預測肝癌術後生存的實時定量pcr微陣列晶片試劑盒的製作方法
2023-06-10 10:52:31 1
專利名稱：預測肝癌術後生存的實時定量pcr微陣列晶片試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種預測肝癌術後生存的實時定量PCR微陣列晶片試劑盒，屬於診斷試劑技術領域。
背景技術：
原發性肝癌(以下簡稱肝癌)是全球最常見的惡性腫瘤之一，在中國肝癌的發病率為腫瘤發病率的第三位，其死亡率為第二位。手術切除仍是其最主要的治療方法，但術後長期生存尚不能令人滿意。術後預後的準確評估，可以使一部分病人得到及時的輔助治療， 從而延長術後生存。目前研究認為腫瘤發生及進展是一個多因素，多步驟參與並相互作用的複雜過程，涉及癌細胞本身及其與癌周微環境和宿主免疫狀態間的相互作用，但其確切機制尚不清楚，近年來癌周微環境在腫瘤發生及進展中的作用成為腫瘤研究的熱點。目前常用的預後預測標記包括腫瘤分期和組織病理學指標。其中組織病理學指標往往不能提供足夠的預後信息，而腫瘤分期，如TNM分期，雖是目前最常用的腫瘤預後標記，但對腫瘤術後復發的預測尚顯不足。
發明內容
本發明的目的是提供一種預測肝癌術後生存的實時定量PCR微陣列晶片試劑盒， 用於對術後肝癌患者生存預後風險進行準確的預測和評估，對高風險患者進行重點監測和有效幹預，改善患者預後。為了達到上述目的，本發明提供了一種預測肝癌術後生存的實時定量PCR微陣列晶片試劑盒，其特徵在於，包括IL6基因擴增引物及螢光標記探針、HLA_DRA基因擴增引物及螢光標記探針、CSFl基因擴增引物及螢光標記探針、SPPl基因擴增引物及螢光標記探針以及TNF基因擴增引物及螢光標記探針。所述的IL6基因擴增引物序列正義鏈為GCGGCTACATCTTTGGAATCT、擴增引物序列反義鏈為TTCGGTCCAGTTGCCTTCTC、螢光標記探針序列為CCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTC 所述的HLA_DRA基因擴增引物序列正義鏈為CATTTCGAAGCCACGTGACA、 擴增引物序列反義鏈為CACAAACAGCCCTGTGGAAC、螢光標記探針序列為 TGAGAGAGCCCAACGTCCTCATCTG。所述的CSFl基因擴增引物序列正義鏈為CGAGGAGGTGTCGGAGTACTGT、擴增引物序列反義鏈為TTGGCACGAGGTCTCCATCT、螢光標記探針序列為CCACATGATTGGGAGTGGACACCT。所述的SPPl基因擴增引物序列正義鏈為TCGCAGACCTGACATCCAGT、擴增引物序列反義鏈為GGCCTTGTATGCACCATTCA、螢光標記探針序列為TGCTACAGACGAGGACATCACCTCAC。
所述的TNF基因擴增弓丨物序列正義鏈為GCTCCGTGTCTCAAGGAAGTCT、擴增弓丨物序列反義鏈為GCCAGAATGCTGCAGGACT、螢光標記探針序列為CAGAATGCTGCAGGACTTGA。
優選地，所述的預測肝癌術後生存的實時定量PCR微陣列晶片試劑盒中還包括反轉錄系統、擴增系統和384微孔板組成。所述的反轉錄系統由5X反轉錄體系緩衝液、反轉錄酶、脫氧核糖核酸混合物以及隨機的6核苷酸引物組成。所述的擴增系統由含Taq酶的信使核糖核酸表達定量檢測混合液組成。本發明的優點為
1、本發明發現了 IL6基因、HLA_DRA基因、CSFl基因、SPPl基因以及TNF基因可以作為標誌物來預測肝癌術後生存率，並提供了一個預測模型，經過大樣本量獨立驗證，證明該預測模型可對肝癌患者轉移潛能進行準確的預測和評估，從而可對患者術後生存進行準確的預測，將有助於早期識別或預測高危患者，對其進行重點檢測和有效幹預，為臨床個體化幹預治療提供有效的依據。2、本發明提供了相應的試劑盒及螢光標記探針和引物，通過實時定量PCR微陣列晶片技術對原發性肝癌病人術後的組織mRNA水平的檢測，具有高通量、高敏感性和高均一性等特徵。相對於晶片技術或者分子雜交(Northern Blot)，該方法簡便、快速且經濟實用。
圖1為肝癌轉移預測模型對380例行根治性切除術的肝癌患者無瘤生存預測分析結果圖。
具體實施例方式下面結合實施例和附圖來具體說明本發明。 實施例1、一種預測肝癌術後生存的實時定量PCR微陣列晶片試劑盒，由以下試劑組成
(1)反轉錄系統由5X反轉錄體系緩衝液、反轉錄酶、脫氧核糖核酸混合物以及隨機的6核苷酸引物組成。所用試劑組分來源於I^rimeScript RT reagent kit perfect Real time反轉錄試劑盒(Takara公司生產，型號DDR037A)；
(2)擴增系統由含Taq酶的信使核糖核酸(mRNA)表達定量檢測混合液(Applied Biosystems 公司生產，型號TaqMan Gene expression Master mix 4369016)組成；
(3)384微孔板；
(4 ) IL6基因、HLA_DRA基因、CSF1基因、SPP1基因以及TNF基因的擴增引物和Taqman 螢光標記探針混合液，溶劑為DEPC (焦碳酸二乙酯)處理過的水，引物和探針的具體序列如下
權利要求
1.一種預測肝癌術後生存的實時定量PCR微陣列晶片試劑盒，其特徵在於，包括IL6基因擴增引物及螢光標記探針、HLA_DRA基因擴增引物及螢光標記探針、CSFl基因擴增引物及螢光標記探針、SPPl基因擴增引物及螢光標記探針以及TNF基因擴增引物及螢光標記探針。
2.如權利要求1所述的預測肝癌術後生存的實時定量PCR微陣列晶片試劑盒，其特徵在於，所述的IL6基因擴增引物序列正義鏈為GCGGCTACATCTTTGGAATCT、擴增引物序列反義鏈為TTCGGTCCAGTTGCCTTCTC、螢光標記探針序列為CCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTC
3.如權利要求1所述的預測肝癌術後生存的實時定量PCR微陣列晶片試劑盒，其特徵在於，所述的HLA_DRA基因擴增引物序列正義鏈為CATTTCGAAGCCACGTGACA、擴增引物序列反義鏈為CACAAACAGCCCTGTGGAAC、螢光標記探針序列為TGAGAGAGCCCAACGTCCTCATCTG。
4.如權利要求1所述的預測肝癌術後生存的實時定量PCR微陣列晶片試劑盒，其特徵在於，所述的CSFl基因擴增引物序列正義鏈為CGAGGAGGTGTCGGAGTACTGT、擴增引物序列反義鏈為TTGGCACGAGGTCTCCATCT、螢光標記探針序列為CCACATGATTGGGAGTGGACACCT。
5.如權利要求1所述的預測肝癌術後生存的實時定量PCR微陣列晶片試劑盒，其特徵在於，所述的SPPl基因擴增引物序列正義鏈為TCGCAGACCTGACATCCAGT、擴增引物序列反義鏈為GGCCTTGTATGCACCATTCA、螢光標記探針序列為TGCTACAGACGAGGACATCACCTCAC。
6.如權利要求1所述的預測肝癌術後生存的實時定量PCR微陣列晶片試劑盒，其特徵在於，所述的TNF基因擴增引物序列正義鏈為GCTCCGTGTCTCAAGGAAGTCT、擴增引物序列反義鏈為GCCAGAATGCTGCAGGACT、螢光標記探針序列為CAGAATGCTGCAGGACTTGA。
7.如權利要求1所述的預測肝癌術後生存的實時定量PCR微陣列晶片試劑盒，其特徵在於，還包括反轉錄系統、擴增系統和384微孔板組成。
8.如權利要求7所述的預測肝癌術後生存的實時定量PCR微陣列晶片試劑盒，其特徵在於，所述的反轉錄系統由5X反轉錄體系緩衝液、反轉錄酶、脫氧核糖核酸混合物以及隨機的6核苷酸引物組成。
9.如權利要求7所述的預測肝癌術後生存的實時定量PCR微陣列晶片試劑盒，其特徵在於，所述的擴增系統由含Taq酶的信使核糖核酸表達定量檢測混合液組成。
全文摘要
本發明涉及一種預測肝癌術後生存的實時定量PCR微陣列晶片試劑盒，其特徵在於，包括IL6基因擴增引物及螢光標記探針、HLA_DRA基因擴增引物及螢光標記探針、CSF1基因擴增引物及螢光標記探針、SPP1基因擴增引物及螢光標記探針以及TNF基因擴增引物及螢光標記探針。本發明發現了IL6基因、HLA_DRA基因、CSF1基因、SPP1基因以及TNF基因可以作為標誌物來預測肝癌術後生存率，並提供了相應的試劑盒，通過實時定量PCR微陣列晶片技術對原發性肝癌病人術後的組織mRNA水平的檢測，具有高通量、高敏感性和高均一性等優點。
文檔編號C12Q1/68GK102191323SQ20111009107
公開日2011年9月21日 申請日期2011年4月12日 優先權日2011年4月12日
發明者葉青海, 周海君, 周闖, 張曉飛, 王冠, 董瓊珠, 賈戶亮, 鄭燕, 欽倫秀 申請人:復旦大學附屬中山醫院