預測肝癌術後轉移與復發的實時pcr微陣列晶片試劑盒的製作方法
2023-06-10 10:52:36
專利名稱：預測肝癌術後轉移與復發的實時pcr微陣列晶片試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種預測肝癌術後轉移與復發的實時PCR微陣列晶片試劑盒，屬於診斷試劑技術領域。
背景技術：
原發性肝細胞癌(簡稱肝癌)是世界上最常見、惡性程度最高的腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發病率第5位、死因第3位；每年新發病564，000例，死亡M9，000例，我國佔其中一半以上，是我國惡性腫瘤中第2位的殺手。手術是目前肝癌主要的治療手段，然而術後高轉移與復發率(5年復發率達70%，小肝癌也達50%)已成為進一步提高遠期療效的瓶頸，也是攻克肝癌的重要關鍵。近年來，肝癌轉移與復發研究備受關注，雖有所進展，但仍存在許多問題。如何及早、準確地預測肝癌的轉移潛能是困擾臨床的一大難題。根據復旦大學肝癌研究所研究發現伴轉移肝癌與不伴轉移肝癌之間存在153個顯著差異基因，基於此在國際上首次建立了能正確預測病人有無肝內轉移的多分子預測模型，可將20例(100%)建立模型標本進行準確分類，經小樣本驗證，可以準確預測另外20例待測標本中的至少18例， 預測準確率達90% (Nat Med 2003)。本發明對上述研究進行了大樣本獨立驗證得到優化的預測模型，可對肝癌轉移潛能進行準確預測，從而能對根治術後肝癌患者轉移、復發風險進行準確的預測和評估，對高風險患者進行重點監測和有效幹預，減少復發、轉移，進一步改善患者預後。
發明內容
本發明的目的是提供一種預測肝癌術後轉移與復發的實時PCR微陣列晶片試劑盒，用於對肝癌術後患者轉移與復發風險進行預測和風險評估，對高風險患者進行重點監測並指導術後治療，進一步降低術後轉移與復發，改善患者預後。為了達到上述目的，本發明提供了一種預測肝癌術後轉移與復發的實時PCR微陣列晶片試劑盒，其特徵在於，包括CXCLlO基因擴增引物及螢光標記探針、FKBPlO基因擴增引物及螢光標記探針、ASPH基因擴增引物及螢光標記探針、SPP2基因擴增引物及螢光標記探針和EN02基因擴增引物及螢光標記探針。所述的CXCLlO基因的擴增引物序列正義鏈為TGATGCAGGTACAGCGTACAGT， 擴增引物序列反義鏈為TCCAGTCTCAGCACCATGAATC，螢光標記探針序列為 CTGCCATTCTGATTTGCTGCCTTAT。所述的FKBPlO基因的擴增引物序列正義鏈為CGACTTTGTCCGCTACCACTAC，擴增引物序列反義鏈為ACCAGAGCCGACGTAGGTGT，螢光標記探針序列為CACCCTGCTGGACGGCACCTC。所述的ASPH基因的擴增引物序列正義鏈為CTGTCTGAGCGACGCTTCAA，擴增引物序列反義鏈為 GGAGCCATCGAGACCTACCA，螢光標記探針序列為 AGGTGGCCAGCCTACCTGATGTCC。所述的SPP2基因的擴增引物序列正義鏈為CCGGCACAGAGCAAGAATAA，擴增引物序列反義鏈為 AAGCAGCAGCTCCTTGAACA，螢光標記探針序列為 TTGAGTAACGGCCTTGAGGTGTCCC。所述的EN02基因的擴增引物序列正義鏈為CCAACTCCAGCATCAGGTTGT，擴增引物序列反義鏈為 TGAAGGCAGTGGACCACATC，螢光標記探針序列為 AACTCCACCATCGCGCCAGCC。優選地，所述的試劑盒中還包括反轉錄系統、擴增系統和384微孔板組成。所述的反轉錄系統由5X反轉錄體系緩衝液、反轉錄酶、脫氧核糖核酸混合物以及隨機的6核苷酸引物組成。所述的擴增系統由含Taq酶的信使核糖核酸表達定量檢測混合液組成。本發明的優點為
(1)本發明發現了 CXCLlO基因、FKBPlO基因、ASPH基因、SPP2基因和EN02基因可以作為預測肝癌術後轉移與復發的標誌物，並給出了預測模型，該預測模型可對肝癌患者術後轉移與復發進行準確的預測和風險評估，將有助於早期識別或預測高危患者，對其進行重點檢測和有效幹預，為臨床個體化幹預治療提供有效的依據。(2)本發明提供了相應的試劑盒，通過實時定量PCR微陣列晶片技術對肝癌患者術中切除的癌組織進行mRNA水平的檢測，具有高通量、高敏感性和高均一性等特徵。相對於晶片技術或者分子雜交，該方法簡便、快速且經濟實用。(3)本發明的預測準確率明顯優於目前用於預測肝癌患者術後轉移與復發的臨床病理指標，如甲胎蛋白、腫瘤大小，包膜有無等。而且檢測的是患者手術切除下來的癌組織， 對患者沒有額外損傷。
圖1為肝癌轉移預測模型對380例行根治性切除術的肝癌患者生存預測分析結果圖。
具體實施例方式實施例1
一種預測肝癌術後轉移與復發的實時PCR微陣列晶片試劑盒，由以下試劑組成
(1)反轉錄系統由5X反轉錄體系緩衝液、反轉錄酶、脫氧核糖核酸混合物以及隨機的6核苷酸引物組成。所用試劑組分來源於I^rimeScript RT reagent kit perfect Real time反轉錄試劑盒(Takara公司生產，型號DDR037A)；
(2)擴增系統由含Taq酶的信使核糖核酸(mRNA)表達定量檢測混合液(Applied Biosystems 公司生產，型號TaqMan Gene expression Master mix 4369016)組成；
(3)384微孔板；
1 CXCL10基因、FKBP10基因、ASPH基因、SPP2基因和EN02基因的擴增引物和Taqman 螢光標記探針混合液，溶劑為DEPC (焦碳酸二乙酯)處理過的水，引物和探針的具體序列如下
權利要求
1.一種預測肝癌術後轉移與復發的實時PCR微陣列晶片試劑盒，其特徵在於，包括 CXCLlO基因擴增引物及螢光標記探針、FKBPlO基因擴增引物及螢光標記探針、ASPH基因擴增引物及螢光標記探針、SPP2基因擴增引物及螢光標記探針和EN02基因擴增引物及螢光標記探針。
2.如權利要求1所述的預測肝癌術後轉移與復發的實時PCR微陣列晶片試劑盒， 其特徵在於，所述的CXCL10基因的擴增引物序列正義鏈為TGATGCAGGTACAGCGTACAGT， 擴增引物序列反義鏈為TCCAGTCTCAGCACCATGAATC，螢光標記探針序列為 CTGCCATTCTGATTTGCTGCCTTAT。
3.如權利要求1所述的預測肝癌術後轉移與復發的實時PCR微陣列晶片試劑盒，其特徵在於，所述的FKBPlO基因的擴增引物序列正義鏈為CGACTTTGTCCGCTACCACTAC，擴增引物序列反義鏈為ACCAGAGCCGACGTAGGTGT，螢光標記探針序列為CACCCTGCTGGACGGCACCTC。
4.如權利要求1所述的預測肝癌術後轉移與復發的實時PCR微陣列晶片試劑盒，其特徵在於，所述的ASPH基因的擴增引物序列正義鏈為CTGTCTGAGCGACGCTTCAA，擴增引物序列反義鏈為 GGAGCCATCGAGACCTACCA，螢光標記探針序列為 AGGTGGCCAGCCTACCTGATGTCC。
5.如權利要求1所述的預測肝癌術後轉移與復發的實時PCR微陣列晶片試劑盒，其特徵在於，所述的SPP2基因的擴增引物序列正義鏈為CCGGCACAGAGCAAGAATAA，擴增引物序列反義鏈為 AAGCAGCAGCTCCTTGAACA，螢光標記探針序列為 TTGAGTAACGGCCTTGAGGTGTCCC。
6.如權利要求1所述的預測肝癌術後轉移與復發的實時PCR微陣列晶片試劑盒，其特徵在於，所述的EN02基因的擴增引物序列正義鏈為CCAACTCCAGCATCAGGTTGT，擴增引物序列反義鏈為 TGAAGGCAGTGGACCACATC，螢光標記探針序列為 AACTCCACCATCGCGCCAGCC。
7.如權利要求1所述的預測肝癌術後轉移與復發的實時PCR微陣列晶片試劑盒，其特徵在於，所述的試劑盒中還包括反轉錄系統、擴增系統和384微孔板組成。
8.如權利要求7所述的預測肝癌術後轉移與復發的實時PCR微陣列晶片試劑盒，其特徵在於，所述的反轉錄系統由5X反轉錄體系緩衝液、反轉錄酶、脫氧核糖核酸混合物以及隨機的6核苷酸引物組成。
9.如權利要求7所述的預測肝癌術後轉移與復發的實時PCR微陣列晶片試劑盒，其特徵在於，所述的擴增系統由含Taq酶的信使核糖核酸表達定量檢測混合液組成。
全文摘要
本發明提供了一種預測肝癌術後轉移與復發的實時PCR微陣列晶片試劑盒，其特徵在於，包括CXCL10基因擴增引物及螢光標記探針、FKBP10基因擴增引物及螢光標記探針、ASPH基因擴增引物及螢光標記探針、SPP2基因擴增引物及螢光標記探針和ENO2基因擴增引物及螢光標記探針。本發明發現了CXCL10基因、FKBP10基因、ASPH基因、SPP2基因和ENO2基因可以作為預測肝癌術後轉移與復發的標誌物，並提供了相應的試劑盒，通過實時定量PCR微陣列晶片技術對肝癌患者術中切除的癌組織進行mRNA水平的檢測，具有高通量、高敏感性和高均一性等優點。相對於晶片技術或者分子雜交，該方法簡便、快速且經濟實用。
文檔編號C12Q1/68GK102206710SQ20111009107
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月12日 優先權日2011年4月12日
發明者付麗雲, 葉青海, 周海君, 周闖, 張曉飛, 王冠, 董瓊珠, 賈戶亮, 欽倫秀 申請人:復旦大學附屬中山醫院