提高案件微量檢材脫落細胞dna提取效率的方法及試劑的製作方法

2023-06-10 22:58:41 1

專利名稱：提高案件微量檢材脫落細胞dna提取效率的方法及試劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及案件微量檢材脫落細胞DNA高效提取的方法及試劑，屬於法醫物證 DNA檢測領域。
背景技術：
自從PCR技術應用到生物物證的檢驗，尤其是應用STR基因座進行分析後，DNA提取便成為法醫DNA多態性分析的關鍵環節，DNA樣品質量的好壞將直接關係到後續實驗的成敗。但在實際檢案中，越來越多的案件由於案件本身性質、作案過程及犯罪分子的反偵察意識增強等因素的作用，在一些現場勘查中，很難發現血斑、精斑、毛髮、菸頭等常規生物檢材，因此可能載有人體案件微量檢材的檢材就成為案件偵破的重要物證。人體案件微量檢材量微，且多為角質化，細胞核多已退化，附著在與人體接觸的各種載體上。其載體具有如下特點①微量表皮細胞等檢材大面積分布在載體表面且與載體、 汙物結合緊密，難以收集轉移；②保存時間過長或不當，DNA易降解難以滿足16個STR位點多重PCR複合擴增(一個管內16個模板同時擴增)；③此類檢材載體多經洗滌，含PCR抑制物。因此，案件微量檢材DNA的提取難度大，缺乏穩定的提取方法，容易導致檢案失敗。目前，根據案件微量檢材的量與其所在載體的差異，DNA提取的方法也不同。衣帽、 鞋、襪子等人體接觸面較大、可能含有的案件微量檢材較多的檢材，多通過案件微量檢材吸收儀收集檢材的案件微量檢材後，用自動化工作站或chelex-100法提取，可通過延長孵化時間、增加蛋白酶K的量、減少洗脫體積等方法，以達到提高DNA模板濃度的目的。而當遇到各種工具的木質柄，如斧子的木質柄、各類載體上的指紋，如杯蓋上的指印等人體接觸部位較少、載體對案件微量檢材吸附性較強的檢材時，檢驗人員一般都是根據自己的提取經驗採取不同的提取的方法，但往往都是多種試劑盒的交叉使用和多種提取方法的混合應用。 如用Chelex-100和蛋白酶K孵育幾個小時後經Microcon-IOO純化柱純化濃縮DNA ；或用其他試劑盒如QIAGEN M48磁珠試劑盒提取DNA模板，有的還將有機法中氯仿純化步驟運用其中。這些方法提取的DNA量少、純度低、長度不完整，不但要用價格昂貴的進口試劑，而且步驟繁瑣、耗時較長、操作複雜、個人經驗影響較大，成功率比較低。本發明人優化裂解、結合體系發明提高案件微量檢材DNA提取效率的方法及試劑，解決DNA提取過程中遇到的以上問題，並成功應用於實際檢案。

發明內容
本發明要解決的技術問題是，系統優化裂解、結合、清洗體系解決案件檢材中只含有微量DNA的提取難題，實現簡便、快速，高效地提取微量DNA。經過不同條件組合、系列對比試驗及大量現場案件檢材試驗，我們發現①蛋白酶消化、70-100溫浴、PEG-乙醇磁珠結合液三點的有機結合能夠高效提取微量DNA ；②蛋白酶消化、溫浴處理能夠高效釋放脫落細胞DNA，結構完整，在PEG-乙醇體系中易與磁珠結合； ③PEG-乙醇結合體系的使用不僅促進磁珠對DNA的高效吸附，而且保證了 DNA結構相對完整，獲得長度合適DNA片段能夠滿足案件檢測中16個STR位點複合擴增的需要。試劑提取案件微量檢材DNA既能夠減少成本，簡便操作，無需多種試劑盒和多種方法的交叉使用，而且靈敏度高，方法簡單，減少了對技術人員經驗的依賴，實現了案件檢測成功率的提升。本發明提供了一種提取案件微量檢材DNA的試劑，其組成為磁珠懸液；裂解液，其組成為pH = 8. 0的Tris-HCl緩衝液；結合液I，其組成為20-50% w/v的PEG，PEG的MW = 8000 ；結合液II，其組成為乙醇；清洗液，其組成為50-80% ν/ν的乙醇溶液。本發明所述的結合液II可用甲醇及丙醇、異丙醇中的一種替換乙醇。本發明方法可以簡便高效地從微量案件檢材提取到DNA。本發明所述的微量案件檢材為案件現場遺留的含有微量案件微量檢材的生物檢材。本發明所述的轉移好案件微量檢材的載體為用生物細胞提取儀吸附案件現場遺留的衣物、繩索、電線、木棍等所得到的濾膜。本發明所述的轉移好案件微量檢材的載體為用案件微量檢材粘取器、透明膠帶粘取現場遺留的衣物、繩索、電線、木棍、瓶口、各種把手或手柄、玻璃或桌面等上的指紋等所得到的膠膜或透明膠帶。本發明所述的轉移好案件微量檢材的載體為濾紙、棉籤、紗線等檫拭現場遺留的衣物、繩索、電線、木棍、瓶口、各種把手或手柄、玻璃或桌面等上的指紋等所得到的濾紙、棉籤、紗線等。用於本發明的裂解液、結合液I、結合液II、清洗液沒有特別限制，可以為本領域所採用的裂解液、結合液I、結合液II、清洗液。本發明的主要優點在於1.本發明方法結合蛋白酶消化、70-100度溫浴能夠充分裂解案件微量檢材脫落細胞，釋放的DNA結構相對完整，在PEG-乙醇體系中易與磁珠結合且；2.試劑組成中PEG-乙醇結合液的存在不但能更好地去除蛋白質，而且磁珠在吸附DNA時能夠充分分散於結合液中，實現了磁珠對結合液中DNA的高效吸附；3. PEG-乙醇結合液的使用使提取到的DNA長度適合，能夠滿足案件檢測中16個 STR位點複合擴增的需要，極大減少丟峰、擴增不平衡現象。4.該提取方法減少了對操作者經驗的依賴性，操作簡便，穩定性好；5.無需使用苯酚、氯仿等毒性大的有機溶劑，安全性好；6.靈敏度高，提取快速，一般操作可在1 1. 5個小時完成，且可用於自動化工作站的DNA提取。


圖1案件現場遺留的皮帶提取的微量DNA的複合STR擴增圖譜。圖21 μ L經60倍稀釋新鮮血液提取的DNA複合STR擴增圖譜。圖31 μ L經60倍稀釋新鮮血液，對照實驗2提取DNA複合STR擴增圖譜。圖41 μ L經60倍稀釋新鮮血液，對照實驗3提取DNA複合STR擴增圖譜。圖51 μ L經60倍稀釋新鮮血液，對照實驗4提取DNA複合STR擴增圖譜。圖61 μ L經60倍稀釋新鮮血液，對照實驗5提取DNA複合STR擴增圖譜。
圖71 μ L經60倍稀釋新鮮血液，對照實驗6提取DNA複合STR擴增圖譜。圖81 μ L經60倍稀釋新鮮血液，對照實驗7提取DNA複合STR擴增圖譜。
圖91 μ L經60倍稀釋新鮮血液，對照實驗8提取DNA複合STR擴增圖譜。圖10為案件現場遺留的拖鞋，用甲醇替換結合液II的複合STR擴增圖譜。圖11為案件現場遺留的牙刷，用丙醇替換結合液II的複合STR擴增圖譜。圖12為案件現場遺留的喝水用的瓷杯，用異丙醇替換結合液II的複合STR擴增圖譜。
具體實施例方式實施例一提取案件現場遺留的皮帶扣上的微量DNA。(一 )試劑盒準備製備利用磁珠提取案件微量檢材DNA的試劑盒，其中包括ImL矽烷化磁珠溶液(0. Img/ μ L)，武漢哇哇噻納技術開發有限公司上市產品或 Qiagen公司購買；IOOmL裂解液，其組分為pH = 8. 0的1Tris-HCl緩衝液；IOOmL結合液I，其組分體積比為20-50%的PEG (分子量8000)；20mL結合液II，其組分為乙醇；IOOmL清洗液，其組分為體積比為80%的乙醇溶液。(二)利用試劑盒提取案件現場遺留的皮帶扣脫落細胞DNA，提取步驟如下1)利用案件微量檢材粘取器反覆粘皮帶扣多次，將膠膜放入1. 5mL離心管；2)加入6yL蛋白酶K(10mg/mL)、350yL裂解液，漩渦震蕩2秒鐘，放置孵育器56 度孵育40分鐘；3)將離心管自孵育器取下，漩渦震蕩2秒鐘，放置孵育器70-100度孵育8分鐘後， 13000轉離心3分鐘，上清轉移至另一 1. 5mL離心管；4)加入400 μ L結合液Ι、80 μ L結合液II和20 μ L磁珠懸液，漩渦震蕩2秒鐘，放置室溫10分鐘；5)將離心管至於磁力架上2分鐘，吸棄上清留磁珠，加入300 μ L清洗液，漩渦震蕩 2秒鐘，放置室溫2分鐘；6)重複步驟4兩次；7)將離心管至於磁力架上2分鐘，吸棄上清留磁珠，離心管打開並放置室溫5分鐘；8)加入30 μ L超純水，漩渦震蕩2秒鐘，放置孵育器80度孵育10分鐘，中間混勻磁珠2次，將離心管置於磁力架，所得上清即為DNA溶液。(三)PCR擴增及電泳擴增試劑盒為ABI公司的sinofiler試劑盒擴增程序如下95 0C Ilmin ^ 94 0C 1: OOmin
共 28 個循環 ^ 59°C 1 00min
72 °C 1: OOmin
60 °C 60min
4 °C oo電泳設備為ABI公司的3100型測序儀上樣體系2 μ L擴增產物+20 μ L甲醯胺(已加Liz)其他步驟嚴格按照3100型測序儀說明書進行操作。圖1為提取該案件現場遺留皮帶DNA的檢測結果，16個STR位點完整，峰高均在 200以上，符合案件檢測對16個STR位點分析的要求，進一步說明了本試劑和本方法的在提取微量案件檢測DNA時具有很大優勢。實施例二對照實驗以1 μ L經60倍生理鹽水稀釋的血液為模擬樣本，取代實施例一脫落細胞膠膜，擴增及電泳同實施例一，設計微量樣本提取系列對照試驗如下對照試驗1提取步驟1)中膠膜被1 μ L模擬樣本替換，其他步驟不變；對照試驗2步驟2)中未加蛋白酶，其他同對照試驗1 ；對照試驗3步驟3)中孵育溫度不足70度，其他同試驗1 ；對照試驗4步驟4)中結合液體系中除去乙醇，其他同試驗1 ；對照試驗5步驟4)中結合液體系中除去PEG，其他同試驗1 ；對照試驗6經過步驟1)、2)、3)，上清用Qiagen M48磁珠試劑盒提取DNA ；對照試驗7未經過步驟1)、2)、3)，用M48磁珠試劑提取DNA ；對照試驗8經過步驟1)、2)、3，上清改用Microcon-IOO純化柱純化濃縮DNA。經以上實驗提取到的DNA溶液均用ABI公司的ID試劑盒以4 μ L模板+6 μ LMix 的體系進行多重PCR複合擴增，並以相同的體系和條件進行電泳檢測，所得結果如圖2-圖 9所示。其中，圖2為系列對照試驗1的結果16個STR位點完整，峰高均在800以上，符合案件檢測對16個STR位點分析的要求，說明脫落細胞DNA經過蛋白酶消化、溫浴處理後能夠高效釋放出來，在PEG-乙醇結合體系中高效吸附在磁珠表面。圖3為系列對照試驗2 的結果=CSFlPO位點的峰已丟失，D12S391和D3S1350位點的峰有高有底，擴增不平衡現象明顯，D7S820和D18S51位點多了一個峰，即有雜峰，這些都嚴重影響對檢測結果的分型，不符合案件檢測對16個STR位點分析的要求，試驗說明脫落細胞未經蛋白酶消化，DNA釋放不完全或斷裂。圖4為系列對照試驗3的結果小片段效果較好如D8S1179和D19S433位點峰均出，大片度的峰太低，在50以下如D7S820，並且有雜峰現象如D13S317位點，說明在 PEG-乙醇體系中DNA結合磁珠效率差，對照試驗2和3說明蛋白酶消化、70-100度溫浴細胞高效釋放DNA，DNA結構穩定，在PEG-乙醇體系中利於與磁珠結合。圖5為系列對照試驗 4的結果16個位點均未出，圖6為系列對照試驗5的結果，只出了位點D8S1179、D5S818、vffA和D8S1043，但峰在100以下，D8S1043有雜峰現象，不符合案件檢測對16個STR位點分析的要求，對照試驗4和5說明結合液體系中必須同時存在乙醇和PEG，保證DNA與磁珠結合效率高，DNA結構相對完整，獲得長度合適DNA片段能夠滿足案件檢測中16個STR位點複合擴增的需要。圖7為系列對照試驗6的結果，圖8為系列對照試驗7的結果，二者結果相差不大，16個位點均未出，峰高在200以下，並且雜峰也比較多，影響結果的判讀，不符合案件檢測對16個STR位點分析的要求，圖9為系列對照試驗8的結果，同圖6相似，只出了 6個位點的峰，峰高比較低。丟峰表明要麼DNA結構已破壞要麼DNA提取量低，不能獲得足量、長度合適滿足16個STR位點擴增的DNA。試驗7說明胍鹽磁珠(M48試劑)結合體系可能破壞的DNA結構或者結合效率低下。試驗6、8說明樣品經蛋白酶消化、70-100度溫浴 DNA高效釋放後，PEG-乙醇磁珠結合體系不僅高效吸附DNA而且保證了 DNA結構穩定，優於胍鹽磁珠(M 48試劑)結合體系及胍鹽純化柱結合體系(Microcon-100試劑)——這兩種體系為微量檢材DNA提取常用試劑。綜上8個系列對照試驗的結果對比可知，用本發明的試劑和方法提取到的DNA溶液能獲得完整的STR分型，且STR峰高均在200以上，而當裂解條件和結合體系發生變化時，均未獲得完整的STR分型，已出的峰峰值基本在200以下。實施例三結合液II的乙醇換成甲醇及丙醇、異丙醇將實施例一中結合液II的乙醇分別換成甲醇及丙醇、異丙醇，用磁珠法分別提取現場案件中的拖鞋、牙刷、喝水用的瓷杯上的DNA ；除提取步驟3中的80 μ L結合液II分別換成80 μ L甲醇及丙醇、異丙醇外，其他操作同實施例一。圖10為案件現場遺留的拖鞋，用甲醇替換結合液II的複合STR擴增圖譜；圖11 為案件現場遺留的牙刷，用丙醇替換結合液II的複合STR擴增圖譜；圖12為案件現場遺留的喝水用的瓷杯，用異丙醇替換結合液II的複合STR。由圖10、圖11、圖12可知結合液 II的乙醇分別換成甲醇、丙醇及異丙醇後，經相同方法提取案件現場生物檢材的檢測結果均為16個STR位點完整，峰高均在200以上，符合案件檢測對16個STR位點分析的要求， 說明該提取方法及本試劑盒中的結合II可用甲醇、丙醇及異丙醇替換。參考文獻1.辛軍平等，醫學難檢樣品的處理及檢測方法研究，刑事技術，2001，6。2.王琴等，DNA-STR分型檢驗人體案件微量檢材2例，刑事技術，2004，5。3.王琴等，人體案件微量檢材的螢光標記STR分型，法律與醫學雜誌，2004， IKDo4.張慶霞等，提取痕量檢材DNA破獲兇殺案1例，法醫學雜誌，2007，2，1(23)。5.王玉健等，衣帽上案件微量檢材微量DNA檢測方案初探，刑事技術，2007，2。6.張志超等，磁性二氧化矽微球的表面修飾及其在植物基因組核酸純化中的應用，分析化學研究報告，2007，1 (35)。7.叢憲玲等，採用二氧化矽微球法回收DNA的實驗研究，中國免疫學雜誌，2005， 5。
權利要求
1.提高脫落細胞DNA提取效率的方法，其特徵在於包括如下步驟，用蛋白酶處理包含脫落細胞的樣品，然後70-100度孵育經處理的樣品，離心取樣品上清，在PEG-乙醇結合緩衝體系中讓上清中的DNA與磁珠結合，分離並獲取DNA。
2.權利要求1所述的方法，其特徵在於，樣品先經56度孵育後再在70-100度孵育3 8分鐘。
3.權利要求1所述的方法，其特徵在於，PEG-乙醇結合緩衝體系中PEG的濃度為 20-50% w/vo
4.權利要求1所述的方法，其中乙醇可以用甲醇、丙醇或異丙醇替代。
5.權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的磁珠經矽烷化處理。
6.一種用於實施權利要求1所述方法的試劑盒，其特徵在於，該試劑盒中的試劑包括磁珠懸液、裂解液、結合液I、結合液II和清洗液，其中，裂解液組成為PH = 8. 0的 Tris-HCl, pH = 8. 0、50-80mmol/L 的 EDTA ；結合液 I 組成為 20-50% w/v 的 PEG，PEG 的 MW =8000 ；結合液II組成為乙醇；清洗液組成為50-80% ν/ν的乙醇溶液。
7.權利要求6所述的試劑盒，其特徵在於各試劑組成既包括其濃縮液，又包括其稀釋液。
8.權利要求6所述的試劑盒，其特徵在於結合液I、結合液II可在一個試劑瓶混合包裝。
9.權利要求6所述的試劑盒，其特徵在於結合液II為甲醇、丙醇或異丙醇。
10.一種利用權利要求1所述的方法提取案件微量檢材DNA的方法，其特徵在於按以下步驟進行1)將已轉移好的可能含有脫落細胞的載體置於離心管，並加入裂解液和蛋白酶，漩渦震蕩混勻，離心管置於孵育器上56度孵育40 60分鐘；2)離心管漩渦震蕩混勻，置於孵育器上70-100度孵育3 8分鐘後，13000轉離心3 分鐘；3)轉移上清，加入磁珠懸液、結合液I和結合液II，吹打混勻，形成固液均相分散的懸濁液；4)磁力架將吸附了DNA的磁珠從固液均相分散的懸濁液中分離出；5)清洗液洗滌吸附有DNA的磁珠2-3次，將磁珠上的雜質洗去；6)超純水解吸附磁珠上的DNA，獲得純的濃縮的DNA溶液。
全文摘要
本發明涉及一種提高案件微量檢材脫落細胞DNA提取效率的方法及試劑。案件檢材量微、細胞角質化以及16個STR位點多重PCR複合擴增等問題，使得脫落細胞DNA提取一直是法醫學中的難點。經研究發現蛋白酶消化、70-100度溫浴、PEG-乙醇磁珠結合體系三點的組合能夠高效提取微量DNA，獲得長度合適DNA片段能夠滿足案件檢測中16個STR位點複合擴增的需要，實現了案件檢測成功率的提升。蛋白酶消化、溫浴使得脫落細胞高效釋放DNA，結構相對完整，在PEG-乙醇體系中易與磁珠結合。PEG-乙醇結合體系的使用不僅促進磁珠對DNA的高效吸附，而且保證了DNA結構相對完整，獲得長度合適DNA片段能夠滿足案件檢測中16個STR位點複合擴增的需要。
文檔編號C12N15/10GK102229927SQ201110148869
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月3日 優先權日2011年6月3日
發明者李紅閃, 聶稜, 趙煥生 申請人:武漢哇哇噻納技術開發有限公司