活性的。
本發明的「泛DR結合肽」是指可以高親合力結合至少12個最常見DR等位基因(DR1、2w2b、2w2a、3、4w4、4w14、5、7、52a、52b、52c和53)產物中7個的肽。「高親合力」在此定義為結合時的IC50％小於300nM。
在本公開內容的全文中，以IC50值表示結果。設定試驗進行條件(即限定MHC分子和標記的肽的濃度)，這些值近似於KD值。應當注意，如果試驗條件變化，IC50值常會發生急劇的改變，它還取決於所用的具體試劑(如MHC製劑等)。例如，過高濃度的MHC將會增加某特定配體的測得的表觀IC50。
為避免不確定性，另一種表示結合數據的方法是表示為相對於某參照肽的相對值。在每次試驗中都包含參照肽。由於某個具體的試驗敏感性或高或低，待測肽的IC50會有所變化。但是，對參照肽的相對結合率不會變化。例如，在會令參照肽的IC50提高10倍的條件下進行的試驗中，待測肽的所有IC50也將變化約10倍。所以，為了避免不明確性，對某肽是好的、一般的、弱的或非結合肽的評定必須以它相對於標準肽的IC50的IC50為基礎。
如果某具體試驗中的標準肽的IC50與表1中所報導的不同，則應當認識到，必須通過某相應的因數校正用於評定好的、中等的、弱的或非結合肽的閾值。
表I
本發明的「CTL誘導肽」是源於潛在的靶抗原的特定抗原決定基區的肽，如腫瘤相關抗原，包括但不限於腎細胞癌、乳腺癌、癌胚抗原、黑色素瘤(MAGE-1)抗原、前列腺癌特異抗原、肝炎C抗原、埃-巴二氏病毒(EB病毒)抗原、HIV-1和HIV-2抗原和乳頭狀瘤病毒抗原。
「分離的」或「生物純的」指基本或完全不含可見於其天然態中的常伴成分的材料。所以，本發明的肽不含在原環境中常與它們締合的物質，如產抗原細胞上的MHCI類分子。即使某種蛋白已被分離成了一條均一的或主要條帶，其中仍有5-10％的隨所需蛋白共純化的痕量天然蛋白汙染。本發明的分離的肽不含這種內源共純化蛋白。
「T細胞克隆」指單個純淋巴細胞的子代，並可表達相同的免疫球蛋白或T細胞受體蛋白。本文中「純」淋巴細胞的定義與在此引作參考的Stites等，Basic and Clinical Immunology，第8版，PrenticeHall，Englewood Cliffs，New Jersey(1994)中所述的相同。
本文中的「T輔助肽」指可被T細胞受體或T輔助細胞識別的肽。本發明的T輔助肽即泛DR結合肽。
優選實施例的說明在一個實施例中，本發明涉及使用泛DR結合肽防止T輔助細胞的激活來阻斷免疫應答。因為它們的變性的II類分子結合能力，泛DR結合肽可作為治療劑被用於抑制與同種移植排斥反應、變應性應答或自身免疫有關的T細胞介導的反應。
或者，泛DR結合肽可用作各種疫苗製劑中的助劑成分來增強對施用的免疫原的免疫應答。例如，將泛DR結合肽與CTL誘導肽一同施用來誘導對例如病毒感染細胞的CTL應答。或者，將泛DR結合肽與CTL誘導肽複合後施用來誘導某種CTL應答。在另一個實施例中，泛DR結合肽與某種抗體誘導肽複合或混合。Her-vasStubbs等，Vaccine，12867-871(1994)中描述了使用輔助肽來增強抗體對特定的抗原決定基的應答的實例。
用於描述肽化合物的命名法遵循常規法則，每個胺基酸殘基的氨基在左(N-端)而羧基在右(C-端)。在胺基酸結構式中，每個殘基通常以標準的三字母或單字母表示法表示。胺基酸殘基的L-型由大寫的單字母或開頭大寫的三字母標記表示，而那些D-型胺基酸的D-型由小寫單字母或小寫的三字母標記表示。甘氨酸沒有不對稱碳，所以簡單地表示為「Gly」或G。
可用各種方法來製備本發明的肽。因為它們較短，可根據常規技術在溶液中或固體支持物上合成之。有市售的各種自動合成儀並可按已知方法進行使用。參見，例如，Stewart和Young，「固相的肽合成」，第2版，Pierce Chemical Co.(1984)，上述。
或者，可使用重組DNA技術，將編碼感興趣的免疫原性肽的一段核苷酸序列插入表達載體中，將此載體轉化或轉染合適的宿主細胞並在適於表達的條件下進行培養。這些步驟在本技術領域是公知的，Sambrook等的Molecular Cloning，A Laboratory Mannual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor Press，New York(1982)中有全面的描述，在此引作參考。所以，由一個或多個本發明肽序列的融合蛋白可被用於提供合適的T細胞抗原決定基。
由於編碼所期待的長度的肽的序列可以化學合成，例如Mat-teucci等，J.Am.Chem.Soc.，1033185(1981)中的磷酸三酯法，可方便地通過替換編碼天然肽序列的適當鹼基來進行修飾。由此可用合適的接頭將編碼序列連入本技術領域的常用表達載體，和將載體轉化進合適的載體來產生所需的融合蛋白。現在已有許多這樣的載體和合適的宿主系統。為了表達融合蛋白，編碼序列必須具有起始和終止密碼子，啟動子和終止子區，並常具有在所需的細胞宿主中進行表達的表達載體的複製系統。例如，在含有方便所需編碼序列插入的限制性位點的質粒中具有與細菌宿主相容的啟動子序列。所得的表達載體可被轉化入合適的細菌載體。當然，使用合適的載體和調控序列，也可使用酵母或哺乳動物細胞宿主。泛DR結合肽本發明提供了擴展某初始肽的特異性的用以鑑定其修飾作用的方法。例如，國際申請WO92/02543，在此引作參考，描述了適用於鑑定可結合DR分子的肽的方法。該申請描述了將得自流感病毒(「HA」)的血凝素作為與HLA-DR發生特異性反應的肽來源。對蛋白片段進行反應性篩選以提供可結合合適的DR分子，如DR1、DR4w4或DR4w14的序列。
一旦可結合特定MHC分子的抗原或其肽被鑑定出來，可利用如合成重疊肽和/或使N-末端或C-末端缺失(縮短)或增加法來測定該抗原或肽的「核心結合區」。在核心結合區和關鍵接觸殘基的測定中，可使用一系列單胺基酸被取代的肽來測定靜電荷、疏水性等對結合的影響。
在核心區內，「關鍵接觸位」，即對保留與MHC分子的結合及抑制其向T細胞的供給能力來說必須存在於肽中的那些殘基(或它們的功能對等物)，可利用單胺基酸取代、缺失或插入來鑑定。另外，還可以用某種特定胺基酸(如Ala)進行系統掃描以探察關鍵接觸殘基側鏈的作用。
對除關鍵接觸位外的以中性胺基酸進行的單個胺基酸取代較不敏感的本發明的肽被發現可耐受多取代作用。特別優選的多取代作用是小型、相對中性的部分，如Ala、Gly、Pro或類似殘基。取代物可以是均寡聚物或雜寡聚物。被取代或增加的殘基的數目和類型取決於關鍵接觸位點間的必需間隔和欲得到的某種官能特性(如疏水性對親水性)。
與母肽的親合性相比，通過這種取代作用還可能獲得提高的對MHC分子的結合親和性。無論如何，這種「間隔」取代作用選用的胺基酸殘基或其它分子片段必須避免可能導致會破壞結合的例如立體和電荷幹擾。
也可以用D-胺基酸來探察單胺基酸取代作用的影響。可利用熟知的如Merrifield，Science，232341-347(1986)，Barany和Mer-rifield，「肽」，Gross and Meienhofer編，(N.Y.，Academic Press)，pp.1-284(1979)；和Stewart和Young，「固相的肽合成」，(Rockfo-erd，I11.，Pierce)，第2版(1984)中描述的肽合成法來進行這種取代作用，上述文獻在此引作參考。
用於本主題發明的肽不必與在後文實施例部分所述的肽或CTL肽的特定抗原蛋白序列相同，只要主體化合物能與適當的MHC分子結合或提供對靶抗原蛋白的細胞毒性T淋巴細胞活性就行。所以，熟練技術人員可以認識到，可進行許多基本上不影響肽的活性的保守性取代作用。保守性取代作用是涉及以另一個生物和/或化學相似的胺基酸，如用另一個疏水性殘基取代疏水殘基，或另一個極性殘基取代極性胺基酸的那些取代。
使用上述一般方法，可測得某特定的MHC等位基因的一個結合區。為了擴展對一個或多個等位基因產物表現出高度親合性的肽的特異性，可進行上述的修飾作用，並進一步測試所得肽的結合性。然後選出對特定的MHC分子表現出明顯較高的結合性的修飾肽。這種修飾作用可以用多少是隨機的方式進行。修飾初始肽的一種方法是將兩個或多個等位基因產物的結合區合併。
在另一種可用的方法中，含有對結合MHC是關鍵的側鏈的錨殘基被插入一個13個殘基的聚丙氨酸肽。Jardetzky等，Nature，353，326-329(1990)，已經使用了這種方法，並證明，以一個優性的MHC接觸殘基(Tyr)修飾過的聚丙氨酸肽可使該肽具有對DR1的高親合結合能力。也可使用環己基丙氨酸或苯丙氨酸取代酪氨酸作為主MHC接觸殘基。就肽與DR等位基因產物(它們能高度親合結合HA肽)的結合能力而言，這些殘基可以與Tyr互換，並且還可以與在DRβ鏈的第86位殘基有一個G→V取代的MHC分子結合。這種改變影響到II類MHC分子的B結合穴，使得酪氨酸不再能夠有效結合，但環己基丙氨酸或苯丙氨酸卻可以結合。
可在各種系統中檢測以上鑑定的肽的生物活性。典型的是，測試其抑制抗原特異性T細胞激活的能力。在一試驗方案中，將過量的肽與已知表達MHC(如DR1)的抗原表現細胞，和具有已知抗原特異性(如破傷風病毒830-843)和MHC限定性(仍然是DR1)的T細胞克隆，和抗原肽本身(即，破傷風病毒830-843)一起孵育。將測試培養物孵育足夠的時間以使T細胞增殖，例如4天，然後利用標準方法，如在孵育的最後18小時中以氚化胸腺嘧啶脈衝法來測定增殖情況。然後計算與沒有抑制物的對照相比的抑制百分比。
肽在體外試驗中抑制抗原表現的能力已被與其在體內抑制免疫應答的能力相關聯。可以在動物模型中測定其體內活性，例如給予已知與被局限於可被肽識別的特定MHC分子結合的抗原和免疫調節肽。然後從動物體內取出T淋巴細胞，用某劑量範圍的抗原培養。用常規方法，如(3H)-胸腺嘧啶脈衝法及與合適的對照的比較來測定對刺激作用的抑制。某些試驗細節對本領域熟練技術人員來說將是顯而易見的。也可參見Adorini等，Nature334，623-625(1988)，在此引作參考。
從美國菌種保存中心(「細胞系和雜交瘤目錄」第六版，(1988)Rockville Maryland，U.S.A.，在此引作參考)中可得知並容易得到許多具有已確定的MHC分子，尤其是II類MHC分子的細胞。
本發明肽的一優選實施例中包含了對N-和C-末端殘基的修飾。如本專業熟練技術人員可理解的，可修飾N-末端或C-末端來改變肽的物理或化學特性，例如影響結合率、穩定性、生物利用率、連接的便易性等。
以各種胺基酸類似物或D-胺基酸進行的肽的修飾，例如在N-或C-末端，可被用於例如提高肽的體內穩定性。這種肽可以「逆轉」或「反向-逆轉」的形式來合成，即，以D-胺基酸取代某序列胺基酸的L-胺基酸或逆轉胺基酸的序列並以D-胺基酸取代某序列胺基酸的L-胺基酸。因為D-肽顯著地耐受肽酶，所以在血清和組織中比它們的L-肽對等物穩定，與相應的L-肽相比，D-肽的生理條件下的穩定性可能不止於對親合性差異的補償。而且，取代或未取代過的含L-胺基酸的肽可以一個D-胺基酸的帽子來抑制外切肽酶對抗原性肽的降解作用。
可用許多方法來測定穩定性。例如，肽酶和許多生物培養基，如人血漿和血清已被用於測試穩定性。可參見如Verhof等，Eur.J.Drμg Metab.Pharmacokin.11，291-302(1986)；Walter等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.148，98-103；Walter等，Neuroendocrinology30，377-381(1980)；Verhoef等，J.Endocrinology110，557-562(1986)；Handa等，Eur.J.Pharmacol.70，531-540(1981)；Bizzoze-ro等，Eur.J.Biochem.122，251-258(1982)；Chang，Eur.J.Biochem.151，217-224(1985)，均被在此引作參考。
還可以在肽的C和N末端引入D-胺基酸殘基來提高穩定性。以前的研究已經表明，當被培養在含血清的培養基中時，通過在C和N末端引入D-胺基酸來提高肽對外切肽酶活性的耐受性可相當大地延長含L-胺基酸的肽的體外和體內半壽期。
可通過改變某些胺基酸的順序或組成來對本發明的肽或類似物進行修飾，很容易理解，某些對生物活性是決定性的胺基酸殘基，如位於關鍵接觸位的那些，其改變通常會對其生物活性產生不良影響。非關鍵性胺基酸則不必限於天然存在於蛋白質中的那些，例如可以是L-α-胺基酸或它們的D-異構體，但也可包括非蛋白胺基酸，如β-γ-δ-胺基酸及許多L-α-胺基酸的衍生物。如前所述，本發明的肽通常可含有L-胺基酸或D-胺基酸，但不能在核心結合區中含有D-胺基酸。
CTL肽CTL肽可與本發明的泛DR肽聯合給藥以強化免疫應答。一系列抗原蛋白的CTL抗原決定基可用於本發明的複合體。合適的抗原實例有前列腺特異性抗原(PSA)，B型肝炎核心抗原和表面抗原(HBVc，HBVs)，C型肝炎抗原，EB病毒抗原，黑色素瘤抗原(如MAGE-1)，人類免疫缺陷病毒(HIV)抗原和人乳頭瘤病毒(HPV)抗原。
在某些實施例中，本發明的CTL肽來源於HBV表面抗原或病毒粒子多肽，核心區及核心前區內。在本文所述的更為優選的實施例中，CTL誘導肽源於HBenv309-368區(肽799.08)，HBenv392-348區(肽799.09)，HBenv349-368區(肽799.10)或HBc91-110區(肽802.03)，其編號根據Galibert等，Nature281，646(1979)，在此引作參考。
合成含有合適的抗原決定基的CTL肽，然後使用純化的I型分子和放射性碘標記的肽和/或表達空I型分子的細胞，通過例如免疫螢光染色法、流動顯微螢光測定法、肽依賴I型分子組裝檢測和由肽競爭引起的CTL抑制測試它們與I型MHC分子的結合能力。然後進一步評價那些結合在I型分子上的肽作為由被感染或免疫的個體產生CTL的靶的能力，以及它們作為潛在的治療劑誘導初級的體外或體內CTL應答的能力，這可導致產生能與病毒感染的靶細胞和癌細胞反應的CTL群體。
可將一種或多種CTL肽與一種或多種泛DR肽以混合物形式聯合給藥，其中可以包含或不含肽之間的非共價結合。例如，可將這些肽中的一種或多種按如下所述進行脂化以便於肽之間的締合。或者，可將肽共價連接以形成一種CTL/泛DR肽複合體。
為了便於CTL肽和泛DR肽的結合，可在CTL肽的末端添加附加胺基酸。附加殘基也可因本文所述的原因或為了改善肽或寡聚肽等的物理或化學特性被用於與某載體、支承體或較大的肽偶合。可在肽或寡聚肽的C-末端或N-末端引入酪氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、穀氨酸或天冬氨酸等胺基酸。另外，通過例如用鏈烷醯基(C1-C20)或巰基乙醯基乙醯化反應對末端-NH2的醯化或利用氨或甲基胺進行的末端羧基的醯胺化，可使肽或寡聚肽序列與天然序列有所不同。在有些情況中，這些修飾作用可提供與載體或其它分子連接的位置。
就泛DR肽而言，應理解，本發明的肽或其具有CTL激發活性的類似物可被修飾以提供其它希望具有的特性，例如在提高或至少基本保留未修飾肽的所有生物活性的同時改善其藥學特性。例如，可通過對肽胺基酸序列的延長、缺失或取代，例如在由本文所揭示的序列得到的肽的氨基端或羧基端，或兩端添加或缺失胺基酸來修飾肽。通常，有意使序列中模仿CTL激發抗原決定基的那部分與靶抗原蛋白序列的區別不大於約20％，除非為了改善肽的物理或化學特性，例如方便連接或偶合等而可能在其末端添加附加胺基酸。如果肽序列中的某些區域被發現具有病毒亞型中的多型性，可能需要改變一個或多個特定胺基酸以更有效地模仿不同病毒株或亞型的不同細胞毒性T淋巴細胞抗原決定基。
由本發明鑑定的含CTL抗原決定基的肽序列區中，如HBV特異性肽，存在有一些殘基(或其功能基本相當的對等物)，它們可令肽保留其生物活性，即激發對病毒感染的細胞或表達病毒的細胞抗原的I型分子限定的細胞毒性T淋巴細胞應答的能力。可利用單胺基酸取代、缺失或插入來鑑定這些殘基。另外，可通過利用某特定胺基酸(如Ala)進行的系統掃描探得殘基側鏈的影響。可耐受多重取代作用的肽通常發生了小型，相對中性分子的取代作用，例如Ala、Gly、Pro或類似殘基。可被取代、添加或缺失的殘基的數目及類型取決於關鍵抗原決定基點之間的距離和要求的構相或功能特性(例如疏水性對親水性)。如有必要，還可通過這樣的改變提高肽類似物，因提呈給CTL而與它的MHC分子的結合親合性。通常，抗原決定基和/或具構相上的重要性的殘基間的任何間隔取代、添加或缺失應選用可避免可能干擾結合的立體和電性幹擾的胺基酸或其它組成部分。耐受取代作用，同時保留其要求的生物活性的肽也可象前文就泛DR肽所述的那樣被合成為含D-胺基酸的肽。
本發明的肽可通過連鍵組合成聚合物(多聚物)，或配製成不彼此連接的組合物，例如混合物。當相同的肽相連接時，形成均聚物，可提供大量的重複抗原決定基單元。當肽不同時，例如代表不同病毒亞型、同一亞型中的不同抗原決定基、不同的HLA限制特異性或含特定T輔助抗原決定基的肽的混合物，可得到具有重複單元的雜聚物。除了共價連鍵，還可考慮形成非共價連鍵的分子間或結構間的結合鍵。
複合體的製備如上所述，CTL誘導肽可與泛DR結合肽共價連接以製備本發明中的複合體。特別優選的CTL誘導肽/泛DR結合複合體是通過一個間隔分子連接的。或者，CTL肽可以不通過間隔與泛DR結合肽連接。間隔通常由較小的中性分子構成，例如胺基酸或胺基酸類似物，它們在生理條件下基本不帶電並可能具有線型或分支的側鏈。間隔分子通常選自，例如Ala、Gly或其它由非極性胺基酸或中性的極性胺基酸構成的中性間隔基。在本文的某些優選的實施例中，Ala為中性間隔基。可以理解，隨意提供的間隔基不一定由相同的殘基構成，所以可以是雜合或均聚的寡聚物。優選間隔基的實例是Ala均聚物。如果有間隔基存在，它通常至少為1至2個殘基，更通常的是3至6個殘基。在其它實施例中，泛DR結合肽優先結合在CTL肽的氨基端。肽之間可以通過一中性連接基，例如Ala-Ala-Ala等連接，而且最好還含有一個與一個Lys殘基的α和ε氨基相連的如軟脂酸等的脂質殘基(如後文所述)，該殘基通常通過Ser-Ser等結合在肽複合體的氨基端。
CTL誘導肽可以直接或通過一個位於CTL肽的氨基端或羧基端的間隔基與泛DR結合肽連接。CTL誘導肽或泛DR結合肽的氨基端都可以是醯化了的。另外，CTL肽/泛DR結合複合物可以如後文將述的通過一個或多個連接殘基，如Gly、Gly-Gly、Ser、Ser-Ser與某些鏈烷醯基(C1-20)脂質相連。
在某些實施例中，可能要求在本發明的藥物組合物中包括至少一種幫助引發CTL的組份。脂質被證實是可以在體內幫助引發體內對病毒抗原的CTL的物質。例如，可將軟脂酸殘基連接在Lys殘基的α和ε氨基，然後再通過一個或多個例如Gly、Gly-Gly、Ser、Ser-Ser等與一免疫原性肽連接。然後可將這種脂化的肽以被結合在某種脂質體中或乳化在某種助劑，如不完全Freund助劑中的膠束形式直接用於注射。在一個優選實施例中，一種特別有效的免疫原含有連接在Lys殘基的α和ε氨基上的軟脂酸，該殘基通過連鍵，如Ser-Ser連在免疫原性肽的氨基端。
作為脂質引發CTL應答的另一實例，E.coli脂蛋白，如三軟脂醯-S-甘油基半胱氨醯絲氨醯-絲氨酸(P3CSS)，當與合適的肽共價連接時可被用於引發病毒特異性CTL。可參見Deres等，Nature，342，561-564(1989)，在此引作參考。例如，本發明的肽可與P3CSS偶合，然後對個體使用這種脂肽以特異性地引發對靶抗原的CTL應答。而且，因為還可以用與表現某適當抗原決定基的肽結合的P3CSS來引發中和抗體，所以可將兩種組份組合在一起更有效地誘發由感染引起的體液介導和細胞介導的應答。
藥物組合物出於預防和/或治療的目的，可將本發明的泛DR結合肽和由它們製得的藥物和疫苗組合物用於哺乳動物，尤其是人。泛DR肽可被用於強化針對與肽一起使用的其它免疫原的應答。例如，CTL/泛DR結合肽混合物可被用於治療和/或防止病毒感染和癌症。或者，可使用能誘導抗體應答的免疫原。可用泛DR肽和其它免疫原構成的免疫原性混合物來治療的疾病的實例有前列腺癌、B型肝炎、C型肝炎、AIDS、腎癌、宮頸癌、淋巴瘤、CMV和尖銳溼疣。
泛DR結合肽還可被用於治療涉及T細胞不當反應性的各種疾病。可用泛DR結合肽治療的疾病的實例有自身免疫疾病(如類風溼關節炎、多發性硬化和重症肌無力)、同種移植排斥反應、變應性應答(如花粉過敏)、淋巴疾病、肝炎、LCMV、鏈球菌引起的心內膜炎或腎小球性腎炎，以及食物過敏。
用於治療時，本發明的免疫原性組合物或泛DR結合肽被用於已經患有癌症、自身免疫疾病或已被所研究的病毒感染的個體。只要合適，可單獨使用泛DR結合肽或免疫原性複合體或結合其它療法來對疾病潛伏期或發作期的病人進行治療。
用於治療時，給病人服用足量的含有免疫原性組合物的組合物以誘發對病毒或腫瘤抗原的有效CTL應答，從而治癒或至少部分抑制症狀和/或併發症。與此類似，可給病人服用足量的含有泛DR結合肽的組合物以治癒或至少部分抑制疾病的症狀及其併發症。足以完成上述功能的量被定為「治療有效劑量」。為此用途的有效量將取決於例如肽組份、給藥方式、接受治療的疾病的所在階段及嚴重性、病人的體重和總健康狀況和開方醫師的判斷。
本發明的免疫原性組合物的治療有效量通常在用於初次免疫(這是對治療和預防性給藥而言)時約為1.0μg至5000μg肽/70kg病人，然後的加強劑量根據數周至數月的強化進程約為1.0μg至1000μg肽。該進程取決於通過測定病人血液中特異性CTL活性而知的病人的應答和其它情況。
本發明的DR-結合肽的有效治療量通常對70公斤體重病人每日約0.1mg到約2000mg肽範圍，比較常用劑量為每日約0.5mg至約100mg肽。
必須記住，本發明的組合物常可用於重症病情，即危及生命或對生命有潛在危險的情況。在這種情況下，由於複合體外源物質最少而相對無毒的特性，治療醫師可能並可能認為必需使用大大過量的組合物。
為了預防性用途，在急性感染中，必須在疾病首次表現或被診斷出時，或手術去除腫瘤後，或剛確診後開始給藥。然後在至少症狀被顯著緩解並此後一段時間後再給以強化劑量。在慢性感染中，強化劑量前可能需要給以負荷劑量(loading doses)。
用本發明組合物治療被感染個體可以加速急性感染個體中感染的消除。對那些可能(或先傾向於)發展成慢性感染的個體，組合物在防止急性感染向慢性感染轉化的治療方法中特別有用。如果在感染前或感染中診斷出有轉化可能的個體，如本文所述，就可以給它們服用組合物，儘可能減少給較大群體用藥的需要。
還可將肽混合物或複合物用於治療慢性感染並刺激免疫系統殺滅病原攜帶者體內的病毒感染細胞。重要的是在製劑或劑型中提供足量的免疫加強肽以有效激發細胞毒性T細胞應答。所以，對於慢性感染的治療，代表性的劑量約為70kg的病人每劑1.0μg至5000μg，最好約為5μg中1000μg。可能需要免疫劑量後長時間內既定間期例如1至4周地給以強化劑量以有效地免疫個體。在慢性感染中，給藥必須持續直至臨床症狀或實驗室試驗顯示病毒感染已消除或基本緩解並穩定了一段時間。
治療用藥物組合物可非腸胃、表面、口服或局部給藥。最好，藥物組合物為非腸胃給藥，例如靜脈內、皮下、皮內或肌內。所以，本發明提供了非腸胃給藥的組合物，它們由溶解或懸溶在被認可的載體，最好是水性載體中的肽或複合物溶液構成。有許多可用的水性載體，例如水、緩衝水溶液、0.9％的鹽水、0.3％的甘氨酸、透明質酸等。可使用常規的，熟知的滅菌技術對這些組合物進行滅菌，或者也可進行無菌過濾。所得的水溶液即可被包裝使用，或凍幹，在使用前將凍幹製劑與無菌溶液混合。組合物中還可以按近似生理條件的要求含有如pH調節劑和緩衝液、滲透壓調節劑、溼潤劑等藥用輔助物質，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、單月桂酸山梨酯、油酸三乙醇胺等。
藥物製劑中本發明的泛DR和/或CTL激發肽的濃度(按重量計)變化範圍很寬，即從不足約0.1％，通常為或至少約為2％，至多達20％至50％或更多，並根據選定的特定的給藥形式，首先根據液體體積、粘度等來選擇。
本發明的肽和複合物還可以通過脂質體來給藥，它們可使複合物定靶到特定組織，例如淋巴樣組織或選擇性地定靶到被感染細胞，並可延長肽組合物的半壽期。脂質體包括乳劑、泡沫、膠束、不溶性單層、液晶、磷脂分散系、薄片層等。在這些製劑中，欲釋放的肽被結合作為脂質體的一部分，脂質體可以是單獨的或與某種分子一起，這種分子可與例如淋巴樣細胞中的主要受體，例如與CD45抗原結合的單克隆抗體結合，或與其它治療性或免疫原性組合物一起。所以，內含所需要的本發明的肽或複合物的脂質體可被導向淋巴樣細胞位置，然後脂質體在那裡釋放出特定的治療性/免疫原性肽組合物。由於本發明的脂質體是由標準成囊脂類形成的，這些脂類通常包括中性和帶負電的磷脂和某種甾醇，例如膽固醇。對脂類的選擇通常要考慮到例如脂質體的大小、脂質體在血液中的酸不穩定性和穩定性。有許多可用的製備脂質體的方法，正如以下文獻中所述，如Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9，467(1980)，U.S.專利4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369，在此引作參考。
為了定靶到免疫細胞，可將一配基加入脂質體，例如對要求的免疫系統細胞的表面決定基具有特異性的抗體或其片段。含有肽或複合物的脂質體懸溶液可通過靜脈內、表面、局部等途徑給藥，劑量根據，尤其是給藥方式、被釋放的複合物和被治療的疾病的階段而不同。
對固體組合物而言，常用無毒固體載體包括，例如藥用級的甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。對於口服給藥，可混合任何常用賦形劑，例如前文所列的那些載體和通常為10-95％的活性成分，即一種或多種本發明的複合物，以25％-75％的濃度更好，從而形成藥用無毒組合物。
對氣霧劑給藥而言，這些肽最好被精細粉碎並與某種表面活性劑和推進劑混合在一起。複合物典型的重量百分比為0.01％-20％，以1％-10％為佳。當然，表面活性劑必須是無毒的，並最好可溶於推進劑。這類試劑的代表為6至22個碳原子的脂肪酸，如己酸、辛酸、月桂酸、軟脂酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、油硬脂酸和油酸與某種脂族多元醇或它的環狀酐形成的酯或半酯。可使用混合酯，例如混合的或天然的甘油酯。表面活性劑可佔組合物總重的0.1％-20％，以0.25％-5％為佳。組合物中的其餘組份通常為推進劑。如有必要，還可包含某種載體，例如用於鼻內釋放的卵磷脂。
本發明的另一方面涉及以本文所述的免疫原性上有效量的免疫原性的泛DR肽或CTL/泛DR肽複合物為活性成分的疫苗。複合物可與其自身的載體結合後或以活性肽單元的均聚物或雜聚物形式被引入包括人在內的宿主。這種聚合物的優點在於提高免疫反應以及當聚合物由不同的肽構成時附加的誘導可與病毒或癌細胞的不同抗原決定族反應的抗體和/或CTL的能力。可用的載體是本專業所熟知的，包括，例如甲狀腺球蛋白、如牛血清白蛋白等白蛋白、破傷風毒素、如聚(賴氨酸穀氨酸)那樣的聚胺基酸、B型肝炎病毒核心蛋白、B型肝炎病毒重組疫苗等。疫苗中還可含有生理可耐受的(被認可的)稀釋劑，如水、磷酸鹽緩衝液或鹽水，通常還包括某種助劑。如不完全Freund助劑、磷酸鋁、氫氧化鋁或明礬等助劑是本專業所熟知的物質。另外，如前所述，可通過將本發明的肽與脂類，如P3CSS複合來引發CTL應答。在通過注射、噴霧、口服、腦內或其它途徑用本文所述的肽組合物進行了免疫後，宿主的免疫系統立刻通過產生大量對要求的抗原具有特異性的CTLs來對疫苗產生應答，而宿主變得對以後的感染至少具有部分免疫力或防止發展成慢性感染。
可給對疾病，如病毒感染或癌症易感或有患病危險的病人服用含有本發明的泛DR肽的疫苗以誘導對抗原的免疫應答並由此加強病人本身的免疫應答能力。這樣的用量被定為「免疫有效劑量」。使用中，確切的量仍然取決於病人的健康狀況和體重、給藥方式、製劑的特性等，但通常約為1.0μg至5000μg/70kg病人，更常用的約為10μg至500μg/70kg病人。
有時，可能需要將本發明的肽疫苗與誘導對特定病毒，特別是病毒被膜抗原的中和抗體應答的疫苗混合使用。
為了治療或免疫的目的，還可以用已減弱的病毒宿主，如牛痘或禽痘來表達本發明的肽。這種方法涉及使用牛痘病毒作為表達編碼本發明的肽的核酸序列的載體。在被引入一急性或慢性感染的宿主或未感染的宿主中後，牛痘病毒立刻表達免疫原性肽並誘導宿主的CTL應答。美國專利4,722,848中描述了在免疫方案中使用的牛痘病毒和方法，在此引作參考。另一種載體是BCG(卡介苗)。Stover等，Nature351，456-460(1991)對BCG進行了描述，在此引作參考。根據本文的說明，用於本發明的肽的治療性給藥或免疫的多種其它載體，如Salmonella typhi載體，對本專業熟練技術人員來說將是顯而易見的。
也可將抗原複合物用於體外激發CTL。可將產生的CTL用於病人體內治療慢性感染(病毒或細菌性的)或癌症，這種病人對其它治療形式不應答，或對某種療法中的肽疫苗不應答。對特定病原(感染原或癌症抗原)的體外CTL應答是通過將病人的CTL前體細胞(CTLp)與一抗原提供細胞(APC)及合適的免疫原性肽一起組織培養來誘導的。在培養了一段合適的時間後(通常為1-4周)，期間，CTLp被激活、成熟並增大成效應者CTL，這些細胞被輸回病人體內，它們將在那裡摧毀它們的特異性靶細胞(被感染細胞或癌細胞)。
本發明的肽還可被用於製造單克隆抗體。這種抗體可被用作潛在的診斷或治療劑。
這些肽還可用作診斷劑。例如，某種本發明的肽可被用來測定某特定個體對使用肽或相關肽的療法的敏感性，從而有助於改進現行治療方法或測定某有效個體的預後。另外，這些肽還可用於預測哪個病人有較大的發展成慢性感染的危險。
提供以下實施例是作為說明而非限制。
實施例實施例I試驗步驟I.細胞系和MHC的純化多種細胞系被用作純化的人和小鼠的II類分子的來源。以下被EB病毒轉化的純核子細胞系被用作人HLA Ill類分子(Valli等，J.Clin.Invest.91，616-628，1993)的來源LG2(DB1*0101(dR1))；3107(DRB1*1501(DR2w2b))；MAT(DRB1*0301(DR3))；PREISS(DRB1*0401(DR4))；BIN40(DRB1*0404(DRw14))；SWEIG(DRB1*11011(DR5))；PITOUT(DRB1*0701(DR7))；PF(DQA1*0301/DQB1*0301(DQ3.1))。有時，也可使用轉染的成纖維細胞L416.3(DRB5*0101(DR2w2a))；TR81.19(DRB3*0101(DR52a))；和L257.6(DRB4*0101(DRw53))。至於小鼠II類分子，使用以下細胞系A20(IAd，IEd)(Sette等，Science258，1801-1804，1992)；CH12(IAk，IEk)(Sette等，1992)；LS102.9(IAx)(Wall等，Int.Imm.4，773-777，1992)；和DB27.4(IAb)(Wall等，J.Immuno.1524526-4536，1994)。
II.MHC分子的純化MHC分子的純化基本如Gorga等，J.Biol.Chem.262，16087-16094(1987)所述。簡而言之，用LB3.1(全部DR，Valli等，J.Clin.Invest.91，616-628(1993))或IVD12(DQ3.1，Sidney等，J.Im-munol.152，4516-4525(1994))單克隆抗體通過親合層析來純化人II類分子。用MKD6(IAd，Sette等，Science258，1801-1804，1992)；10.3.6(IAk，Sette等，同上)；14.44(IEk和IEk，Sette等，同上)；和Y3JP(IAs，Wall等，Int.Imm.4，773-777，1992)單克隆抗體來純化小鼠II類分子。
III.肽的合成利用標準Fmoc偶合循環程序(1.40版)，在一臺AplliedBiosystem(Foste市，CA)430A肽合成儀上通過N-α-Fmoc-保護的胺基酸的序列偶合來合成肽。所有的胺基酸、反應試劑和樹脂均得自Apllied Biosystem或Nova Biochem(San Diego，CA)。溶劑得自BurdichJackson。固態合成開始於一被適當取代的Fmoc-胺基酸-Wang樹脂。起始樹脂的加量為0.5-0.7mmol/g聚苯乙烯，每次合成中使用0.1或0.25毫當量。一典型的反應循環如下進行在25％的哌啶的二甲基甲醯胺(DMF)溶液中反應5分鐘以去除N-端的Fmoc基，然後再用25％的DMF溶液處理15分鐘。用DMF洗滌該樹脂5次。在樹脂中加入過量4至10倍的預形成的合適的Fmoc-胺基酸的1-羥基苯並三唑酯的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液，令混合物反應30至90分鐘。用DMF洗滌樹脂以備其後的延伸循環。對全保護的、樹脂結合的肽進行一次哌啶循環以去除末端的Fmoc基團。用二氯甲烷洗滌產物並乾燥。然後在20℃，在合適的清除劑(例如5％(v/v)的水溶液)存在下用三氟乙酸處理樹脂60分鐘。蒸發去除過量三氟乙酸後，用二乙醚洗滌粗肽，將其溶解在水中，然後凍幹。利用反相HPLC將肽純化至均一性＞95％，使用含0.8％TFA改性劑的H2O/CH3CN梯度，在一Vydac上進行，孔徑300A，用C-18製備柱。在一分析反相柱上測試肽的純度並利用胺基酸分析和/或測序確定肽的組成。合成中使用的環己基丙氨酸購自NofaBiochem(San Diego，CA)。在切下肽之前在樹脂上完成軟脂酸偶合來製備軟脂醯化的肽。偶合以對稱酸酐法進行，即過量兩倍的軟脂酸和一倍的二異丙基碳化二亞胺在二氯甲烷中反應1小時。
IV.MHC肽結合的測試在蛋白酶抑制劑混合物存在下，將純化的小鼠或人的II類分子(5至500nM)與5nM125I-放射性標記的肽在含5％DMSO的PBS中孵育48小時。用氯胺-T法進行純化肽的碘標記(Buus等，Sci-ence235，1353-1358(1987))。蛋白酶抑制劑的終濃為1nMPMSF，1.3nM1.10菲咯啉，73μM抑胃酶素A，8mM EDTA，6mMN-乙基馬來醯亞胺，和200μM Nα-對甲苯磺醯基-L-賴氨酸氯乙基丙酮。孵育混合物中去汙劑的終濃為2.6％的毛地黃皂甘(IAd和IAk)或0.05％的NP-40(所有其它II類分子)。由Sephadex G-50或TSK2000柱上的凝膠過濾從游離肽中分離出II類分子-肽複合物，如現有技術所述計算被結合肽的所佔百分數(Sette等，J.Immnol.142，35-40(1989))。在預備試驗中，用固定量的放射性標記肽來滴定每種DR製劑以測定結合總放射性的10％至20％所需的II類分子濃度。所有以後的抑制和直接結合試驗均用該II類分子濃度進行。在抑制試驗中，抑制肽的試驗濃度通常為120μg/ml至1.2μg/ml。然後以此數據作圖，測出產生50％抑制的劑量。對每種肽進行2至4次完全獨立的試驗測試。
在本文中，＜50nM的結合為高親合性結合而50-500nM的結合為中等親合性結合。
V.DR限制的肽顯示的抑制測試肽抑制MHC抗原顯示功能的能力，方法是將用絲裂黴素C處理過的合適DR類型的EBV細胞(5×104/穴)與溶於RP-MI1640(Bio Whittaker，Walkersville，MD)中的抑制肽培養在含10％人血清(Gemini Bioproducts，Inc.Calabasas，CA)的完全培養基中。常規地在96穴的U形底的測試板(Costar，Cambridge，MA)中對四份十倍稀釋液滴定抑制肽，初始濃度為150μg/ml。與抑制肽一道，測試穴中還有亞適濃度的HA307-319肽(DR1，DR4w4，DR5，DR52b)或HA307-319，Y309＞F(DR4w14)，或Lol P1171-190(DR3)(Sidney等，J.Immunol.149，2634-2640(1991))，該濃度在無抑制肽時產生最大增殖應答的30-50％的。此濃度常規為50至200ng/ml。在含5％CO2的培養箱中將APC與各種肽在37℃培養2小時後，在每穴中加入2×104T細胞。所用的T細胞克隆為Cl1(DR1和DR52b(Krieger等，J.Immunol.146，2331-2340(1991)))；克隆42.19(DRw14)；克隆JK1(DR5)和細胞系132-132(DR3)。3天後測試T細胞的增殖。簡而言之，加入T細胞24小時後，每穴加入[3H]胸腺嘧啶(1μCi/穴)(ICN，Irvine，CA)以進行最後18小時的培養。然後在玻璃纖維濾紙(LKB Wallac細胞收集器1295-001，LKB，Gaithersburg，MD)上收穫細胞，然後測定胸腺嘧啶的摻入(LKB beta測試板計數器1205)。對抗原顯示的抑制程度計算為抑制50％的增殖應答所需的抑制肽劑量。
實施例2「通用」肽抗原決定基的DR結合特異性幾種小鼠和人的II類MHC等位基因產物的結合序列已被確定，而且最近，通過對天然加工過的肽的測序進行的II類類型的序列分析也有所描述(Rudensky等，Nature353，622-627(1991)；Chicz等，Nature358，764-768(1992)；Hunt等，Science256，1817-1820(1992)；Rudensky等，Nature359，429-431(1992))。
尤其是DR分子，已證實，佔據MHC結合溝的相應疏水穴的大型疏水錨結構是肽-DR相互作用的最關鍵的決定基。其它幾種錨結構也起著一定但較次要的作用，並幫助確定等位基因特異性。最近，也有人強調肽分子C-末端半段的肽骨架直接以氫鍵與MHC結合溝區的璧結合。
雖然沿MHC等位基因的結合穴排列的等位基因特異性多型性殘基傾向於賦予每個等位基因結合一組特異的肽的能力，但在許多情況中，一個給定肽被證明可與一個以上的MHC特異型結合。最好的記載是人的DR同種型的例子，其中以前指出過，幾個DR等位基因產物似乎能識別相似的序列，而且，幾個研究者分別報導了多種DR類型中某些抗原決定基的變性結合和/或識別，從而產生了某些肽可能代表著「通用」抗原決定基的概念(Busch等、Int.Immunol.2，443-451(1990)；Panina-Bordignon等，Eur.J.Immunol.19，2237-2242(1989)；Sinigaglia等，Nature336，778-780(1988)；O』Sullivan等，J.Immunol.147，2663-2669(1991)；Roache等，J.Immunol.144，1849-1856(1991)；Hill等，J.Immunol.147，189-197(1991))。
使用實施例I第V段所述的試驗方法確定了前述能結合一種以上DR分子的DR結合肽(HA307-319，TT830-843，CS378-398，MT17-31和HBVnc50-69)的DR結合能力。所得數據(表II，A部分)表明，雖然這些肽的確能結合幾種試驗的DR分子，但它們不能與其它的結合。例如，HA307-319可高親合性(IC50％＜50nM)或中等親合性(50-500nM)地與DR1，DR4w4，DR5，DR7和DR2w2a結合，與DRw53(2.2μM)結合很弱；但並未測得與其它4種DR特異型的結合。HBVnc50-69也可與10種被測DR特異型中的5種(DR1，DR2w2b，DR4w4，DR5和DR2w2a)以高親合性或中等親合性結合。TT830-843和CS378-398可與被測DR分子中的4/10(分別為DR1，DR5，DR7，DR2w2a和DR1，DR4w4，DR5，DR7)以高親合性或中親合性地結合，MT17-31可與10個DR類型中的3個高親合性或中親合性地結合。
總之，雖然前述這些「通用」抗原決定基與幾種DR類型發生了結合，在它們的結合能力方面它們並不完全具有交叉反應性，因為被測DR特異型中至多50％可與一種給定的肽發生高至中等親合性的結合。
實施例3對多種DR等位基因產物具有高親合性的肽760.50和760.57的開發製成了一系列可與類風溼關節炎相關DR等位基因DR1，DR4w4，DR4w14產物高親合性結合的肽。為了製備這些肽，我們使用了最早由Jardetzky等，EMBO J.91797-1803(1990)所描述的方法，其中，含有結合MHC的關鍵側鏈的錨殘基被插入一由13個殘基構成的聚丙氨酸肽中。未授權的專利08/121,101描述了定名為760.50和760.57的這樣兩種肽，它們在其廣泛的DR結合特異性方面具有特殊的意義。當測試其與一組10種純化的DR分子的結合時發現，總的來說，這些肽與前述的「通用」肽相比，結合時的親合性更高，特異性更廣(表II，B部分)。760.50和760.57均無完全交叉反應性，因為對10種被分析的等位基因中的4種(DR2w2b，DR3，DR52a和DRw53)只測得了低親合性的結合。表I各種肽抗原決定基與不同DR等位基因產物的結合能力肽 序列Drβ1 DRβ2單位基因產物 單位基因產物肽/限制性元素DR1DR2w2bDR3DR4w4 DR4w1DR5DR7DR52DRw53DR2w4 a 2aAHA307- PKYVKONTLKLAT 5(1)--(2)-- 45 -- 118385-- 2200 45319PHHTALROAILCWGEL 70 9.1 -- 85 505 2636762765 ND(4)211HBVnc50-MTLA 52 -- 3623 -- -- 20 25 -- -- 2069 OYIKANSK FIGITE 17 1820 -- 250 2272154147-- -- 1430TT830- DIFKKIAKMFKARRVFN 13 -- -- -- -- -- 2086266 6538 350843VVNRCS378YSGPLKA EIAORLEDV398MT(Y)1731B760.50 aA(X)AAAKTAAAAa(3 3.1 569 6410 2.8 6.9 6.11929400 560 57760.57)4.5 479 2550 2 3.1 5.478 -- 3300 5aA(X)AAAATLKAAaC906.09 aA(X)VAAATLKAAa0.6114 280 2.6 5.4 2.576 588 932.0906.11 aA(X)IAAATLKAAa0.3819 100 2.8 3.3 2.431 1120 411.3D965.10 aK(X)VAAWTLKAAa0.9140 86 1.1 9.1 9.1167979 7561024.03 aKFVAAWTLKAAa 1.2 27 1470 2 8 18 208797 420 11(1)nM IC50％值(2)短劃表示無可測結合(＞10.000nm)(3)x＝環己基丙氨酸(4)ND＝未實驗實施例4對多種DR等位基因產物高親合性結合的肽906.09和906.11的開發為進一步擴展特異性而合成了906.09和906.11肽，其中，在760.57肽的4位引入了一個V或I。如表II的C部分所示，906.09和906.11肽都保持了對DR1，DR2w2a，DR4，DR5和DR7的良好的結合親合性(0.3-0.8nM)。而且，對分子DR2w2b，DR3，DR52和DRw53分子的結合能力顯著提高(10到25倍)(與760.50和760.57相比)，IC50％達20至1200nM。所以，10種被測DR特異性中的9種與這些肽發生了高至中等親合性的結合，一種，DR52a發生了弱結合。
最後，這些數據說明了與絕大多數，如果不是全部，DR等位基因產物結合的肽的開發成功。由於這種在不同DR分子間的廣泛交叉反應方式，我們已確定，906.09和906.11肽是泛DR結合肽。
實施例5還可與DQ3.1和小鼠II類分子結合的泛DR結合肽還為測定泛DR結合肽是否可與其它人II類同型或非人類II類分子結合而進行了試驗。更具體地說，就泛DR結合肽與DQ3.1和幾種小鼠II類特異型的結合進行了測定，如表III所示。作為參考，在表III的A部分還列出了前述小鼠II類抗原決定基的結合親合性。所有這些抗原決定基均與它們的相關限制性因子發生了高或中等親合性的結合，IC50％為20至400nM之間。已發現，通常，760系列肽(表III，B部分)與6種被測等位基因中的5種(IAb，IAd，IEd，IAs，IEk)發生中等親合性結合，IC50％值為80至700nM。有意義的是，960系列肽(表IIIC部分)與上述等位基因發生了IC50％為10至100nM範圍間的明顯較高的親合性結合，而且906.11還與IAk發生了中等親合性結合。至於與DQ3.1的結合，760.50，760.57，906.09和906.11均被發現可與純化的DQ3.1分子發生較高親合性的結合(IC50％為30至120nM)。
作為對照，還測定了760和906肽與人I類分子的結合能力。未測得IC50高達10μM的與純化的HLA-AL，-A2.1，-A3，-A11和-A24分子的結合(數據未示)。最後，這些數據表明906系列肽是泛II類(但非I類)MHC結合肽。表III各種肽抗原決定基與純化的DQ3.1和小鼠II類分子的結合能力序列 ClassII等位基因產物DO3.1IAblAdIEdIAsIAklEkAHBVc128-140/IAb TPPAYRPPNAPIL ND(1)255 -- -- -- -- --Ova323-336/IAd，bISOAVHAAHAEINE577(2) 400 110-- 1038 1000 700Lambda rep.12-26/IE YLEDARRLKAIYEKKK --(3)--1100 170-- -- 28d.k HSLGKWLGHPDKF -- ＞3100 -- -- 86 -- --PLP139-151/IAs NTDGSTDYGILOINSR 37507000 1222 8500 -- 20 --HEL46-61/IAkB760.50aA(X)AAAKTAAAAa31 20068815549110,00 127760.57aA(X)AAAATLKAAa94 3771921721200 785260C 5260906.09aA(X)VAAATLKAAa48 31 38 31 1041333 11906.11aA(X)IAAATLKAAa115 28 25 13 98 15414D965.10aK(X)VAAWTLKAAa25 94 7333546133333 3261024.03 aKFVAAWTLKAAa 23 44 1133 3056 1059 -- 3500(1)ND＝未實驗(2)nM IC50％ 值(3)短劃表示無可測結合(＞10.000nM)
實施例6泛DR結合肽對T細胞增殖的抑制由於它們的變性II類分子結合能力，泛DR結合肽可被作為抑制涉及同種移植排斥反應、變應性應答或自身免疫的T細胞介導的反應的候選藥物。所以，對這些肽在體外抑制抗原特異性T細胞增殖應答的能力進行了評價。用實施例I第V段所述的抗原顯示抑制試驗來進行這種評價。
與它們的MHC結合能力相一致，發現這些肽是由至少6種不同的DR分子(表IV)限定的人T細胞的強效抑制劑。更具體地說，高親合性結合DR1，DR4w4，DR4w14和DR5的肽760.50和760.57可抑制由以上等位基因產物限定的T細胞增殖，IC50％為1.0至25μM。相反，這些肽只與DR3弱結合，IC50％為2.5至6.5μM，所以它們對DR3限制的T細胞反應抑制很弱(760.57的IC50％為220μM)或根本不抑制(760.50的IC50％＞250μM)。
906.09和906.11肽也可十分有效地抑制DR1，DR4w4，DR4w14和DR5的應答(IC50％為0.5μM-15μM)。正如預料的，具有中等DR3結合能力的906類似物也可抑制DR3限制的抗原顯示，IC50％為30μM-60μM。
在同一組的試驗中，我們還測試了760和906肽的抑制DR52b限制性應答的能力。由於我們還不能用分子結合試驗來測定肽與DR52b分子的結合，所以該試驗對我們來說是有意義的。所得數據表明906.09和906.11肽都能抑制DR52b分子中HA307-319克隆1的顯示，該抑制具有較好的IC50％值，該值為1-2μM，由此可將其增加為這些肽的泛DR結合能力中的第11個等位基因。
最後，這些肽不能抑制應答多克隆有絲分裂原PHA的HA特異的、DR限制的T細胞克隆的增殖，也不能在最近記述的T細胞拮抗劑試驗(De Magistris等，Cell68，525-634(1992))中起抑制作用，在這些試驗中，肽在抗原刺激之後(不是同時)加入(數據未示)。這些發現排除了這種可能性，即前述結果可能是由某些760或906肽的某種非特異性細胞毒性引起的。表IV泛DR結合肽對T細胞增殖的抑制由以下等位基因限定的抗原表達實驗中的抑制活性肽序列DR1DR3DR4w4DR4w14DR5DR52b760.50aA(X)AAAKTAAAAa4.3(1) ＞250 3.2 2.8 25＞180760.57aA(X)AAAKTLKAAa2.1 220 0.940.79 18 7.5906.09aA(X)VAAATLKAAa0.8831 0.580.43 11 1.6906.11aA(X)IAAATLKAAa1 56 0.740.59 13 1.7(1)μM IC50％
實施例7通過對具有廣泛反應性的II類分子結合肽的修飾來產生泛DRT細胞抗原決定基本發明還考慮了泛DR結合肽的不同類型的用途，即將這些肽用於產生泛DR限定的T輔助抗原決定基，這些抗原決定基有助於體液和細胞毒性應答。因為泛DR結合肽中所有潛在TCR接觸殘基都是丙氨酸，可以推測，由於甲基側鏈可能參與的有限的相互作用，引入更大型疏水性帶電殘基可能提高與T細胞受體的相互作用並由此提高它們的免疫原性。
根據這一推理，我們進一步修飾了906.09泛DR肽。通過在2，5和7位引入大型或帶電側基得到了幾種類似物，根據對HA307-319肽的以前的分析，這些位點是潛在的TCR接觸殘基。相反，那些已知會影響DR結合的位置被保持原狀(3，4，8，9和11)。另外，還生成了在3位帶有天然胺基酸Phe而不是環己基丙氨酸的類似物。然後測定這些肽被保留的與多種DR等位基因產物結合的能力，再對那些DR結合能力無明顯下降的肽測定其誘導免疫應答的能力。下文對其中最好的兩種肽，965.10和1024.03的數據進行論述。
當測定這兩種肽與HLA DR和小鼠Ia的結合(表II的D部分和表III的D部分)時發現，總的說來，它們保留了親代肽906.09具有的對大多數DR等位基因產物的高結合力和廣泛的反應性。例外的是1024.03，它只與DR3弱結合(1470nM)與DRw53的結合只是中等親合(420nM)而不是高親合。而且，965.10和1024.03肽對被測小鼠II類分子的結合能力大大降低。但是，對lAb等位基因產物的良好結合能力被保留，由此可用H-2b小鼠來測試這些肽的體內免疫原性(見下文)。最後，兩種肽的良好的DQ3.1結合能力(在25nM範圍內)也被保留。
實施例8泛DR結合肽的體外免疫原性就取自正常個體的PBMC中體外激發T細胞應答的能力，進行了泛DR結合肽965.10，和它的兩個親代肽906.09和760.50，及以前所述的天然抗原決定基TT830-843之間的比較。所用方案使用了用自體APC和肽抗原對PBL進行必需的反覆激發，並被特別設計成可進行體外初級應答的研究。該方案如下所述，並附有試驗結果。
A.試驗方案使用根據Manca等，J.Immunol.146，1964-19719(1991)的改進方案體外刺激來自健康供體的PBMC。在Ficoll-Paque(Pharma-cia LKB，Uppsala，Sweden)上純化外周血單核細胞(PBMC)，並加於24穴組織培養板(Costar，Cambridge，MA)中其中4穴，4×106/穴PBMC。加入終濃度為10μg/ml的肽。培養物在37℃，5％CO2條件下孵育。在第四天，加入終濃度為10ng/ml的重組IL-2。此後每隔三天吸除1ml培養基並補充以含IL-2的新鮮培養基。約在第14天和第28天再用抗原進行兩次對T細胞的刺激。在一24穴組織培養板的3穴中用肽(10μg/ml)來刺激T細胞(3×105/穴)，以自體PBMC細胞為抗原顯示細胞(2×106輻照過的(7500rad)/穴)。另外，在第14天和第28天，如下測定T細胞的增殖應答2×104T細胞/穴；以1×105輻照過的PBMC/穴為APC；在U形底的96格組織培養板(Costar，Cambridge，MA)上滴定得肽的終濃度為0.01-10μg/ml。如前所述，在第3天進行增殖的T細胞的收穫。
B.結果圖1顯示了三個正常供體的代表性數據。圖A至圖C顯示了兩輪刺激後所得的數據，圖D至圖F顯示了第三輪刺激後的數據。如所預計的，親代肽760.50和906.09在這些試驗中的免疫原性很弱。兩種肽都不能在兩輪刺激後誘導明顯的(＞10,000cpm)應答。在第三輪刺激後，760.50在三供體之一中誘導了應答。天然「通用」抗原決定基TT830-843也不能在所有三個供體中產生中度明顯的應答。與這些弱應答相反，所有三個供體僅在兩輪刺激後均對修飾過的泛DR肽965.10產生了強烈應答。
圖2A和圖2B概括了全部所得的體外刺激作用數據(分別對應於第二次刺激和第三次刺激)。二次體外刺激後(圖2A)，肽965.10是唯一能在大多數供體中(9/12)明顯刺激T細胞的肽。TT830-843能在少數個體中(3/12)產生應答，但760.50和906,09均不能刺激任何應答(0/3)。通過第三次刺激(圖2b)，965.10在12個被測供體的11個中產生了明顯應答，TT830-843此時可在大多數供體(7/12)中產生明顯應答；760.50在三個供體之一中誘導了應答，而906.09在三個被測供體中均不能刺激應答。
965.10肽早在二次刺激就具有擴增特異性T細胞群的能力，加上它在三次刺激後實際上在所有供體中產生了明顯應答的能力表明了該肽與TT830-843，760.50或906.09相比有優良的免疫原性。
實施例9泛DR抗原決定基在小鼠體內的免疫原性在C57BL/6J(H－2b＋)小鼠體內試驗了760.50、965.10和1024.03肽的體內免疫原性。
為了進行這些試驗，在尾根給C57BL/6J(H－2b＋)小鼠皮下注射滴定劑量的各種肽(0.000125、0.0025、0.05、1和20μg/鼠)的100ul體積PBS/CFA(Difco，Detroit，MI)溶液。在第10天，收集各組(三鼠/肽劑量)的腹股溝淋巴結和主動脈側淋巴結，混合併均化成單細胞懸溶液。將細胞洗滌兩次後加在96穴微效價組織培養板上(1×106細胞/穴)。加入對數劑量肽滴定的免疫肽(0.01至100μg/ml)並如下進行標準的三天T細胞增殖試驗。
在這些試驗中，將非天然抗原決定基的活性與另兩種另外的以前確定的天然IAb限定的抗原決定基Ova323-336和HBV核心128-140進行比較。這兩種天然抗原決定基的結合親合性低於(3至14倍)965.10(表III，A部分)。將不與IAb明顯結合的TT840-843肽(數據未示)作為陰性對照。用不同量的肽(0.000125至20μg/鼠)的CFA溶液免疫各組鼠。免疫十天後收集膿腫的淋巴結並用不同劑量的抗原進行體外刺激。
如圖3所示，發現，與其不能與IAb結合相一致，TT830-843不能產生特異性T細胞增殖應答。已知IAb限定的輔助抗原決定基Ova 323-336(圖3，板塊B)和HBVc125-140(圖3，板塊C)在兩種用於免疫的最高肽劑量(1和20μg/鼠)下誘導了25,000至70,000cpm範圍的應答。泛DR抗原決定基965.10(圖3，板塊D)和1024.03(圖3，板塊E)用低至0.05μg/鼠的免疫有效劑量激發了最強的應答幅度達100,000至150,000cpm。相反，肽760.50(圖3，板塊F)僅勉強具有免疫原性，只能在最高測試劑量(20μg/鼠)下誘導很弱的增殖應答。這些結果表明泛DR抗原決定基965.10和1024.03不論在體內及體外均具有高效輔助抗原決定基的功能。結合人免疫原性數據，它們也表明在潛在的TCR接觸位置上的「免疫決定基」胺基酸殘基的存在是產生強烈T細胞應答的重要因素。
實施例10泛DR肽行使小鼠體內CTL誘導輔助抗原決定基的功能通常假設，誘導T細胞增殖應答的能力是肽抗原決定基輔助能力的一個標記。我們試圖通過測定965.10肽在產生CTL應答中提供幫助的能力來證實這點。用如下述方案進行CTL誘導試驗。
A.CTL誘導方案通過在尾根皮下注射溶於PBS/5％DMSO並乳化在IFA(Dif-co，Detroit，MI)中的CTL和輔助抗原決定基混合物來免疫3至6個一組的C57BL/6J小鼠。11天後，將鼠殺死並製取脾細胞。加入被肽包裹的同源成脂多糖(LPS)細胞體外刺激脾細胞(3×107/10ml/T25燒瓶)。成LPS細胞在使用前72小時由重懸於含LPS(W Ecoli055B5)(Difco，Detroit，MI)(25μg/ml)和硫酸葡聚糖(Pharmacia，Uppsala Sweden)(7μg/ml)的培養基中的脾細胞中製取。準備總體積30ml濃度為1.5×106脾細胞/ml的培養物，並在T75燒瓶中於37℃，5％CO2條件下孵育72小時。
然後，對細胞進行輻照，洗滌並重懸成30-40×106細胞/ml。取每份1ml的懸液與100μg/ml的CTL抗原決定基在37℃，5％CO2條件下孵育1小時。將細胞洗滌一次後重懸為10×106細胞/ml。向合適的效應劑細胞中加入每燒瓶1ml體積的懸液並孵育6天。然後用EL4(b單倍體型)靶細胞(3×106細胞/ml)測定細胞毒性，這些細胞在51Cr鉻酸鈉和CTL抗原決定基肽存在下培養於37℃。60分鐘後，將細胞洗滌3次並重懸在含10％FCS(Irvine Scientific，SantaAna，CA)，2mM L-穀氨醯胺(Irvine Scientific)，50μg/ml的慶大黴素(Irvine Scientific)和5×10-5Mβ巰基乙醇(Sigma，St.Louis，MO)的RPMI-1640(Bio Whittaker，Walkersville，MD)中。然後，將1×10451Cr標記過的靶細胞加入U形底的96穴測試板中的效應劑細胞滴定液中，最終體積為200ul。在37℃，5％CO2中培養6小時後，每穴取0.1ml一份的上清液在Micromedic gamma計數器中進行放射性測定。由下式測定比溶胞率％比溶胞率＝100×(實驗釋放—自發釋放)/(最大釋放—自發釋放)。數據的表示單位為溶胞單位/106效應劑細胞。一個溶胞單位任意定義為有或無肽存在時，在6小時內裂解1×14451Cr標記的靶細胞中的30％所需的淋巴細胞數。
我們用10nm劑量的Kb限定的(Carbonan和Bevan，J.Ewp.Med.169603-612(1989))脂化的CTL決定基(Ova257-264)，和不同量的IAb限定的輔助抗原決定基Ova323-336(Wall等，J.Im-munol.1524526-4536(1994))，HBV核心128-140，或965.10肽一起來免疫C57BL/6J鼠。11天後，用CTL抗原決定基Ova257-264體外刺激脾細胞，並將細胞培養6天，然後在一標準的6小時鉻釋放試驗中進行測試。CTL靶細胞包括Ova257-264脈衝的EL4細胞和Ova257-264轉染的EG7細胞。
B.結果表V顯示了所得結果。泛DR抗原決定基965.10誘導的CTL應答被發現是劑量依賴方式的，當用5μg/小鼠的965.10肽和Ova257-264CTL抗原決定基一起注射時可測得最優的307溶胞單位。相反，不論就其輔助效應(分別提高四倍和三倍)還是誘導最優輔助活性所需的劑量(100μg/鼠)來說，Ova323-336和HBV核心128-140的輔助活性弱得多。
表V各種肽抗原決定基誘導CTL的輔助因子活性T輔助肽輔助肽的CTL應答最優劑量(mg/鼠) (△溶胞單位/E6細胞)- - 12+/-2OVA323-336 100 50+/-5HBV核心128-140 100 35+/-10965.10 5 307+/-55比溶胞率為按實施例10中所述計算而得。給出的是兩個獨立試驗的代表性數據。
提供以上實施例是為了說明本發明而不是限定其範圍。本發明的其它改變形式對本專業的一般技術人員來說是顯而易見的，並被包含在所附的權利要求中。本文引用的所有出版物、專利和專利公開均被引作參考。
權利要求
1.一種組合物，其特徵在於，它含有一種由2個D-胺基酸和11個L-胺基酸構成的肽，所述肽由氨基端向羧基端的結構式為R1-R2-R3-R4-R5，其中R1是一個D-胺基酸，其後是丙氨酸或賴氨酸；R2選自環己基丙氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸；R3是3或4個胺基酸，其中每個胺基酸各自選自丙氨酸、異亮氨酸、絲氨酸和纈氨酸；R4選自蘇氨酸-亮氨酸-賴氨酸、賴氨酸-蘇氨酸和色氨酸-蘇氨酸-亮氨酸-賴氨酸；R5由2或4個胺基酸構成，其後為一個D-胺基酸，其中2或4個胺基酸中的每一個各自選自丙氨酸、絲氨酸和纈氨酸。
2.根據權利要求1所述的組合物，其特徵還在於，其中R1是一個D-丙氨酸，其後是丙氨酸或賴氨酸；R2是環己基丙氨酸或苯丙氨酸；R3是3或4個胺基酸，其中每個胺基酸各自選自丙氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；R5由2或4個丙氨酸構成，其後為一個D-丙氨酸。
3.根據權利要求2所述的組合物，其特徵還在於，其中的肽選自aAXAAAKTAAAAa、aAXAAAATLKAAa、aAXVAAATLKA-Aa、aAXIAAATLKAAa、aKXVAAWTLKAAa和aKF-VAAWTLKAAa，其中的a是D-丙氨酸，A是丙氨酸，X是環己基丙氨酸，K是賴氨酸，T是蘇氨酸，L是亮氨酸，V是纈氨酸，I是異亮氨酸，W是色氨酸，F是苯丙氨酸。
4.一種藥物組合物，其特徵在於，它含有一種藥用載體和根據權利要求1所述的肽。
5.一種含有CTL誘導肽和T輔助肽的組合物，其特徵在於，其中的T輔助肽是根據權利要求1所述的肽。
6.根據權利要求5所述的組合物，其特徵還在於，其中的CTL誘導肽是乙醯化、軟胎醯化或用某種脂肪酸醯化的。
7.根據權利要求5所述的組合物，其特徵還在於，其中的CTL誘導肽與T輔助肽連接而形成CTL/T輔助肽複合物。
8.根據權利要求7所述的組合物，其特徵還在於，其中的CTL/T輔助肽複合物被連接在某種載體上。
9.根據權利要求6所述的組合物，其特徵還在於，其中的CTL誘導肽通過一間隔分子與T輔助肽連接。
10.根據權利要求9所述的組合物，其特徵還在於，其中的間隔基是Ala-Ala-Ala。
11.一種抑制病人體內T細胞活化作用的方法，其特徵在於，該方法包括給病人使用治療有效量的藥物組合物，該組合物含有藥用載體和由約4至20個殘基構成的肽，該肽能結合MHC分子上由DR位點的基本上所有等位基因編碼的抗原結合位置。
12.根據權利要求11所述的方法，其特徵還在於，其中的肽是根據權利要求1所述的肽。
13.根據權利要求11所述的方法，其特徵還在於，其中的肽是根據權利要求3所述的肽。
14.一種在病人體內誘導激活T細胞克隆的方法，其特徵在於，該方法包括給病人使用治療有效量的藥物組合物，該組合物含有由藥用載體和由約4至20個殘基構成的肽，該肽能結合MHC分子上由DR位點的幾乎所有等位基因編碼的抗原結合位置。
15.根據權利要求14所述的方法，其特徵還在於，其中的肽與CTL誘導肽結合。
16.根據權利要求14所述的方法，其特徵還在於，其中的肽是根據權利要求1所述的肽。
17.根據權利要求14所述的方法，其特徵還在於，其中的肽是根據權利要求3所述的肽。
全文摘要
本發明提供了在病人體內抑制或誘導T細胞活化作用的組合物和方法。方法包括給病人使用治療有效量的藥物組合物，該組合物含有藥用載體和由約4至20個殘基構成的肽，該肽能結合MHC分子上DR位點的等位基因編碼的幾乎所有抗原結合位置。這些肽被稱為泛DR結合肽。可將這種泛DR結合肽用於抑制與自身免疫、同種移植排斥反應和變應性應答等免疫病理有關的免疫應答。這種肽也可與CTL肽組合使用以強化CTL應答。
文檔編號C07K14/00GK1135181SQ94194128
公開日1996年11月6日 申請日期1994年9月14日 優先權日1993年9月14日
發明者A·塞特, F·C·A·加埃塔, H·M·格雷, J·雪梨, J·L·亞利山大 申請人:Cytel有限公司