一種由川芎醇提物製備的含藥血清及其製備方法和應用與流程
2023-06-10 16:00:51
本發明屬於生物藥物領域，具體涉及一種由川芎醇提物製備的含藥血清及其製備方法和在治療骨肉瘤上的應用。
背景技術：
骨肉瘤是骨與關節系統腫瘤中最常見的骨原發惡性腫瘤。超過85％的骨肉瘤是原發性骨肉瘤，常發於兒童和青少年期，發病率約達6-10/100萬，男女發病比率約為1.5:1，其中近80-90％的骨肉瘤病發於四肢長管狀骨幹骺端。骨肉瘤源於間胚葉組織，它的發病機理是由於未分化的腫瘤細胞發生生物學形態的變化，直接形成骨樣或者未成熟的骨樣組織，直至目前其發生機理仍未完全清楚，關於骨肉瘤的研究仍未有很大的進展。因此，尋找能夠治療骨肉瘤的有效且副作用小的中西藥物成為學者們不懈努力的追求方向。隨著骨肉瘤的多發性，許多學者在中藥提取物對骨肉瘤細胞系體外培養生長的抑制作用以及對細胞周期、細胞凋亡、遷移能力的影響等方面作了很多的探索，為新的植物型藥物的發現和研製提供了線索，也為本發明提供了新的思路。
中藥是中華民族偉大文化遺產的瑰寶，它們在人類與疾病的鬥爭中扮演著至關重要的角色，並且在世界醫藥發展史上佔有著重要的地位。隨著科學技術的不斷發展，人們對中藥及中藥複方的認識和要求不斷提高，中藥及中藥複方的現代化發展已經迫在眉睫。中醫認為，癖滯貫穿於腫瘤的全病程，是惡性腫瘤發生及發展的最主要病因病機。根據中醫治療疾病辨證論治的原則，使用活血化癖藥治療惡性腫瘤應用較為廣泛。臨床中較常用的活血化癖藥物有川芎、丹參、大黃、紅花、三稜、川棘子、歸尾等，其中川芎的藥效極佳。川芎為傘形科藁本屬植物川芎(ligusticumchuanxionghort)的乾燥根莖，其主要的化學成分是川芎嗪、阿魏酸、蒿本內酯、川芎內酯、川芎酚、大黃酚、瑟丹酸、亞油酸、黑麥草鹼等。其性辛香行散味微苦，藥性溫和通血脈，上行頭顛，下走血海。川芎常被用於活血行氣，祛風止痛，以及治療頭痛，胸脅痛，經閉腹痛，風溼痛，跌打損傷等症。近年來，川芎在臨床上廣泛應用於治療冠心病、偏頭痛、缺血性腦中風等病症，尤其是在缺血性腦中風的治療中顯出了獨特優勢。已有研究證明川芎對肺癌、前列腺癌、腦腫瘤、潰瘍性結腸炎等疾病均有良好的治療效果。且經檢索發現，乙醇和乙醚是提取川芎有效成分常用的溶劑，乙醇因對有效成分的提取較完全而更為常用，是提取效果較佳的溶劑。因此本發明採取的提取川芎有效成分的方法為乙醇提取法。
近年來中藥血清藥理學的相關研究在中藥或中藥複方研究上有了新的進展，它主要是通過模擬中藥或中藥複方在體內的消化、吸收、轉化、代謝的一些過程，然後通過採集服用(或注射)中藥的動物的血液並分離血清，進行體外培養實驗研究的一種新的方法。中藥服用或注射的方法及簡稱如下：靜脈注射(iv)、腹腔注射(ip)、口服(po)、皮下注射(ih)、灌胃(ig)肌注(im)、靜滴(iv)等。這種實驗方法的提出，既可以在一定程度上排除中藥或中藥複方直接進行體外實驗產生的難以確定的因素幹擾，也可以使實驗結果的可信度大大提高，更重要的是中藥血清使療效更加顯著。張明輝等研究發現，經川芎、蘇木灌胃大鼠後處理得到的含藥血清在常氧環境下作用24h時能夠抑制pg人高轉移性巨細胞肺癌細胞的增殖，並且在低氧環境更有利於其促進pg細胞增殖。蘆衝等研究發現，經半枝蓮醇提物灌胃大鼠後獲得的含藥血清對ht-29人結腸癌細胞有抑制作用，作用機制可能不僅與抑制細胞生長有關，還與阻滯細胞生長周期及誘導細胞凋亡有關。範欽等研究發現，九香蟲灌胃大鼠後處理得到的含藥血清孵育sw480人結腸癌細胞，可促使結腸癌細胞凋亡，並影響凋亡相關因子p53、fadd的表達，從而達到抗腫瘤作用。豐俊東等研究發現，tmp(川芎嗪)鹽酸注射液ip注射大鼠後處理得到的含藥血清對人肝癌細胞hepg2增殖具有一定的抑制作用。目前常見的骨肉瘤細胞系有saos-2、mg-63、m663、u2-os、143b，hos、sosp-9607，f5m2、f4、mnng/hos、sw1353、umr106等。但暫未發現使用川芎製備的含藥血清對mg-63人成骨肉瘤細胞做相關研究的報導。
技術實現要素：
發明目的：針對現有技術存在的問題，本發明提供一種由川芎醇提物製備的含藥血清；該含藥血清可有效抑制骨肉瘤細胞的增殖、促進其凋亡、抑制其轉移。
本發明還提供一種由川芎醇提物製備的含藥血清的製備方法及其應用。
技術方案：為了實現上述目的，如本發明所述的一種由川芎醇提物製備的含藥血清，所述含藥血清為將川芎醇提物對大鼠進行灌胃後，採血得到。
其中，所述川芎醇提物為將川芎粉碎成粉末狀後加入乙醇回流提取，冷凍乾燥後粉碎所得的粉末狀固體。
所述所大鼠為清潔級sd雄性大鼠，大鼠購自揚州大學比較醫學中心，體重為250～400g。
本發明所述的由川芎醇提物製備的含藥血清的製備方法，包括如下步驟：
(1)給大鼠按體重比灌胃川芎醇提物(10-30)g/kg；
(2)末次灌胃後1-3h對大鼠進行麻醉，無菌條件下經腹主動脈採血；
(3)將血液靜置4-8h，離心，取上清，滅活後過濾除菌，得到含藥血清，分裝，凍存備用。
作為優選，步驟(1)所述灌胃為灌胃前禁食不禁水，每日2-3次，持續3-5d。
作為優選，步驟(3)所述離心為3000-5000rpm，4-6℃離心10-15min。
作為優選，步驟(3)所述滅活為56-60℃滅活25-30min。
作為優選，步驟(3)所述過濾除菌為通過濾膜過濾除菌，優選為0.22μm的濾膜。
本發明所述的由川芎醇提物製備的含藥血清在製備治療骨肉瘤的藥物中應用。
進一步地，所述由川芎醇提物製備的含藥血清在製備治療mg-63人成骨肉瘤細胞的藥物中應用。
有益效果：與現有技術相比，本發明具有如下優點：
1、本發明由川芎醇提物製備的含藥血清根據川芎活血化瘀、開鬱行氣、疏風止痛的作用，可有效抑制骨肉瘤細胞的增殖、促進其凋亡、抑制其轉移。
2、本發明以mg-63人成骨肉瘤細胞作為模型，使用川芎醇提物灌胃大鼠後處理得到的含藥血清培養mg-63人成骨肉瘤細胞，對於抑制骨肉瘤細胞的增殖、促進其凋亡、抑制其轉移的效果明顯要優於川芎提取物以及現有治療骨肉瘤的藥物；其中給大鼠按體重比灌胃川芎醇提物(10-30)g/kg製備的含藥血清，取濃度為15％(與dmem培養基體積比)的含藥血清抑制mg-63人成骨肉瘤細胞存活率可以達到26.69％以下，促進mg-63人成骨肉瘤細胞存活率凋亡率達到40.92％以上；而川芎醇提物和現有治療骨肉瘤的藥物抑制細胞存活率最好的效果僅為72.34％和42.15％，川芎醇提物和現有治療骨肉瘤的藥物促進凋亡率最好的效果為18.19％和19.47％；同時該含藥血清可以有效的抑制mg-63人成骨肉瘤細胞的遷移能力，從而驗證其具有抑制骨肉瘤的良好效果；本發明川芎醇提物製備的含藥血清製備的藥物在治療骨肉瘤時也具有顯著的效果。
3、本發明的製備方法安全可控，並且便於操作、保管、貯存和運輸。
附圖說明
圖1為將實施例4給大鼠按體重比灌胃川芎醇提物30g/kg製備的含藥血清以及對照組孵育mg-63人成骨肉瘤細胞，transwell細胞遷移檢測細胞遷移能力的示意圖；
圖2為將實施例5給大鼠按體重比灌胃臟毒清20g/kg製備的含藥血清以及對照組孵育mg-63人成骨肉瘤細胞，transwell細胞遷移檢測細胞遷移能力的示意圖；
圖3為將實施例6給大鼠按體重比灌胃臟毒清10g/kg製備的含藥血清以及對照組孵育mg-63人成骨肉瘤細胞，transwell細胞遷移檢測細胞遷移能力的示意圖。
具體實施方式
以下結合實施例和附圖對本發明作進一步說明。
實施例1
由川芎醇提物製備的含藥血清
(1)首先稱取適量川芎藥材並將其粉碎成粉末狀，然後加入藥材重量10倍量的體積分數80％乙醇，加熱回流提取2次，每次30分鐘，合併提取液後，經過200目篩網過濾並且蒸餾濃縮得到膏體，再經冷凍乾燥後粉碎即得川芎醇提物；川芎由市售可得；
(2)給400g清潔級sd雄性大鼠按體重比灌胃川芎醇提物30g/kg，灌胃前禁食不禁水，每日3次，持續3d；
(3)末次灌胃後2h對大鼠用戊巴比妥鈉麻醉進行麻醉，無菌條件下經腹主動脈採血；
(4)將血液靜置8h，5000rpm，4℃離心10min，取上清，60℃滅活25min後通過0.22μm濾膜過濾除菌，得含藥血清，分裝，凍存於－80℃冰箱備用。
實施例2
由川芎醇提物製備的含藥血清
(1)首先稱取適量川芎藥材並將其粉碎成粉末狀，然後加入藥材重量10倍量的體積分數80％乙醇，加熱回流提取2次，每次30分鐘，合併提取液後，經過200目篩網過濾並且蒸餾濃縮得到膏體，再經冷凍乾燥後粉碎即得川芎醇提物；
(2)給300g清潔級sd雄性大鼠按體重比灌胃川芎醇提物20g/kg，灌胃前禁食不禁水，每日3次，持續3d；
(3)末次灌胃後2h對大鼠用戊巴比妥鈉麻醉進行麻醉，無菌條件下經腹主動脈採血；
(4)將血液靜置8h，5000rpm，4℃離心10min，取上清，60℃滅活25min後通過0.22μm濾膜過濾除菌，得含藥血清，分裝，凍存於－80℃冰箱備用。
實施例3
由川芎醇提物製備的含藥血清
(1)首先稱取適量川芎藥材並將其粉碎成粉末狀，然後加入藥材重量10倍量的體積分數80％乙醇，加熱回流提取2次，每次30分鐘，合併提取液後，經過200目篩網過濾並且蒸餾濃縮得到膏體，再經冷凍乾燥後粉碎即得川芎醇提物；
(2)給250g清潔級sd雄性大鼠按體重比灌胃川芎醇提物10g/kg，灌胃前禁食不禁水，每日2次，持續5d；
(3)末次灌胃後1h對大鼠用戊巴比妥鈉麻醉進行麻醉，無菌條件下經腹主動脈採血；
(4)將血液靜置4h，3000rpm，4℃離心15min，取上清，56℃滅活30min後通過0.22μm濾膜過濾除菌，得含藥血清，分裝，凍存於－80℃冰箱備用。
實施例4
將實施例1給大鼠按體重比灌胃川芎醇提物30g/kg後處理得到的含藥血清孵育mg-63人成骨肉瘤細胞；
將mg-63人成骨肉瘤細胞解凍復甦後加入含(體積比)10％胎牛血清(fbs)的dmem培養基製成細胞懸液，分種於培養瓶中並置於5％co2(細胞培養的常規環境，co2體積分數為5％)，飽和溼度95％，37℃培養箱中培養。正常培養時約每天更換1次培養液，等到細胞生長融合度達到70％-80％時進行傳代培養；傳代培養時首先棄去培養瓶中的舊培養液，加入37℃磷酸緩衝鹽溶液(pbs)液洗瓶2次，在25cm2培養瓶中加入2ml濃度為0.25％的胰蛋白酶(即2.5g/l的胰蛋白酶溶液)進行消化。然後在倒置顯微鏡下仔細隨時觀察，當發現細胞質回縮、細胞間隙變大時終止消化。接下來棄去胰酶溶液，加入含(體積比)10％胎牛血清的dmem培養基，之後用吸管輕柔吹打使貼壁細胞懸浮。緊接著將含懸浮細胞的培養液轉移至10ml離心管中，1500rpm離心5min，棄上清液。將細胞重新懸浮於5ml含(體積比)10％胎牛血清的完全培養基中。細胞計數結束，選擇合適濃度將細胞分裝到新的無菌培養瓶進行培養。最後6h後可見細胞貼壁，以後每2-3天換液次，待細胞長滿瓶底70％-80％後再次消化傳代。
取4-6代的生長良好，融合度約為60％-70％的細胞進行細胞實驗。呈亞融合狀態的細胞，輕柔吹打配成單細胞懸液並接種於96孔培養板，24孔培養板以及tranwell鋪板，細胞貼壁生長24h後用各個分組對mg-63人成骨肉瘤細胞進行孵育24h處理，具體分組情況如下：
對照組(共設6組，組1-組6)：
1、對照組：用無血清dmem培養液孵育細胞24h；
2、胎牛血清對照組：dmem培養液中僅加入血清(所述血清為標準胎牛血清，購自杭州四季青生物科技有限公司)，血清濃度(體積比)為15％，該dmem培養液孵育細胞24h；
3、空白血清對照組：dmem培養液中僅加入血清(血清採集方法與實施例1相同，不同在於沒有灌胃)，血清濃度(體積比)為15％，該dmem培養液孵育細胞24h；
4、川芎醇提物對照組：用川芎醇提物與沒有灌胃的大鼠得到的血清進行混合(血清採集方法與實施例1相同，不同在於沒有灌胃，川芎醇提物與實施例1大鼠的體重比為30g/kg)，然後加入到dmem培養液中，血清濃度(體積比)為15％，用該dmem培養液孵育細胞24h；
5、生理鹽水對照組：給大鼠按體重比灌胃生理鹽水30g/kg得到的血清(血清採集方法與實施例1相同，不同之處川芎醇提物換成生理鹽水)加入到dmem培養液中加入，血清濃度(體積比)為15％，用該dmem培養液孵育細胞24h；
6、現有藥物對照組：用現有治療骨肉瘤藥物順鉑與沒有灌胃的大鼠得到的血清進行混合(血清採集方法與實施例1相同，不同在於沒有灌胃，順鉑與實施例1的大鼠體重的重量比為30g/kg，順鉑購買於齊魯製藥廠)，然後加入到dmem培養液中，血清濃度(體積比)為15％，用該dmem培養液孵育細胞24h；
對照組中沒有設置順鉑灌胃製備含藥血清對照組是由於，順鉑注射是其常用方法，不適合灌胃使用，故本實施例中沒有設置順鉑注射對照組及順鉑灌胃對照組。
處理組(共設2組，組7和組8)：
用實施例1給大鼠按體重比灌胃川芎醇提物30g/kg製得的含藥血清加入到dmem培養液中，配製出含藥血清濃度(體積比)為15％和20％兩種dmem培養液，分別用濃度15％和20％含藥血清dmem培養液孵育細胞24h。
實施例5
將實施例2給大鼠按體重比灌胃川芎醇提物20g/kg後處理得到的含藥血清孵育mg-63人成骨肉瘤細胞，具體的細胞培養方法與實施例4相同。
對照組(共設6組，組1-組6)：
1、空白對照組：用無血清dmem培養液孵育細胞24h；
2、胎牛血清對照組：dmem培養液中僅加入血清(所述血清為標準胎牛血清，購自杭州四季青生物科技有限公司)，血清濃度(體積比)為15％，該dmem培養液孵育細胞24h；
3、空白血清對照組：dmem培養液中僅加入血清(血清採集方法與實施例2相同，不同在於沒有灌胃)，血清濃度(體積比)為15％，該dmem培養液孵育細胞24h；
4、川芎醇提物對照組：用川芎醇提物與沒有灌胃的大鼠得到的血清進行混合(血清採集方法與實施例2相同，不同在於沒有灌胃，川芎醇提物與實施例2大鼠體重的重量比為20g/kg)，然後加入到dmem培養液中，血清濃度(體積比)為15％，用該dmem培養液孵育細胞24h；
5、生理鹽水對照組：給大鼠按體重比灌胃生理鹽水20g/kg得到的血清(血清採集方法與實施例2相同，不同之處川芎醇提物換成生理鹽水)加入到dmem培養液中加入，血清濃度(體積比)為15％，用該dmem培養液孵育細胞24h；
6、現有藥物對照組：用現有治療骨肉瘤藥物順鉑與沒有灌胃的大鼠得到的血清進行混合(血清採集方法與實施例2相同，不同在於沒有灌胃，順鉑與實施例1的大鼠體重比為20g/kg)，然後加入到dmem培養液中，血清濃度(體積比)為15％，用該dmem培養液孵育細胞24h；
處理組(共設2組，組7和組8)：
用實施例2給大鼠按體重比灌胃川芎醇提物20g/kg製得的含藥血清加入到dmem培養液中，配製出含藥血清濃度(體積比)為15％和20％兩種dmem培養液，分別用濃度15％和20％含藥血清dmem培養液孵育細胞24h。
實施例6
將實施例3給大鼠按體重比灌胃川芎醇提物10g/kg後處理得到的含藥血清孵育mg-63人成骨肉瘤細胞，具體的細胞培養方法與實施例4相同。
對照組(共設6組，組1-組6)：
1、空白對照組：用無血清dmem培養液孵育細胞24h；
2、胎牛血清對照組：dmem培養液中僅加入血清(所述血清為標準胎牛血清，購自杭州四季青生物科技有限公司)，血清濃度(體積比)為15％，該dmem培養液孵育細胞24h；
3、空白血清對照組：dmem培養液中僅加入血清(血清採集方法與實施例2相同，不同在於沒有灌胃)，血清濃度(體積比)為15％，該dmem培養液孵育細胞24h；
4、川芎醇提物對照組：用川芎醇提物與沒有灌胃的大鼠得到的血清進行混合(血清採集方法與實施例3相同，不同在於沒有灌胃，川芎醇提物與實施例3大鼠體重的重量比為10g/kg)，然後加入到dmem培養液中，血清濃度(體積比)為15％，用該dmem培養液孵育細胞24h；
5、生理鹽水對照組：給大鼠按體重比灌胃生理鹽水10g/kg得到的血清(血清採集方法與實施例2相同，不同之處川芎醇提物換成生理鹽水)加入到dmem培養液中加入，血清濃度(體積比)為15％，用該dmem培養液孵育細胞24h；
6、現有藥物對照組：用順鉑與沒有灌胃的大鼠得到的血清進行混合(血清採集方法與實施例2相同，不同在於沒有灌胃，順鉑與實施例1的大鼠體重比為10g/kg)，然後加入到dmem培養液中，血清濃度(體積比)為15％，用該dmem培養液孵育細胞24h；
處理組(共設2組，組7和組8)：
用實施例3給大鼠按體重比灌胃川芎醇提物10g/kg製得的含藥血清加入到dmem培養液中，配製出含藥血清濃度(體積比)為15％和20％兩種dmem培養液，分別用15％和20％含藥血清dmem培養液孵育細胞24h。
試驗例1mtt方法檢測藥物對mg-63人成骨肉瘤細胞增殖活性的作用
mtt全稱3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazoliumbromide，漢語化學名為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，是一種黃色的染料。處於增殖期的活細胞細胞線粒體中含有的琥珀脫氫酶，可使外源性的mtt還原成難溶的針狀formazan結晶，呈藍紫色，並沉澱在活細胞中，細胞活力與formazan的形成量成正比，dmso能使formazan結晶溶解，使用酶標儀于波長570nm處測定吸收值，以此間接反映細胞增殖的情況。在一定細胞數範圍內，mtt結晶形成的量與細胞數成正比。
分別取實施例4，5，6各分組孵育後製備的96孔板的細胞，每孔定量加100μl含(體積比)15％胎牛血清(fbs)完全培養基；置於5％co2，飽和溼度95％，37℃培養箱中進行培養24～72h；培養終止前4h加入10μl/孔(濃度為5mg/ml)的mtt；繼續培養4h後，小心吸棄上清培養液後加100μl/孔二甲基亞碸(dmso)終止反應，于振蕩器上震蕩10min左右，使結晶物充分溶解；酶標儀570nm檢測od值，實驗至少重複三次。記錄結果，計算存活率。
細胞存活率(％)＝處理組平均od值/對照組平均od值×100％。
結果如1至3所示。
表130g/kg的川芎醇提物灌胃大鼠時mtt法檢測mg-63人成骨肉瘤細胞存活率
*表示與對照組比較差異顯著
表220g/kg的川芎醇提物灌胃大鼠時mtt法檢測mg-63人成骨肉瘤細胞存活率
*表示與對照組比較差異顯著
表310g/kg的川芎醇提物灌胃大鼠時mtt法檢測mg-63人成骨肉瘤細胞細胞存活率
*表示與對照組比較差異顯著
由表1-3可知，給大鼠按體重比分別灌胃川芎醇提物30、20、10g/kg製備得到的含藥血清，當使用濃度(體積比)為15％和20％的含藥血清時mg-63人成骨肉瘤細胞存活率可以達到26.69％和26.45％以下，與川芎醇提物對照組的細胞存活率以及現有藥物對照組的細胞存活率相比具有明顯的優勢，都具有很好的抑制mg-63人成骨肉瘤細胞存活效果，說明本發明實施例製備的含藥血清具有良好的抑制mg-63人成骨肉瘤細胞的存活的作用。
由表2可知，給大鼠按體重比灌胃20g/kg製得的含藥血清效果最好，濃度為15％和20％含藥血清組的細胞存活率分別是24.69％，24.58％；20％含藥血清組時細胞存活率為24.58％，與15％含藥血清組無統計學差異，因此，通過給大鼠按體重比灌胃川芎醇提物20g/kg製得的含藥血清，使用濃度15％的含藥血清就可以取得良好的抑制mg-63人成骨肉瘤細胞存活效果。
試驗例2流式細胞術檢測細胞凋亡
磷脂酞絲氨酸(ps)只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂醯絲氨酸由脂膜內側翻向外側。在鞘液的約束和包圍下，待測樣本的細胞排成單列由流動室噴嘴高速噴出，而形成細胞液柱。液柱在通過檢測區時，在入射雷射束的照射下可產生側向散射光(ssc)和前向散射光(fsc)，它們分別反映細胞顆粒度和大小，根據這些特性將細胞分類。樣本經一種或幾種特殊螢光標記後，可在雷射束的激發下產生特定螢光，該特定螢光可被光學系統檢測並分析，由此得到相應的各種細胞特性。annexinv是一種分子量35～36kda的ca2+依賴性磷脂結合蛋白，與磷脂醯絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的磷脂醯絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。將annexinv進行fitc標記，以標記了annexinv作為螢光探針，利用流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生。
分別取實施例4，5，6各分組孵育後製備的24孔板的細胞，棄去培養上清後每孔加入0.5ml濃度為0.25％的胰蛋白酶(即2.5g/l的胰蛋白酶溶液)，在倒置顯微鏡下觀察，待細胞開始變圓，加少量含血清培養液，終止消化，吹打懸浮細胞後移至離心管中，1000rpm下離心10min，棄上清，用預冷的pbs洗滌2次，用250μl結合緩衝液重懸細胞。調節其濃度為1×106/ml，取100μl細胞懸液於5ml流式管中，加入5μlannexinvfitc和10μl20μg/ml的pi溶液，混勻後室溫避光孵育15min，在反應管中加入400μlpbs，上流式細胞儀分析。實驗結果經計算機軟體modfitlt3.0分析軟體分析細胞周期細胞數，每組實驗至少重複3次；結果見表4至6所示。
表430g/kg的川芎醇提物灌胃大鼠時mg-63人成骨肉瘤細胞凋亡率的變化
*表示與對照組比較差異顯著
表520g/kg的川芎醇提物灌胃大鼠時mg-63人成骨肉瘤細胞凋亡率的變化
*表示與對照組比較差異顯著
表610g/kg的川芎醇提物灌胃大鼠時mg-63人成骨肉瘤細胞凋亡率的變化
*表示與對照組比較差異顯著
由表4至6可知，給大鼠按體重比分別灌胃川芎醇提物30、20、10g/kg製備得到的含藥血清，當使用濃度(體積比)15％和20％的含藥血清時mg-63人成骨肉瘤細胞凋亡率可以達到40.92％和39.16％以上，與川芎醇提物對照組的細胞凋亡率以及現有藥物對照組的細胞凋亡率相比具有明顯的優勢，都可以使mg-63人成骨肉瘤細胞的凋亡率大大增加，說明本發明實施例製備的含藥血清具有良好的促進mg-63人成骨肉瘤細胞的凋亡的作用。
由表5可知，給大鼠按體重比灌胃川芎醇提物20g/kg製得的含藥血清效果最好，濃度為15％和20％含藥血清組的細胞凋亡率分別是43.57％，43.38％；20％含藥血清組時細胞凋亡率與15％含藥血清組無統計學差異，因此，通過給大鼠按體重比灌胃川芎醇提物20g/kg製得的含藥血清，使用其濃度為15％的含藥血清就可以取得良好的促使mg-63人成骨肉瘤細胞凋亡效果。
試驗例3transwell侵襲實驗檢測川芎醇提物製備含藥血清對細胞侵襲能力的影響。
細胞遷移實驗是將transwell小室放入培養板中，小室內稱為上室，培養板內稱下室，上下層培養液以聚碳酸酯膜相隔，將研究的腫瘤細胞種在上室內，下室加入含fbs或某些特定的趨化因子的培養液，由於聚碳酸酯膜具有通透性，腫瘤細胞會向營養成分高的下室遷移，計數進入下室的細胞數量就能反應細胞的遷移能力。
分別取實施例4，5，6的經過各個分組孵育的transwell鋪板細胞，細胞的終濃度大小約為5×105個/ml；24孔板的下室內加入500μl的含(體積比)20％fbs的dmem，在transwell小室內加入100μl的細胞懸液，常規培養24h；細胞培養完成後，輕提transwell小室，傾倒室內的培養基，用適量的pbs將細胞洗滌2遍，之後每孔加入1ml4％的多聚甲醛(4％的多聚甲醛為4g多聚甲醛融於100mlpbs中製得；pbs緩衝液的配製：nacl8g，kcl0.2g，na2hpo41.44g，kh2po40.24，加入800ml去離子水，充分攪拌，用hcl調節ph值至7.4，補充去離子水定容至1000ml，高壓蒸汽滅菌，保存於4℃。)固定細胞15min，pbs再清洗3次，每次5min，再使用0.1％的結晶紫染色細胞30min，用pbs洗滌3次，每次5min，使用超純水輕輕衝洗溼潤小室表面的細胞，最後用溼潤棉籤輕輕擦去未遷移過膜的細胞，風機風乾；倒置transwell小室，顯微鏡進行觀察和拍照。於顯微鏡下隨機選取5個視野觀察細胞，並計數遷移細胞數。
圖1為實施例1給大鼠按體重比灌胃川芎醇提物30g/kg製備的含藥血清孵育mg-63人成骨肉瘤細胞細胞，transwell細胞遷移檢測細胞遷移能力，具體分組參照實施例4，其中1空白對照組；2胎牛血清對照組；3空白血清對照組；4川芎醇提物對照組；5生理鹽水對照組；6現有藥物對照組7濃度(體積比)15％含藥血清組；8濃度(體積比)20％含藥血清組。圖中＊為p<0.05，差異顯著。
圖2為實施例2給大鼠按體重比灌胃川芎醇提物20g/kg製備的含藥血清孵育mg-63人成骨肉瘤細胞細胞，transwell細胞遷移檢測細胞遷移能力，具體分組參照實施例5，其中1空白對照組；2胎牛血清對照組；3空白血清對照組；4川芎醇提物對照組；5生理鹽水對照組；6現有藥物對照組；7濃度(體積比)15％含藥血清組；8濃度(體積比)20％含藥血清組。圖中＊為p<0.05，差異顯著。
圖3為實施例3給大鼠按體重比灌胃川芎醇提物10g/kg製備的含藥血清孵育mg-63人成骨肉瘤細胞細胞，transwell細胞遷移檢測細胞遷移能力，具體分組參照實施例6，其中1空白對照組；2胎牛血清對照組；3空白血清對照組；4川芎醇提物對照組；5生理鹽水對照組；6現有藥物對照組；7濃度(體積比)15％含藥血清組；8濃度(體積比)20％含藥血清組。圖中＊為p<0.05，差異顯著。
從圖1至3可以看出，給大鼠按體重比分別灌胃川芎醇提物10、20、30g/kg後經腹主動脈取血離心後，將其配製成與dmem培養液體積比15％、20％的含藥血清對mg-63人成骨肉瘤細胞進行孵育，結果表明含藥血清孵育的mg-63人成骨肉瘤細胞相對於對照組4川芎醇提物對照組、6現有藥物對照組遷移能力顯著降低，說明本發明實施例製備的含藥血清具有良好的抑制mg-63人成骨肉瘤細胞遷移的作用。