利用解鏈特徵圖譜檢測多重螢光pcr產物的方法及產品的製作方法

2023-06-10 21:46:36 3

專利名稱：利用解鏈特徵圖譜檢測多重螢光pcr產物的方法及產品的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學檢測領域，涉及一種利用解鏈特徵圖譜檢測多重螢光PCR產 物的方法及其產品，該方法可以在一個螢光定量PCR反應中同時檢測多個螢光PCR擴 增的基因產物。更具體的說，該方法利用不同目的基因片段在解鏈過程中生成的不同的 解鏈特徵圖譜，運用螢光定量PCR方法，針對多個基因同時進行檢測。
背景技術：
聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)技術發明至今已近20年了，在這 期間技術得到了不斷的發展，近年來出現的實時螢光定量PCR(real-time quantitative PCR) 技術實現了PCR從定性到定量的飛躍，它以其特異性強、靈敏度高、重複性好、定量準 確、速度快、全封閉反應等優點成為了分子生物學研究中的重要工具。
所謂實時螢光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入螢光基團，利用螢光信 號累積實時監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。 在實時螢光定量PCR技術的發展過程中，兩個重要的發現起著關鍵的作用(l)在卯 年代早期，TaqDNA多聚酶的5'核酸外切酶活性的發現，它能降解特異性螢光記探針， 因此使得間接的檢測PCR產物成為可能。(2)此後螢光雙標記探針的運用使在一密閉的 反應管中能實時地監測反應全過程。這兩個發現的結合以及相應的儀器和試劑的商品化 發展導致real-time Q-PCR方法在研究工作中的運用。
目前實時螢光定量PCR所使用的螢光化學方法主要有五種，分別是DNA結合染 色，水解探針，分子信標，螢光標記引物，雜交探針。它們又可分為擴增序列特異和非 特異的檢測兩大類。
螢光定量PCR技術融合了 PCR和DNA探針雜交技術的優點，直接探測PCR過程 中螢光信號的變化，使PCR的擴增及其分析在同一封閉的系統下完成，具有特異性好、 靈敏度高(是常規PCR的100倍以上)、假陽性低、操作簡單、交叉汙染機會少、不汙 染環境(不需要使用EB)等優點，因此其應用範圍很廣泛，包括mRNA表達的研究、 DNA拷貝數的檢測、單核苷酸多態性(SNPs)的測定等。目前研究的熱點有
1.1微小殘留病變的檢測 腫瘤疾病尤其是血液的惡性腫瘤常伴有特異性基因的易位，這種易位往往可以作為監測臨床治療效果的一種腫瘤標誌。雖然在過去的幾十年 裡治療方案的改進已大大地延長了病人的生存期，但是緩解期的病人仍存在復發的危險 性。因此微小殘留病變(MRD)的檢測對於進一步調整治療方案是至關重要的。螢光定 量PCR的應用正成為檢測腫瘤微小殘留分子標誌的一種必備的研究工具。通過對腫瘤融 合基因的定量測定能指導臨床對病人實行個體化的治療。急性粒細胞性白血病(AML) 最常見的染色體異常是交互易位t(8; 21)(q22; q22)，在這易位中，AML-1轉錄因子基因 和8號染色體的MTG8基因發生融合，致使正常的AML-1轉錄調控受到影響，這可能是 白血病的病因。目前的研究證明用螢光定量PCR來檢測融合基因有助於對這些病人的 MRD進行定量，其作為預後的指標或對治療方案的評估是有價值的。同樣的方法也被用 於定量其它的易位融合基因水平，如慢性粒細胞性白血病(CML)的BCR-ABL融合基 因；急性淋巴細胞性白血病(ALL)的白血病特異的TEL-AML1融合基因；濾泡狀淋巴 瘤(FL)的染色體易位t(14;18)(q32;q21)和bcl-2重排等。許多研究都在很大程度上受益 於螢光定量PCR方法的應用，隨著技術的發展，螢光定量PCR的運用將不斷地擴大。
1.2細胞因子的表達分析 細胞因子是調節蛋白，它通過調節免疫反應(包括淋巴 細胞活化、增殖、分化、生存和凋亡)在免疫系統中起著核心作用。許多不同類型的細 胞都能分泌這種低分子量的蛋白質，其中包括淋巴細胞、抗原遞呈細胞、單核細胞、內 皮細胞和成纖維細胞。細胞因子可被分為不同的組；白介素(IL-l IL-23)，幹擾素(IFN-a， IFNl等)，集落刺激因子(CSF)，腫瘤壞死因子(TNF)，腫瘤生長因子(TGF-(3等) 和化學因子(MCP-1， MIP-1等)。為了闡明在許多炎症反應，自身免疫性疾病和器官 移植排異中的免疫致病途徑，細胞因子mRNA表達譜的可靠定量是很重要的。儘管被檢 樣本中細胞因子含量往往極低，然而real-time反轉靈PCR(RT-PCR)以其高敏感性和準 確性在細胞因子的定量中越來越受到青睞。
1.3腫瘤耐藥基因表達的研究 對化療藥物的耐藥是治療腫瘤病人的主要障礙。由 於耐藥限制了許多腫瘤的成功治療，因此研究腫瘤細胞對耐藥機制就變得十分重要。目 前研究中發現主要的耐藥機制有ATP結合盒基因超家族(ATP-binding cassette superfamily)的膜轉運蛋白介導的耐藥，這些蛋白包括MDR-1基因編碼的P-糖蛋白
(P-gp)，多藥耐藥相關蛋白(MRP)，肺耐藥相關蛋白(LRP)，乳腺癌耐藥蛋白(BCRP) 等；酶介導的耐藥，包括拓撲導構酶(Topo)，穀胱甘肽(GSH)及穀胱甘肽-S-轉移酶
(GST)，蛋白激酶C (PKC)，脫氧胞嘧啶核苷激酶(deoxycytidine kinase)等，凋亡基因介導的耐藥，如bcl-2家族，p53基因，c-myc等。多藥耐藥(MDR)是多因素，多 種機制共同作用的結果。real-time反轉錄PCR (RT-PCR)是了解腫瘤耐藥，指導臨床治 療策略的有用手段，它能觀測用藥前後及復發時腫瘤細胞的耐藥基因mRNA表達變化， 從而及時調整治療方案和評價疾病的預後。
1.4病毒感染的定量監測 擴增技術的發展使得對病毒的定性或定量檢測的能力 隨之提高，也使研究病毒的負荷和疾病進展的關係成為可能。螢光定量PCR是主要被運 用於科研和診斷領域的擴增技術，它不僅能對病毒定性，而且由於其實驗的批間和批內 差異小，重複性好，因此能方便、快速、靈敏、準確地定量病毒DNA或RNA的序列， 更重要的是從中可以動態地研究在整個病程中潛在病毒的復活或持續，從而使臨床醫生 和病毒學家能檢測臨床的變化，如抗病毒治療的效果，耐藥變異的出現等。目前運用較 多的是在器官移值中對使用免疫抑制劑的病人用Real-time Q-PCR來定量測定CMV感 染。研究表明在骨髓移植的病人中用螢光定量PCR檢測CMV感染比傳統的pp65抗原試 驗更敏感，抗CMV藥物治療能使血中的病毒含量下降，螢光定量PCR對於快速定量骨 移植病人的CMV感染和監測CMV復活是一個有用的工具。
1.5基因表達研究 由於TaqMan系統及螢光探針的應用，對mRNA的檢測顯得較 以前常用的方法如Northern印跡、RT-PCR定量法要方便、快速、準確得多。為了探測 骨髓基質血小板生成因子(TPO)在巨核細胞生成過程中的作用以及血小板生成因子在 特發性血小板減少性紫瘢(ITP)、再生障礙性貧血(AA)和特發性血小板多症(ET) 等疾病過程中的病理生理意義，日本Hirayama等用TaqMan EZ RT-PCR試劑盒在 ABI7700反應系統測定了正常人和ITP、 AA、 ET病人的骨髓基質細胞TPO mRNA水平， 又用ELISA方法測定了骨髓和末梢血的TPO濃度。結果顯示ITP和AA病人TPO mRNA 水平明顯升高，而ET病人的TPO mRNA水平則正常，經類固醇治療後ITP病人TPO mRNA水平下降；骨髓TPO的濃度與其mRNA水平有相關性；在正常人和ITP病人， TPO mRNA表達水平與巨核細胞計數也有相關性。這個實驗對闡明TPO的作用提供了 依據。日本Shimokawa等也用FQ-PCR技術對鼠成肌細胞系C2C12中肌肉調節因子的表 達水平及動態變化進行了研究。
1.6免疫組份分析對免疫T細胞群體V-p組份進行分析是研究健康和疾病免疫應 答反應的重要手段，可通過流式細胞法或RFQ-PCR法來進行。流式細胞法是通過對細胞 群體進行直接而方便的V-p表達方面的研究，但需要一整套單克隆抗體和大量細胞來進行染色分析，而且人類v-p特異性抗體尚不完備，因此該方法有許多不便之處。如果用 FQ-PCR方法，即不需要大量細胞，引物設計也很方便，而且已有多種定量方法，包括錨 式PCR法、半定量PCR法、競爭性PCR法等，但都因PCR產物的後處理過程需凝膠電 泳、EB染色和光密度測量等既費時，又降低了準確性，還增加了汙染機會，使得FQ-PCR 的應用受到限制。1997年Lang等用FQ-PCR技術進行實驗，從而避免了這些問題，他們 在反應系統中引入螢光探針，將下遊引物與探針固定，然後，針對不同的v-p成份，選 用特異的上遊引物進行擴增，再對反應中產生的螢光信號進行處理，即可獲得各個成份 的數據。
1.7基因突變及多態性的研究 美國Ibrahim等1997用FQ-PCR技術對正常痘病毒 多態性進行了研究。他們採用一對可與正常痘病毒血凝素基因的某一 DNA片段結合的引 物，並設計兩個有單核苷酸差異的寡核苷酸探針，用螢光標記後進行實驗，順利地把有 此單核苷酸差異的兩個痘病毒株進行鑑定。該技術也可用於猴痘和病毒DNA疫苗的單核
苷酸變異多態的研究。
1.8其他方面 日本Isono利用FQ-PCR進行葉綠體成熟度與其基因組拷貝數關係 的研究。他們以核基因Cab作為內參照，進行葉綠體基因rbcl拷貝數測定，結果發現子 葉出現以後，葉綠體基因拷貝數顯著增加，進而把葉綠體的基因拷貝數增加與光誘導的 葉綠體成熟過程聯繫起來。1998年美國ffiggins等還建立起一套用螢光探針檢測鼠疫纖 溶酶原激活基因(pla)的實驗方法。
但是，在螢光定量PCR技術中，無論是相對定量還是標準曲線定量方法仍存在一些 PCR定量方法均有的問題有待解決。在標準曲線定量中，標準品的製備是一個必不可少 的過程。目前由於無一統一標準，各個實驗室所用的生成標準曲線的樣品各不相同，致 使實驗結果缺乏可比性。此外，用螢光定量PCR來研究mRNA時，受到不同RNA樣本 存在不同的逆轉錄(RT)效率的限制。在相對定量中，其前提是假設內源控制物不受實 驗條件的影響的，合理地選擇合適的不受實驗條件影響的內源控制物也是實驗結果可靠 與否的關鍵。另外，與傳統的PCR技術相比，螢光定量PCR的不足之處是(1)由於 運用了封閉的檢測，減少了擴增後電泳的檢測步驟，因此也就不能監測擴增產物的大小； (2)需要用不同的螢光素來標記不同的探針，而Real-timePCR中螢光的發射光譜是很 難實現對不同螢光探針的區分，因此相對地限制了螢光定量PCR的對多個基因檢測的應 用能力；(3)目前螢光定量PCR實驗成本比較高，從而也限制了其廣泛的應用。針對螢光定量PCR的優缺點，近年來又發展了多重螢光PCR技術。多重螢光PCR 是在同一反應體系中加入多個引物對和探針，同時檢測多個目的基因的方法，該方法可 以方便的進行一管多檢，從而達到省時省力的目的。但是，多重螢光PCR技術仍然需要 引入探針，並且需要雜交過程，存在檢測成本高、操作繁瑣、檢測基因數目有限的缺點， 已經不能適應針對同一待檢樣品中同時檢測多個目的基因的需求。
因此，目前需要一種能結合多重螢光定量PCR技術的優點，同時又不需要探針的快 速PCR檢測法，以適應目前分子生物學檢測領域的多基因的快速鑑定的需要。

發明內容
為了克服現有技術的缺點，基於目前的螢光定量PCR分析多基因領域的迫切要求， 發明人根據在螢光定量PCR的引物擴增目的基因過程中所產生的解鏈特徵圖譜(strands dissociation characteristic spectrum, SDCS或dissociation characteristic spectrum, DCS), 與 陽性對照基因的解鏈特徵圖譜進行對比，以得出在單一體系中同時檢測多個基因而不需 要探針的技術。
因此，本發明的第一個目的是提供一種利用解鏈特徵圖譜以檢測多重螢光定量PCR 產物的試劑盒，其中包括待測基因模板，陽性對照基因，目的基因N的引物對，能結 合DNA雙鏈而不結合單鏈的螢光染料、PCR反應緩衝液，其中反應緩衝液含有MgCh、 dNTPs、DNA擴增聚合酶，引物濃度範圍為50-5000nM，目的基因N為2-10個目的基因， 優選2-7個，更優選3-5個。
在一個實施方案中，所述的螢光染料是能結合DNA雙鏈而不結合單鏈的螢光染料， 優選是Beyond Green I螢光染料。
在另一個實施方案中，如果需要，還包含用於擴增內參基因(即內源性的參照基因) 的引物。其中，內參基因優選微管蛋白基因、肌動蛋白基因、糖酵解酶系基因或核糖體 蛋白基因。
在一個具體實施方案中，所述的待測基因模板可以是來自同一基因組的模板，也可
以是來自多個基因組的模板，優選來自2-3個基因組的模板。
在另一個具體實施方案中，如果需要，所述的試劑盒還包含產品說明書。 在另一個具體實施方案中，如果涉及cDNA的擴增產物，則反應緩衝液含有MgCh、
dNTPs、反轉錄酶、DNA聚合酶。本發明的第二個目的是提供一種利用上述試劑盒，通過解鏈特徵圖譜檢測螢光定量 PCR反應產物的方法，包括
(1) 根據待測的多個目的基因序列分別設計多對引物；
(2) 配製包含雙鏈DNA特異性的螢光染料的多重螢光PCR擴增的反應體系；
(3) 在反應體系中，用步驟(l)的多對引物同時分別擴增多個目的基因，擴增同時設立 陽性對照；
(4) 記錄待測樣本和陽性對照螢光定量PCR的解鏈特徵圖譜，並通過相互比較以判 斷待測樣本中的目的基因；
其中，所述的解鏈特徵圖譜是PCR反應完成後，將反應液從6(TC緩慢升溫至100°C， 升溫速率為0.2 °C/s ,每升高0.2 'C連續記錄螢光值的變化，最終將溫度的變化與螢光 值的變化求負倒數(-dF/dT)後對溫度作圖，可得到擴增產物的解鏈特徵圖譜，其中所述的 螢光值表示每50%量的DNA雙鏈發生解鏈後所測定的螢光讀數值；和
其中判定標準為將待測基因的解鏈特徵圖譜與陽性樣本的解鏈特徵圖譜作比較， 根據特徵峰判定待測基因是否是陽性樣本所對應的目的基因產物。
在一個方案中，其中所述的螢光值表示每50%量的DNA雙鏈發生解鏈後所測定的熒 光讀數值；所述的判斷標準為檢測陽性對照樣本，調整每組引物(目的基因和/或內參 基因的引物)在多重PCR反應中的濃度，使每個待測基因在螢光定量PCR反應的解鏈 特徵圖譜中的峰高與內參的峰高基本一致，以該引物濃度進行待測樣品的多重螢光降落 PCR擴增，將所得的解鏈特徵圖譜與陽性樣本的解鏈特徵圖譜作比較，出現了哪個特徵 峰就判定為存在陽性樣本所對應的目的基因產物。
在一個具體實施方案中，PCR擴增的反應條件優選是95'C預變性5min，然後95'C， 30s; 64°C， 30s; 68°C， 30s， 35個循環。
在另一個具體實施方案中，所述的染料是能結合DNA雙鏈而不結合單鏈的螢光染 料，優選是l x Beyond Green I (1: IO，OOO)(購自毅新興業(北京)科技有限公司，產品 目錄號BY-FG-01)。
在另一個具體實施方案中，該螢光的激發光源優選為96個綠色發光二極體(LED)， 激發範圍是470-505nm，螢光檢測器採用光電倍增管(PMT)，靈敏度極高。
在另一個具體實施方案中，多重螢光降落PCR擴增基因序列的反應體系為 待測物 模板 0.5^1正向引物 IN 反向引物
正向引物 1^1 反向引物
正向引物 1^1 反向引物
反應緩衝液 11.25pl 水 補足至25或50^1
其中，弓l物濃度範圍為50-5000nM，目的基因N為2-10個目的基因，優選2-7個， 更優選3-5個。其中當N》3時，反應體系為50nl (甚至10(HU)。
在另一個具體實施方案中，所述的目的基因選自轉基因生物(GMO)中的基因(如經 濟作物中的轉基因、食品中的轉基因)、經濟作物或食品中的多致病菌基因、細胞因子 基因、表達的mRNA、抗藥或耐藥基因、多SNP、疾病或病毒的多個特徵基因等等。其 中，目的基因可以是來自同一基因組，也可以來自不同的基因組。
還在一個具體實施方案中，所述的目的基因是大鼠視網膜組織中SAP97和 alpha-CaMKII基因，所述的內參基因是大鼠P-actin基因，所述的引物分別是SAP97-F/R、 CaMKII-F/R: GGACGGGTTGATGGTCAGCAT、 Rat actin beta-F/R。
還在另一個具體實施方案中，所述的目的基因是玉米Maximizer 176中的外源基因 crylA(b)( 75bp)、玉米BTll中的外源基因crylA(b)(75bp)、玉米MON810中的外源基因 P-35S和hsp70 intron的聯合片段(280bp)，所述的引物分別是玉米Maximizer 176-F/R、玉 米BtllF/R、玉米MON810-F/R。
目的基因l 目的基因2 目的基因N
定義
術語"螢光值"表示每50%的DNA雙鏈發生解鏈後所測定的螢光讀數值，該螢光優選 的激發光源為96個綠色發光二極體(LED)，激發範圍是470-505nm,螢光檢測器採用 光電倍增管(PMT)，靈敏度極高。
術語"解鏈特徵圖譜，，(strands dissociation characteristic spectrum, SDCS或dissociation characteristic spectrum, DCS),表示當每升高0.2 。C記錄螢光值，最終將溫度的變化與螢光 值的變化求負倒數後對溫度作圖。由於不同目的基因具有特徵性解鏈螢光值溫度，因此只要這些溫度之間具有一定溫度差(例如大於3-30°C，優選大於3-l(TC，更優選3-5'C)， 就能得到該目的基因的特徵峰值。將多個目的基因同時進行檢測，則得到區分度或置信 度好的峰值圖。
術語"螢光染料"是一種非特異性的結合於雙鏈DNA小溝的染料，最大吸收波長約為 497nm，最大發射波長約為520nm。該螢光染料，與雜交探針比較，不需要設計特定的 序列，其檢測原理是螢光染料與雙鏈DNA結合後，其螢光強度大大增強。在PCR反 應體系中加入過量螢光染料，螢光染料特異性地摻入DNA雙鏈後，發射螢光信號，而不 摻入鏈中的染料分子螢光信號極弱，從而保證螢光信號的增加與PCR產物的增加完全同 步。因此，本發明可使用已有的螢光染料，例如1 x Beyond Green I ( 1: 10,000)(毅 新興業(北京)科技有限公司，產品目錄號BY-FG-01)。
術語"內參基因"，又名內源性的參照基因，其和引物的作用在於檢測多個目的基 因(N為2-10，優選3-5)時，通過內參基因及其引物消除體系中的背景或噪音，以確定 目的基因的引物具體濃度。 一旦已經確定了待測基因數目和引物的合適濃度後，反應體 系中可不包括內參基因的引物。 一般而言，內參基因選自與目的基因具有相同基因組來 源的持家基因(house-keepinggene)，由於內參基因與目的基因都來自同一總基因組，因此 目的基因的擴增模板也是內參基因的模板。另外，如果內參基因與目的基因分屬於不同 的基因組，但因為內參基因屬於所有細胞中均要表達的一類基因，其產物是對維持細胞 基本生命活動所必需的基因(如微管蛋白基因、肌動蛋白基因、糖酵解酶系基因與核糖 體蛋白基因等)，因此，來自不同基因組的目的基因的擴增模板，同樣也可作為內參基 因的模板。通過將內參基因與目的基因同時進行平行擴增，以消除反應的抑制劑和確保 樣品中靶基因的成功擴增；另外，在定量分析中，內參基因也可用來估計樣品中耙基因 的總量，因此其作用在於確定體系中的引物濃度、估計靶基因總量、優化反應條件。
有益效果
與傳統的多重螢光定量PCR相比，本發明的創新點在於同時檢測多個基因過程中無 需設計多個探針，通過利用不同目的基因片段的序列不同因而其擴增的解鏈特徵圖譜不 同這個特性，通過比較待測樣本與陽性標本的解鏈特徵圖譜來判斷待測基因的有無。本 發明具有操作簡便、重複性高、交叉汙染少等優點。
相比於傳統的方法，本發明具有成本低(無需合成多個探針)、耗時短(可在一次反應中檢測2-10個基因)、結果分析簡單便捷(只需對照陽性樣本的解鏈特徵圖譜即可 判斷目的基因的有無)、應用領域極其廣泛的優點。
因此，本發明可檢測轉基因生物(GMO)中的基因(轉入經濟作物中或轉基因食品中 的篩選基因、標記基因)、經濟作物或食品中的多致病菌基因、細胞因子基因、表達的 mRNA、抗藥或耐藥基因、多SNP、疾病或病毒的多個特徵基因等等。相比於傳統的方 法，具有成本低(無需合成多個探針)、耗時短(可在一次反應中檢測2-10個基因)、 結果分析簡單便捷(只需對照陽性樣本的解鏈特徵圖譜即可判斷目的基因的有無)、應 用領域極其廣泛的優點。今後必將在疾病檢測和各種病原檢測中得到更加廣泛的應用。


圖1-5:檢測大鼠視網膜組織中SAP97和alpha-CaMKII基因的解鏈特徵圖譜，其中X軸 表示解鏈溫度，Y軸表示螢光值，特徵峰值表示對應擴增產物的解鏈溫度。 圖6:用於驗證多重螢光PCR的解鏈特徵圖譜的凝膠電泳結果，其中泳道1-5為Yl-Y5 反應體系，泳道M (Marker)為分辯率為lOObp的分子量標記(自上向下依次是600bp、 500bp、 400bp、 300bp、 200bp、 100bp)。
圖7:檢測轉基因玉米Maximizer176、 BTll、 MON810中外源基因或標記基因的解鏈特 徵圖譜，其中X軸表示解鏈溫度，Y軸表示螢光值，特徵峰值表示對應擴增產物的解鏈 溫度。
具體實施例方式
現在僅用參考下面非限制性的實施例的方式進一步描述本發明。但是應當理解，下 面的實施例僅僅是作為例證的，不應以任何方式當作對上述本發明總體的限制。
實施例一 檢測大鼠視網膜組織中SAP97和alpha-CaMKII基因的表達
實驗材料所用的螢光染料購自lx BEYOND Green I ( 1:10,000 )(毅新興業(北京)
科技有限公司)；反應緩衝液(內含MgCh、 dNTPs、 DNA高保真擴增聚合酶等)。
實驗步驟
(一)、根據《分子克隆實驗指南》第3版(薩姆布魯克著，金冬雁譯，科學出版社)的方法以從大鼠視網膜組織中提取RNA，經逆轉錄後生成的cDNA為模版。其中，為了優化 反應條件，以大鼠P-actin為內參基因。
(二) 、設計引物信息
SAP97-F: CCCTCCACACCACAGGCAAAT SAP97-R: GCAGCTGCTCCTCCCGTGATAAT CaMKII-F: GGCCTGTGGCGTCATCCTGTAT CaMKII-R: GGACGGGTTGATGGTCAGCAT 內參基因(Rat actin beta) F: 5-cacccgcgagtacaaccttc-3 內參基因(Rat actin beta) R: 5-cccatacccaccatcacacc陽3
(三) 反應體系參見表1，其中設計5個內參引物的濃度梯度Yl-Y5，從中選取最適引物組。
表l:反應體系
待測基因Y10U)Y寧)Y30tl)Y，)Y5⑨
cDNA模板0.50.50.50.50.5
SAP97正向引物11110
反向引物11110
CaMKII正向引物11110
反向引物11110
內參正向引物0.250.50.7511
反向引物0.250.50.7511
反應緩衝液11.2511.2511.2511.2511.25
水補齊至總量2525252525
(四)、反應條件為
95 。C 5min
(95°C 30s64。C 30s 68°C30sPlate read) 35cycles 60°C-100'C每升高0.2 1:記錄一次螢光值生成的解鏈特徵圖譜。(五)、實驗結果及分析
1、 螢光PCR結果分析
1) 圖1所示，Yl內參引物終濃度為50nM，其他引物為200nM，解鏈特徵圖譜出三個 峰。其中84。C表示SAP97的解鏈特徵峰，86.6。C為alpha-CaMKII解鏈特徵峰，91.8°C 為內參基因大鼠l3-actin的解鏈特徵峰(下同)，這三個峰值95%置信區間無重疊， 特徵峰清晰，並且內參引物優勢不明顯。
2) 圖2所示，Y2內參引物終濃度為100nM，其他引物為200nM，解鏈特徵圖譜出三 個峰，三個峰值95%置信區間無重疊，特徵峰清晰，但內參引物峰佔優勢，較為不 適宜採用該檢測體系。
3) 圖3所示，Y3內參引物終濃度為150nM,其他引物為200nM,解鏈特徵圖譜出三 個峰，但內參引物峰佔優勢，並且84'C的峰值已經不明顯，已經不適合採用該檢測 體系。
4) 圖4所示，Y4內參引物終濃度為200nM,其他引物為200nM，解鏈特徵圖譜只有 內參基因大鼠P-actin的91.8'C峰值的較為明顯，並且待測基因SAP97和CaMKII置 信區間重疊，無特徵峰，這表明內參佔絕對優勢，己經不適合採用該檢測體系。
5) 圖5所示，Y5隻有內參基因大鼠p-actin及其引物，這清晰顯示91.8'C峰值為內參基 因的特徵峰。Y5用於作為內參對照，並驗證cDNA。
因此，從上確定最適合的反應體系為Y1。
2、 電泳檢測結果分析
將上述PCR產物，按照常規方法進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。其中泳道1-5為表1中的 Yl-Y5反應體系，泳道M(Marker)為分辯率100bp的分子量標記(自上向下依次是600bp、 500bp、 400bp、 300bp、 200bp、 100bp)， SAP97是227bp、大鼠p-actin是207bp 、 CaMKII 是181bp，因此中間條帶為內參大鼠|3-actin。 如圖6所示
1) Yl泳道內三條待測基因清晰可見，分別為227bp的SAP97、 207bp的大鼠p-actin、 181bp的CaMKII。電泳結果表明使用Yl體系進行多重螢光PCR，能夠有效檢測出 待測基因SAP97、 CaMKII和內參基因大鼠(3-actin。
2) Y2泳道內，內參基因佔優勢，並且CaMKII已經不明顯，內參抑制作用開始增強。3) Y3泳道內，內參基因佔優勢，並且CaMKII和SAP97不明顯，表明內參抑制作用更 為增強，該體系已經不適合用於檢測。
4) Y4泳道內，內參基因佔絕對優勢，並且沒有CaMKII和SAP97，表明該體系已經不 適合用於檢測。
5) Y5泳道為內參對照泳道，只有內參引物，做對比，驗證cDNA。
因此，作為螢光PCR的結果驗證，電泳結果分析證實通過解鏈特徵圖譜所確定的 Yl體系中的引物濃度比例為最適引物濃度。
實施例二轉基因玉米Maximizer176、 BTll、 MON810的檢測
為了檢測玉米中是否含有外源的轉基因，使用本方法對多種玉米種屬的外源標記基 因或篩選基因同時進行多重螢光PCR檢測。
實驗材料所用的螢光染料購自1 x BEYOND Green I ( 1:10,000 )(毅新興業(北 京)科技有限公司)；反應緩衝液(內含MgCl 2、 dNTPs、 1.5U AmpliTaq Gold DNA polymerase、 0.3U的AmpEraseUNG酶等)。
(一) 、基因組DNA的提取
基因組DNA用cetyltrimethy lammonium bromide的方法從O.lg植物組織中分離得 至!j; DNA濃度用Gene-Quant RNA/DNA Calculator ( Amersh咖Pharmacia Biotech Europe GmbH， Freiburg, Germany )測得，並經瓊脂糖凝膠電泳和EB染色與已知的 lambda phage標準品比較而進一步確認。
(二) 、設計引物信息
玉米Maximizer 176-f: GTG GAC AGC CTG GAC GAG AT 玉米Maximizer 176-r: TGC TGA AGC CAC TGC GGA AC 用於擴增外源的目的基因crylA(b)，共75bp。
玉米Btl 1 -f: TCC TTG TCC TTG ACA CAG TTT CTG 玉米Btll-r: GATGTC ACTAGTCCGAGAACGAA 用於擴增外源的目的基因crylA(b)，共75bp。由於上述兩端引物擴增crylA(b)基因的不同序列，因此解鏈特徵圖譜不同於玉米 Maximizer 176的外源的目的基因crylA(b)。
玉米MON810-f: TGA TGT GAT ATC TCC ACT GACG 玉米MON810-r: CGG CAA GTA ATC AGC ACA G
用於擴增外源的目的基因P-35S和hsp70 intron兩個基因連接的一段，共280bp。 (三)、反應體系參見表2:
表2反應體系
待測基因引物Oil)
玉米Maximizer的crylA(b)正向引物(150nM)2
反向引物(150nM)2
玉米Btll的crylA(b)正向引物(50nM)2
反向引物(50nM)2
玉米MON810的P-35S和hsp70 intron正向引物(200nM)2
反向引物(150nM)2
反應緩衝液33
水補齊至總量50
(四) 、反應條件為
95 。C 5min
(95°C 30s64°C 30s 68。C30sPlate read) 35cycles 60°C-100°C每升高0.2 1:記錄一次螢光值生成的解鏈特徵圖譜。
(五) 、實驗結果及分析
如圖所示，用Maximizer 176、Btll和MON810特異性PCR體系做三重PCR反應， 解鏈特徵圖譜出三個峰。其中76.9。C表示MON80的解鏈特徵峰，85.2t:表示Btl 1的解 鏈特徵峰，88.9'C表示Maximizer176的解鏈特徵峰，其相應的擴增片段的解鏈溫度分別 相差8.3卩、3.7 °C和12 °C, 95%置信區間無重疊。因此，在表2的適當引物濃度下，完全可以清晰的區分各特異性擴增片段的解鏈特徵峰，說明這種技術也可用於三重PCR 反應。
綜合實施例l-2，相比於傳統的方法，本發明具有成本低(無需合成多個探針)、耗 時短(可在一次反應中檢測2-10個基因)、結果分析簡單便捷(只需對照陽性樣本的解 鏈特徵圖譜即可判斷目的基因的有無)、應用領域極其廣泛的優點。
權利要求
1.一種利用解鏈特徵圖譜以檢測多重螢光定量PCR產物的試劑盒，包含待測基因模板、陽性對照基因、目的基因N的引物對、能結合DNA雙鏈而不結合單鏈的螢光染料、PCR反應緩衝液；其中反應緩衝液含有MgCl2、dNTPs、DNA擴增聚合酶；目的基因N為2-10個目的基因。
2. 權利要求l的試劑盒，其中目的基因N為2-7個，更優選3-5個。
3. 權利要求1或2的試劑盒，其中所述的螢光染料是Beyond Green I螢光染料。
4. 權利要求3的試劑盒，其中還包含用於擴增內參基因的引物對，所述的內參基因選自 微管蛋白基因、肌動蛋白基因、糖酵解酶系基因或核糖體蛋白基因。
5. 權利要求3的試劑盒，用於擴增cDNA的反應緩衝液含有MgCl2、 dNTPs、反轉錄酶、 DNA聚合酶。
6. 利用前述的試劑盒，通過解鏈特徵圖譜檢測螢光定量PCR反應產物的方法，包括(1) 根據待測的目的基因序列分別設計引物；(2) 配製包含雙鏈DNA特異性的螢光染料的多重螢光PCR擴增的反應體系；(3) 在反應體系中，用步驟(l)的引物同時分別擴增目的基因，擴增同時設立陽性對照;(4) 記錄待測樣本基因和陽性對照的螢光定量PCR的解鏈特徵圖譜，並通過相互比 較以判斷待測樣本中的目的基因；其中，所述的解鏈特徵圖譜是PCR反應完成後，將反應液從6(TC緩慢升溫至IO(TC， 升溫速率為0.2 °C/s ，每升高0.2 'C連續記錄螢光值的變化，最終將溫度的變化與螢光 值的變化求負倒數(-dF/dT)後對溫度作圖，可得到擴增產物的解鏈特徵圖譜；和判定標準為將待測基因的解鏈特徵圖譜與陽性樣本的解鏈特徵圖譜作比較，根據 特徵峰判定待測基因是否為陽性樣本所對應的目的基因產物。
7. 權利要求6的方法，其中PCR擴增的反應條件優選是95'C預變性5min，然後95'C， 30s; 64。C， 30s; 68°C， 30s， 35個循環。
8. 權利要求6或7的方法，其中所述的目的基因選自轉基因生物(GMO)中的基因(轉入 經濟作物中或轉基因食品中的篩選基因、標記基因)、經濟作物或食品中的多致病菌基 因、細胞因子基因、表達的mRNA、抗藥或耐藥基因、SNP、疾病或病毒的多個特徵基 因等等。其中，目的基因可以是來自同一基因組，也可以來自不同的基因組。
9. 權利要求8的方法，其中所述的目的基因是大鼠視網膜組織中SAP97和alpha-CaMKII基因，所述的內參基因是大鼠l3-actin基因，所述的引物分別是SAP97-F/R、 CaMKII-F/R: GGACGGGTTGATGGTCAGCAT、 Rat actin beta-F/R。
10.權利要求8的方法，其中所述的目的基因是玉米Maximizer 176中的外源基因 crylA(b)(75bp)、玉米BT11中的外源基因crylA(b)(75bp)、玉米MON810中的外源基因 P-35S和hsp70in加n的聯合片段(280bp)，所述的引物分別是玉米Maximizer 176-F/R、玉 米BtllF/R、玉米MON810-F/R。
全文摘要
本發明提供一種利用不同目的基因片段具有不同的解鏈特徵圖譜、通過螢光定量PCR同時檢測多個基因的方法，包括根據待測的多個目的基因序列分別設計多對引物；配製包含雙鏈DNA特異性的螢光染料的多重螢光PCR擴增的反應體系；在反應體系中，用多對引物同時分別擴增多個目的基因，擴增同時設立陽性對照；記錄待測樣本和陽性對照螢光定量PCR的解鏈特徵圖譜，並通過將待測基因的解鏈特徵圖譜與陽性樣本的解鏈特徵圖譜作比較，根據解鏈特徵峰判定待測基因是否是陽性樣本所對應的目的基因產物。同時提供利用該方法的檢測試劑盒。本發明能同時檢測2-10個目的基因，並具有成本低、無需合成探針、耗時短、結果分析簡單便捷、應用領域極其廣泛的優點。
文檔編號G01N21/64GK101603094SQ20091015826
公開日2009年12月16日 申請日期2009年7月23日 優先權日2009年7月23日
發明者晶 任, 李賢禎, 馬慶偉 申請人:毅新興業(北京)科技有限公司