一種耐有機溶劑蛋白酶及其產生菌株的製作方法
2023-06-10 16:20:36 1
專利名稱：：一種耐有機溶劑蛋白酶及其產生菌株的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種耐有機溶劑蛋白酶產生菌株以及該耐有機溶劑蛋白酶，屬於微生物學與酶學領域。
背景技術：
：蛋白酶廣泛應用於洗滌劑、食品、製藥、製革、診斷試劑、汙水處理等領域。1984年，Klibanov等人發現蛋白酶在一些有機溶劑中保存較長時間仍然具有活性，而且可以催化合成肽鍵的反應。這一發現促進了非水酶學的興起。大量研究表明，有機溶劑中進行酶促反應有許多優點，如有機底物的溶解性大大增強、酶的穩定性提高、防止微生物汙染、產物易純化等。更重要的是，在有機溶劑中利用蛋白酶催化合成肽，可以避免胺基酸的外消旋作用，不需要對胺基酸側鏈進行保護及脫保護，因此降低成本。研究表明，只有當酶分子具有一定的構象時，才能表現出催化活力。水直接或間接地參與維持酶分子構象的非共價作用力，維持酶的活性構象變化所需的"柔性"。因此，有機溶劑尤其是親水性有機溶劑對天然來源的蛋白酶分子的催化活性影響很大。為了改善酶在有機溶劑中的穩定性，人們採用各種方法如酶的定向進化或化學修飾、固定化等策略。但是效果並不能滿足實際催化的需要。耐有機溶劑極端微生物能在富含有機溶劑的環境中生存，因此其所產胞外蛋白酶很有可能具有一定的有機溶劑耐受性。在已報導的有機溶劑耐受性微生物中以革蘭氏陰性菌為主,僅有少量文獻報導了具有有機溶劑耐受性的革蘭氏陽性菌如Bacillus(芽孢桿菌屬)，Rhodococcus(紅球菌屬)和Arthrobacter(節桿菌屬)等。目前已報導的產溶劑穩定性蛋白酶的微生物多為Pseudomonas(假單胞菌屬)菌株。國內關於耐有機溶劑微生物產蛋白酶的相關報導並不多。其中也未見Serratiamarcescens產耐有機溶劑蛋白酶的報導。
發明內容本發明的目的是提供一種具有優良有機溶劑耐受性能的蛋白酶及其產生菌株o本發明提供一種具有有機溶劑耐受性的沙雷氏菌屬菌株，命名為Sermri/^rcm^似MH6，保藏單位中國典型培養物保藏中心(湖北省武漢市武漢大學)，保藏日期2008年11月7日，其保藏登記號為CCTCCNO:M208205。菌株mfl;r^^wMH6為耐有機溶劑蛋白酶產生菌。篩選過程如下初篩採用不同濃度環己垸、DMF、DMSO等有機溶劑為篩選壓力從油汙土樣中篩選獲得耐有機溶劑極端微生物。然後，採用牛奶瓊脂平板培養基，從上述耐有機溶劑極端微生物中篩選蛋白酶產生菌株，共獲得6株蛋白酶高產菌。復篩通過檢測各菌株產蛋白酶能力及所產蛋白酶的有機溶劑耐受性，從初篩菌中選取具有優良有機溶劑耐受性能的蛋白酶的產生菌。菌株MH6產蛋白酶能力最強，活力高達1204U/mL;該菌株的粗酶液具有優良有機溶劑耐受性能因此，最終選擇菌株MH6作為耐有機溶劑蛋白酶產生菌。菌株MH6經過BIOLOG自動細菌鑑定儀鑑定和16SrDNA序列分析，表明該菌株屬於沙雷氏菌屬，為SeAT加'"膨/resre"51，並命名Ser融'awarcesc卿MH6。菌株&m^awarcescemMH6為革蘭氏陰性短桿菌株，無芽孢，周生鞭毛，菌落為紅色，大小為1nmxl.50.7x1.0nm。在LB培養基中生長24小時後，菌落大小為1.52.5mm。該菌株生長溫度範圍為2045°C，最適生長溫度為35。C，生長pH為59，最適pH為8.0，在有氧條件下生長。本發明對菌株Se/rart'awa/x^cmyMH6產生的耐有機溶劑蛋白酶進行了純化(1)硫酸銨沉澱法初步純化耐有機溶劑蛋白酶。將粗酶液置於冰浴中，加入50%飽和度的(NH4)2S04沉澱雜蛋白，然後向上清液中加入(NH4)2S04至飽和度60%，獲得沉澱。經檢測，沉澱中的蛋白酶活力回收達到69.1%。(2)離子交換層析法進一步純化耐有機溶劑蛋白酶。通過SDS-PAGE電泳分析，表明經過兩步純化，該蛋白酶已經達到電泳純，其亞基分子量約為5254kDa;最終，蛋白酶純化倍數(表3)為5.98，回收率為19.87%，比活達到42388.57U/mg。該耐有機溶劑蛋白酶，基於十二垸基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳的分子量為452-54KDa。菌株&n"加/a附flrcescewMH6產生的耐有機溶劑蛋白酶具有良好的有機溶劑耐受性，在考察的15種有機溶劑中，多數有機溶劑對蛋白酶的酶活力幾乎沒有影響；DMSO、DMF對蛋白酶酶活力有一定影響，但處理24h後相對酶活力仍然保持在60%以上；異丙醇、丙酮、乙醇、乙腈對酶活影響較大，在24h以後，相對酶活力小於10%以下。菌株Se/r油'am"rcesce/wMH6產生的耐有機溶劑蛋白酶在50。/。(v/v)的長鏈烷烴如十二烷、環己烷、乙酸乙酯中比水相中穩定。菌株Serraft》附肌，esce";yMH6產生的耐有機溶劑蛋白酶的最適反應pH為8.0-8.5，在pH68.5，能保留最大活力的50%以上；該酶在pH68的範圍具有很好的穩定性。該酶的最適反應溫度為40-45°C，在30、40和45'C放置一小時後，仍然能保留初始活力的70%以上，較穩定。當溫度大於等於5(TC時，該酶活力隨著放置時間的變化迅速失活。Ca2+、Mg^和NP離子對該耐有機溶劑蛋白酶有激活作用，而高濃度的離子溶液對酶活有抑制作用。絲氨酸蛋白酶抑制劑(PMSF)對該酶活力有輕微抑制，表面活性劑Tween80、TritonX-100等對蛋白酶活有激活作用，而SDS對該酶活有顯著抑制；巰基乙醇對該蛋白酶活有明顯的抑制作用，表明該蛋白酶結構中有二硫鍵存在。本發明分離克隆了菌株Ser加'aMH6產生的耐有機溶劑蛋白酶，所述的耐有機溶劑蛋白酶具有SEQIDNO:2所示的胺基酸序列。該耐有機溶劑蛋白酶的編碼基因具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。LC/MS/MS(HPLC-massspectrometryanalysis)分析結果顯示，該耐有機溶劑蛋白酶屬於Serrariamarcesce"s金屬蛋白酶家族。在NCBI上進行比對，發現該蛋白酶編碼基因與Serr。ria則rcescerametalloproteasegene(Serr加'amarcesceraSM6金屬蛋白酶)同源性為98%。CDS區域編碼基因對應的胺基酸比對結果發現相似度為99%，有四個胺基酸不同。本發明提供的菌株附wc^ce似MH6是能夠耐受有機溶劑的極端微生物，能夠產生耐有機溶劑蛋白酶，豐富了極端微生物的種類和耐有機溶劑蛋白酶的來源。該蛋白酶與其它的天然蛋白酶相比，具有良好的有機溶劑耐受性，有望應用於非水相中多肽的合成及關於其有機溶劑耐受機理的理論研究。圖1是牛奶瓊脂平板篩選照片；圖2是耐有機溶劑蛋白酶的SDS-PAGE電泳分析，其中1-標準分子量蛋白，2-硫酸銨沉澱後蛋白酶液，3-DEAE-S印haroseFF離子交換後蛋白酶液；圖3表示不同有機溶劑對蛋白酶的影響；圖4表示蛋白酶在有機溶劑中的穩定性；圖5表示耐有機溶劑蛋白酶的最適反應pH和pH穩定性，其中圖5(1)表示耐有機溶劑蛋白酶的最適反應pH，圖5(1)表示耐有機溶劑蛋白酶的pH穩定性；圖6表示耐有機溶劑蛋白酶的最適反應溫度和熱穩定性，其中圖6(1)表示耐有機溶劑蛋白酶的最適反應溫度，圖6(2)表示耐有機溶劑蛋白酶的溫度穩定性。具體實施例方式實施例一本實驗說明產耐有機溶劑蛋白酶的天然菌株的篩選程序。初篩獲得能夠耐受有機溶劑並產蛋白酶的菌株。採用不同濃度環己垸、DMF、DMSO等有機溶劑為篩選壓力從油汙土樣中篩選獲得耐有機溶劑極端微生物。然後，採用牛奶瓊脂平板培養基從上述耐有機溶劑極端微生物中篩選蛋白酶產生菌株。根據各菌株在牛奶瓊脂平板培養基上形成的菌落與透明圈直徑之比值，初步篩選到6株蛋白酶高產菌(圖l)。由於此6株菌能夠耐受有機溶劑，其產生的蛋白酶也很有可能具有有機溶劑耐受性。復篩通過檢測各菌株產蛋白酶能力及所產蛋白酶的有機溶劑耐受性，從初篩菌中選取具有優良有機溶劑耐受性能的蛋白酶的產生菌。將初篩獲得的菌株接種到產酶發酵培養基，於35'C，搖床轉速為180r/min，培養24h。將發酵液離心(4°C，9000r/min離心15min)，上清液為粗酶液。檢測各粗酶液的蛋白酶活性，其中菌株MH6產蛋白酶能力最強，活力高達1204U/mL。取菌株MH6粗酶液1mL，分別加入等體積的十六烷、十四垸、十二垸、癸垸、乙酸乙酯、正辛烷、丙酮、乙醇、二甲基甲醯胺(DMF)和二甲基亞碸(DMSO)等，於30。C、180rpm震蕩處理24h後，以酪蛋白為底物檢測蛋白酶剩餘酶活；實驗表明該酶具有優良有機溶劑耐受性能。在DMF中處理後仍能保持60y。以上酶活，尤其在疏水有機溶劑中處理2411後保持80%以上酶活。因此，最終選擇菌株MH6作為耐有機溶劑蛋白酶產生菌，進行後續研究。牛奶瓊脂平板培養基(MLB):胰蛋白腖5g/L，酵母粉3g/L，脫脂奶粉12g/L，瓊脂18g/L。產酶發酵培養基胰蛋白腖10g/L，(NH4)2S041.8g/L，KH2P040.5g/L，MgSO40.3g/L，CaCl21.0g/L，NaC11.0g/L，甘油5ml/L。蛋白酶活力檢測方法為配製酪蛋白含量為2y。(W/V)的pH為8.0的Tris-HCl緩衝液作為反應底物。取lmL稀釋適當倍數的粗酶液，加入lmL反應底物，4(TC保溫10min後加入4mLTCA反應終止液(含有0.11M三氯乙酸，0.22M醋酸鈉，0.33M醋酸)。將該反應混合物於4。C靜置15min，12000rpm離心25min，取上清液於280nm處檢測紫外吸光值。每一個單位(U)蛋白酶活力定義為，在40'C，pH為8.0的反應條件下，每毫升粗酶液每分鐘催化產生liag酪氨酸所需的酶量。實施例二本實驗說明耐有機溶劑蛋白酶產生菌MH6的生理生化性質及其鑑定菌株&mrf/amarcMce似MH6為革蘭氏陰性短桿菌株，無芽孢，周生鞭毛，大小為1pmxl.50.7x1.0pm。在LB培養基中生長24小時後，菌落為紅色，菌落大小為1.52.5rnm。該菌株生長溫度範圍為2045°C，最適生長溫度為35°C，生長pH為59，最適pH為8.0，在有氧條件下生長。其生理生化性質見(表l)。LB培養基配方胰蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L，NaC11.0g/L。表1菌株MH6的部分生理生化特徵tableseeoriginaldocumentpage7tableseeoriginaldocumentpage8注+(陽性)能利用；-(陰性):不能利用。經過BIOLOG自動細菌鑑定儀和16SrDNA序列分析，菌株MH6屬於沙雷氏菌屬，為SeA"raftV3脂rcescera，並命名Serraf/a附arcesce"sMIK。考察Serrari"mflrce"e/MMH6的溶劑耐受性。500mL三角瓶中MLB培養基的裝液量為40mL，菌株Serrariflwm/r^ceraMH6的接種量為2%(體積百分數)。在各培養體系中分別加入不同的有機溶劑溶劑(11種)，添加量為20%(體積百分數)，其中有機溶劑含量為20%，總體系為50ml，以橡膠塞封口，於37'C，搖床180rpm培養，培養時間24h取樣檢測OD660(表2)。實驗結果表明，菌株MH6能在含有不同有機溶劑的培養基中生長(對照中不添加有機溶劑)，具有一定的有機溶劑耐受性。LogPo/w大於2.0的有機溶劑如十二垸，庚垸，環己烷對MH6的生長影響較小；LogPo/w小於2.0的有機溶劑如異丙醇，乙醇能明顯抑制菌株MH6的生長。表2有機溶劑對菌株wflrcesce似MH6生長的影響tableseeoriginaldocumentpage8tableseeoriginaldocumentpage9注++:生長良好；+:可以生長；一不可以生長。實施例三本實驗說明菌株SerrW/awa/rescewMH6所產耐有機溶劑蛋白酶的純化程序。菌株Serra"a加arcesce"sMH6在產酶培養基中培養28h，將所得的發酵液離心(卯00rmp，4°C)20min，取上清液作為粗酶液。硫酸銨沉澱法初步純化耐有機溶劑蛋白酶。將粗酶液置於冰浴中，一邊攪拌一邊緩慢加入(NH4)2SO4至50。/。飽和度，然後離心(9000rmp，4°C)20min，取上清液繼續加入(NH4)2S04至60%飽和度，再次離心(9000rmp,4°C)20min，將所得沉澱用Tris-HCl緩衝液(50mmol/L，pH8.0)溶解。經檢測，沉澱中的蛋白酶活力回收率達到69.1%。離子交換層析法進一步純化耐有機溶劑蛋白酶。DEAEFastFlow離子交換層析柱事先採用Tris-HCl緩衝液(20mmol/L，pH7.5)平衡，將硫酸銨沉澱法所得沉澱的Tris-HCl溶液作為進一步純化的樣品，上樣至DEAEFastFlow離子交換層析柱，然後用含鹽(NaCl濃度為1mol/L)的Tris-HCl緩衝液(20mmol/L，pH7.5,)進行梯度洗脫，收集具有蛋白酶活性的洗脫液。通過SDS-PAGE電泳分析(圖2)，表明經過兩步純化，該蛋白酶已經達到電泳純，其亞基分子量約為5254kDa;最終，蛋白酶純化倍數(表3)為5.98，回收率為19.87%，比活達到42388.57U/mg。表3耐有機溶蛋白酶MH6的純化步驟及結果tableseeoriginaldocumentpage9(60%)DEAEFastFlow148360.3542388.5719.875.98注蛋白質濃度採用考馬斯亮蘭法測定實施例四本實驗說明菌株Serraf/ama/r^ceraMH6所產耐有機溶劑蛋白酶的酶學性質。(1)溶劑耐受性採用實施例三的方法，獲得耐有機溶劑蛋白酶。將該蛋白酶稀釋液分別加入等體積有機溶劑如十六垸、十四烷、環己垸、DMF、DMSO、丙酮、乙醇，在30°C、180rpm振蕩24h後，檢測殘留蛋白酶活力(圖3)。對照中加入等體積Tris-HCl緩衝液(0.05M，pH8.0)。實驗結果表明，該蛋白酶具有良好的有機溶劑耐受性，在考察的15種有機溶劑中，多數有機溶劑對蛋白酶的酶活力幾乎沒有影響；DMSO、DMF對蛋白酶酶活力有一定影響，但處理24h後相對酶活力仍然保持在60%以上；異丙醇、丙酮、乙醇、乙腈對酶活影響較大，在24h以後，相對酶活力小於10%以下。(2)溶劑穩定性通常，疏水有機溶劑不直接與酶接觸，所以抑制酶活力能力較親水性有機溶劑小，本研究中考査了幾種疏水有機溶劑對蛋白酶的穩定性的影響。如圖4所示，此蛋白酶在50Q/。(v/v)的長鏈烷烴如十二烷、環己烷、乙酸乙酯中比水相(control中添加的是緩衝液)中穩定。(3)耐有機溶劑蛋白酶最適反應pH值和pH穩定性以不同pH值的酪蛋白為底物，檢測菌株Semrf/fl附wc"ce似MH6所產耐有機溶劑蛋白酶的最適反應pH。由圖5(1)可見，該耐有機溶劑蛋白酶的最適反應pH為8.0-8.5，反應pH為68.5時，蛋白酶活力能保留最大活力的50%以上(以pH8.0條件下的蛋白酶活力為100%)。向該耐有機溶劑蛋白酶中加入不同pH(pH介於69)的緩衝溶液，於40°C保溫lh後，檢測蛋白酶活力(以初始蛋白酶活力為對照)，以考察pH對該耐有機溶劑蛋白酶穩定性的影響。由圖5(2)可知，該蛋白酶在pH68的範圍具有10很好的穩定性。(4)最適反應溫度和熱穩定性在Tris-HCl緩衝體系(0.05M,pH8.0)下，檢測菌株Serra"'a/warcMcemMH6所產耐有機溶劑蛋白酶的最適反應溫度。從圖6(1)可以看出，該酶最適反應溫度為40"45。C。將菌株&rraft'a附arce化e似MH6所產耐有機溶劑蛋白酶在30°C、40°C、45°C、50°C、55'C下分別放置1h以後，測定殘留蛋白酶活力，以考察溫度對該蛋白酶穩定性的影響(圖6(2))。該蛋白酶在30、40和45。C水浴中處理後，仍然能保留初始活力的70%以上，較穩定。當溫度大於等於50"C時，該酶活力隨著放置時間的變化迅速失活。(5)金屬離子對蛋白酶活力的影響向該耐有機溶劑蛋白酶中加入不同濃度的EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)和1,10-Phenathroline(鄰菲羅林)，4。C下放置30min後，檢測殘留蛋白酶活力(表4(l))。結果顯示，隨著EDTA濃度的增加，抑制作用逐漸加強，10mM的EDTA對酶活有明顯的抑制作用；lmM的l，lO-Phenathroline幾乎完全抑制該酶活力。向該耐有機溶劑蛋白酶中，加入各種金屬離子，考察金屬離子對其酶活力的影響。操作過程如下向該耐有機溶劑蛋白酶中加入EDTA除去溶液中的微量離子，使其終濃度分別為為1mmolL"和5mmo1L"，於4t:下放置30min後，分別添加Ca2+、Ni2+、Zn2+、Mg2+、Cn2+、Fe2+、Co2+、砲2+等二價金屬離子(對應於EDTA濃度，各金屬離子終濃度為分別為1mmolL—1和5mmolU1)，於4°C下放置30min後，檢測蛋白酶活力。對照中不加入任何金屬離子。由表4(2)可見，1mmolL'1的Ca2+、Mg2+、Ni"離子對該蛋白酶有激活作用，而高濃度的離子溶液對酶活有抑制作用。表4(1)金屬離子鰲合劑對蛋白酶活力的影響tableseeoriginaldocumentpage1111.250.6表4(2)金屬離子對蛋白酶活力的影響^^屬禹^F濃度(mM)殘留蛋白酶活力(％)金屬離子濃度(mM)殘留蛋白酶活力(％)Ni2+1116.1Ca2+1113.0115.272.0Ba2+1107.4Cu2+142.179.0516.8Mg2+1110.7Mn2+1107.290.244.3Zn2+167.7Co2+1101.859.1562.4(6)表面活性劑及抑制劑對蛋白酶活性的影響向該耐有機溶劑蛋白酶中，分別加入不同濃度的表面活性劑和抑制劑，在25'C放置10min後，檢測蛋白酶活力，考察其對該酶活力的影響。對照中不添加任何抑制劑和表面活性劑。由表5可見，絲氨酸蛋白酶抑制劑(PMSF)對該酶活力有輕微抑制，表面活性劑Tween80、TritonX-100等對蛋白酶活有激活作用，而SDS對該酶活有顯著抑制；巰基乙醇對該蛋白酶活有明顯的抑制作用，表明該蛋白酶結構中有二硫鍵存在。表5變性劑和表面活性劑的影響變性劑/表濃度殘留蛋白酶變性劑/表面活濃度殘留蛋白面活性劑(mM)活力(％)性劑(W/V)酶活力(％)PMSF195.1glutathione193.755.2CTAB0.1%0.8DTT161.7Tween800.1o/o102.312tableseeoriginaldocumentpage13注PMSF二苯基氟磷酸，glutathione還原型的穀胱甘肽，DTT二硫蘇糖醇，Urea尿素，Mercaptoethanol巰基乙醇，SDS十二烷基磺酸鈉，L-CysteineL-半胱氨酸，CTAB十二烷基三甲基溴化銨。實施例五本實驗說明粘質沙雷氏菌&zrc^a附^rewem"MH6所產耐有機溶劑蛋白酶的LC/MS/MS分析以及其編碼基因的分離克隆程序。純化後的耐有機溶劑蛋白酶經SDS-PAGE電泳分析後，切出含有目的蛋白的單一條帶。將該目的蛋白經過胰蛋白酶水解後獲得中間肽段，(片段l)GNGIQINGK，(片段2)FSSTNVAGDTGLSK，(片段3)TGDTVYGFNSNTGR和(片段4)SFSDVGGLK，委託國家生物醫學分析中心(NBCA)進行LC/MS/MS序列分析。將所得的片段信息通過NCBI蛋白酶資料庫比對，結果顯示四條肽段序列與粘質沙雷氏菌&mzrifl廳rcescen5SM6金屬蛋白酶胺基酸相應序列相同，因此根據該金屬蛋白酶的序列設計引物來擴增目的蛋白的基因序列。採用酚一氯仿法抽提菌體總DNA。根據粘質沙雷氏菌SeAr加fo！/narcesceraSM6金屬蛋白酶基因序列，設計簡併引物(PF:GTGGCTTACGGGGAGGTTAT;PR:TCCGTTGCTGTGTTACACGA)，擴增該耐有機溶劑蛋白酶的編碼序列。PCR反應參數為94。C預變性5min;94。C變性lmin;55。C退火2min;72'C延伸2min;循環30輪後，72'C保溫10min。根據該反應條件，擴增到了約1.6kb的PCR片段。根據測定此蛋白的分子量，推斷此酶蛋白的編碼基因長度不超過1.5kb。將此片段連接到pMD18-T載體，進行序列測定。結果表明，本實驗克隆的基因序列包括了之前LCMS/MS分析得到的肽段序列。在NCBI上進行比對，發現該蛋白酶編碼基因與Serrcrifl！附arcesceismetalloproteasegene(5fernaria附arcesce/zsSM6金屬蛋白酶)同源性為98%。CDS區域編碼基因對應的胺基酸比對結果發現相似度為99%，有四個胺基酸不同。該蛋白酶片段含信號肽序列17個胺基酸，編碼成熟蛋白酶的胺基酸個數為487。序列表南京工業大學—種耐有機溶劑蛋白酶及其產生菌林njut20094Patentlnversion3.311515DNASerratiamarcescensMH6<221〉CDS(1).(1512)sig—peptide<222〉(l)..(51)mat—peptide(100)..1atgtctatctgtctgattgatatcaatcaggtaatgagtggaatcgaa48MetSerlieCysLeulieAsplieAsnGinValMetSerGlylieGlu-30-25-20ccaatgcaatctactaaaaaggcaattgaaattactgaatecagectt96ProMetGinSerThrLysLysAlalieGlulieThrGluSerSerUu-15-10-5gcggccgcggcaaccggctacgatgetgtagatgacctgctgcattat144AlaAlaAlaAlaThrGlyTyrAspAlaValAspAspLeuLeuHisTyr-l151015catgageggggtaacgggattcagattaatggcaaggatteaUttct192HisGluArgGlyAsnGlylieGinlieAsnGlyLysAspSerPheSer202530aacgagcaagetgggUgtttattacccgcgagaaccaaacctggaac240AsnGluGinAlaGlyLeuPhelieThrArgGluAsnGinThrTrpAsn354045ggttacaaggtatttggccagccggtcaaattaaccttctecttcccg288GlyTyrLysValPheGlyGinProValLysUuThrPheSerPhePro505560gactataagttctcttecaccaacgtcgccggcgataccgggctgage336AspTyrLysPheSerSerThrAsnValAlaGlyAspThrGlyLeuSer657075aagttcagegcggaacagcagcagcaggetaagctgtegctgcagtec384LysPheSerAlaGluGinGinGinGinAlaLysLeuSerLeuGinSer80859095tgggccgacgtcgccaatateaccttcaccgaagtggcggccggtcaa432TrpAlaAspValAlaAsnlieThrPheThrGluValAlaAlaGlyGin100105110aaggccaatateaccttcggcaattacagecagggtcgtcccggccac480LysAlaAsnlieThrPheGlyAsnTyrSerGinGlyArgProGlyHis115120125tatgattatggtacccaggcctacgccUcctgccgaacaccatttgg528TyrAspTyrGlyThrGinAlaTyrAlaPheLeuProAsnThrlieTrp130135140cagggccaggatttgggcggccagacctggtacaacgtcaaccaatec576GinGlyGinAspLeuGlyGlyGinThrTrpTyrAsnValAsnGinSer145150155aacgtgaagc"ccggcgaccgaagactacggccgccagacgttcacc624AsnValLysHisProAlaThrGluAspTyrGlyArgGinThrPheThr160165170175catgagattggccatgcgctgggcctgagecacccgggcgactacaac672HisGlulieGlyHisAlaUuGlyLeuSerHisProGlyAspTyrAsn180185190gccggtgagggcaacccgacctataacgacgtcaccUtgcggaagat720AlaGlyGluGlyAsnProThrTyrAsnAspValThrTyrAlaGluAsp195200205acccgccagttcagectgatgagetactggagtgaaaccaataccggt768ThrArgGinPheSerLeuMetSerTyrTrpSerGluThrAsnThrGly210215220ggcgacaacggcggtcactatgccgcggetccgctgctggatgacatt816GlyAspAsnGlyGlyHisTyrAlaAlaAlaProLeuLeuAspAsplie225230235gccgccattcagcatctgtatggcgccaacctgtegacccgcaccggc864AlaAlalieGinHisLeuTyrGlyAlaAsnLeuSerThrArgThrGly240245250255gacaccgtgtacggctt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