一種羧基化法β-環糊精修飾的低毒性功能化量子點及其製備方法

2023-06-10 08:05:46 1

專利名稱：一種羧基化法β-環糊精修飾的低毒性功能化量子點及其製備方法
技術領域：
一種羧基化法β -環糊精修飾的低毒性功能化量子點及其製備方法，製備的功能化量子點可以用於腫瘤標誌物等的特異性螢光檢測，屬於特異性分子識別診斷試劑領域。
背景技術：
葉酸是細胞(尤其是增殖旺盛的細胞)所必需的維生素，它參與多種代謝途徑的一碳轉移反應。葉酸的細胞轉運通過兩種跨膜蛋白，即低親和力的還原性葉酸載體和高親和力的葉酸受體來完成。目前已證實葉酸受體在多種腫瘤細胞表面過度表達，如卵巢癌、宮頸癌、子宮內膜癌、乳腺癌、肺癌、腦瘤、室管膜細胞瘤等，而在多數正常組織中的表達僅限於一些難於進入血液循環的上皮細胞頂膜。葉酸含有α和Y兩個羧基，易於修飾，同時具有低免疫原性、小體積、高化學穩定性和生物學穩定性，高腫瘤滲透性、易與藥物結合，與有機或水性溶劑的相容性佳以及低成本等優點，故葉酸介導的腫瘤靶向研究得到了迅速發展。用於生物分子和細胞標記與識別的螢光探針包括有機分子螢光探針和無機分子螢光探針兩類。有機分子螢光探針的種類儘管比較多，但存在著Stoke位移小，容易光漂白以及量子產率低等不足。無機分子螢光探針主要是量子點(Quantum Dots，QDs)。QDs是指半徑小於或接近於激子波爾半徑的半導體納米晶粒，粒徑通常為Ι-lOnm，一般為由II-VI族或III-V族元素構成的化合物。量子點作為一種新型螢光染料，具有很多獨特而優良的光學特性，包括(1)連續而寬的激發光譜，且螢光譜峰位置可通過改變QDs的粒徑進行調控， 這樣僅用一種波長的激發光源便可激發多種不同顏色螢光的QDs，進行多元螢光檢測。(2) 發射光譜窄，可同時顯現多種不同顏色而無重疊。(3)Mokes位移大，能夠避免發射譜與激發譜重疊，從而允許在低信號強度的情況下進行光譜學檢測。(4)抗光漂白能力強，而這種抗光漂白的高度光穩定性對於需要長時間成像的研究而言極為重要。(5)光穩定性高，便於獲得無背景幹擾的螢光信號等優良的光物理特性。(6)螢光產率高，強度強，單一量子點表現出的螢光亮度是有機螢光染料的10-20倍。因此，量子點在多個研究領域顯示出其獨特的應用前景。根據合成量子點時所採用溶劑的不同，量子點合成方法可歸結為兩大類，一種方法是在高沸點的有機溶劑中利用前軀體熱分解來合成，得到的產物螢光效率高、尺寸均勻、 穩定性好。另一種是利用穩定劑在水溶液中直接合成，產物的尺寸分布寬，螢光效率較低。 一般量子點的合成是在有機溶劑中進行的，在非金屬核的外面形成了疏水性的外殼，使得合成的量子點具有疏水性而不能在生物學上應用。為了使它們具有生物相容性，常對它們進行功能化，或對其進行第二層包被，可以增強其水溶性、核的持久穩定性以及懸浮性質， 使量子點具有更好的生物活性。通過修飾量子點的包被可以得到高度特異性的量子點，用於診斷(分子成像)和治療(生物載體)等。但是它們的潛在毒性就在於它們的包被上，如果這些包被脫離核，不管釋放出組合體的核(CdTe、CdSe)還是單一的金屬鎘(Cd)，都會產生毒性。或者，一些量子點包被材料本身就有細胞毒性，如醋酸甲醇(MAA)。同時，在光照和氧化條件下量子點可能降解，因此穩定性在其商業化進程中顯得至關重要。近紅外螢光探針在生物體內分子的診斷識別中起著關鍵的作用。因為近紅外波段 (60(T800nm)的光波避開了體內水，有氧及無氧血紅蛋白等主要吸收組織的最佳吸收波長， 因而具有良好的生物組織穿透能力，且對生物組織無損傷。因此具有近紅外發光特性的水溶性量子點更適合生物分析應用。環糊精(Cyclodextrin，簡稱⑶)是直鏈澱粉在由芽孢桿菌產生的環糊精葡萄糖基轉移酶作用下生成的一系列環狀低聚糖的總稱，通常含有6 12個D-吡喃葡萄糖單元。 其中研究得較多並且具有重要實際意義的是含有6、7、8個葡萄糖單元的分子，分別稱為 α-、β-、Y-環糊精。根據X-線晶體衍射、紅外光譜和核磁共振波譜分析的結果，確定構成環糊精分子的每個D(+)-吡喃葡萄糖都是椅式構象。各葡萄糖單元均以1，4_糖苷鍵結合成環。由於連接葡萄糖單元的糖苷鍵不能自由旋轉，環糊精不是圓筒狀分子結構而是略呈錐形的圓環。其中，環糊精的伯羥基圍成了錐形的小口，而其仲羥基圍成了錐形的大口。 形成略呈錐形的中空圓筒立體環狀結構。β-環糊精(β -⑶)分子結構如下式所示
權利要求
1.一種羧基化法環糊精修飾的低毒性功能化量子點，其特徵在於由β-環糊精通過化學方法連接上羧基，再進一步與葉酸偶聯形成葉酸-環糊精；所述量子點為低毒性功能化量子點，組成低毒性功能化量子點的元素為銀、鋅和銦；該量子點通過葉酸-β-環糊精修飾得到環糊精修飾的低毒性功能化量子點；該環糊精修飾的低毒性功能化量子點的組成為銀離子銦離子鋅離子 NaS2CN(C2H5)2 葉酸-β -環糊精的摩爾比為 0. 9-0. 95 0.9-0.95 0.1-0.2 3.5-4.5 4-6。
2.權利要求1所述羧基化法環糊精修飾的低毒性功能化量子點的製備方法，其特徵在於步驟如下(1)羧基-β-環糊精的製備在容器中加入4. 5-5. 5mmol的β -環糊精和55_65mL去離子水，在磁力攪拌情況下加入8-lOmmol KOH使β -環糊精全部溶解；逐漸升溫至45_55°C，加入9-llmmol羧基化試劑，連續攪拌條件下升溫至85-95°C並保持1小時，然後停止加熱；待反應體系冷卻至室溫後，用稀硫酸調節反應體系的PH為5-6，加入100-200mL無水乙醇，利用中性氧化鋁柱進行純化層析，採用55%-65%乙醇作為洗脫劑，收集洗脫液，濃縮洗脫液後真空乾燥，得到羧基-β-環糊精；(2)羧基-β-環糊精與葉酸的偶聯製備葉酸-β -環糊精a、葉酸的活化在容器中加入4.5-5.5mmol葉酸並溶解在ll_13mL無水二甲基亞碸中，在不斷攪拌條件下加入5.5-6. 5mmol 1-乙基-3- (3-二甲基丙胺)碳二亞胺鹽酸鹽和 5. 5-6. 5mmol N-羥基琥珀醯亞胺活化反應4小時；將活化後的葉酸滴加到含有180-220mg的雙氨基聚乙二醇的無水二甲基亞碸溶液中， 避光條件下反應10小時，然後通過矽膠柱層析的方法純化，獲得葉酸-聚乙二醇偶聯物；b、葉酸-聚乙二醇偶聯物與羧基-β -環糊精的偶聯在45-55mL無水二甲基亞碸溶液中加入1. 8-2. 2 mmol步驟(1)製備的羧基-β -環糊精，溶解後加入1.8-2. 2mmol 1-乙基_3_(3-二甲基丙胺)碳二亞胺鹽酸鹽和1. 8_2. 2mmol N-羥基琥珀醯亞胺活化反應6小時，然後將活化液滴加到上述含有葉酸-聚乙二醇偶聯物的緩衝液中，避光條件下反應M小時；反應的粗產物通過矽膠柱層析的方法純化，獲得葉酸-β-環糊精；(3)量子點的製備a、前驅體的製備將0. 9-0. 95mmol AgNO3>0. 9-0. 95mmol In (NO3) 3、0. 1-0. 2mmol Si(NO3)2溶於3-5mL的去離子水中，再將3. 5-4. 5mmol NaS2CN(C2H5)2溶於2. 5-7. 5去離子水溶液中，兩者混合後磁力攪拌20-40min除去其中的水分，並依次用10_14mL的去離子水和8-12mL甲醇洗滌，得到量子點前驅體二乙基二硫代氨基甲酸鹽；b、油溶性量子點的製備在氮氣保護條件下將步驟a所得量子點前驅體二乙基二硫代氨基甲酸鹽緩慢加熱至170-180°C，並保持該溫度40-60min，然後向其中加入2_4mL油胺， 繼續加熱24min後停止加熱，並逐漸冷卻至室溫；c、量子點的純化處理將步驟b所得油溶性量子點在500-2500r/min離心2-5min，取上清液，向其中加入8-12mL甲醇，攪拌l-5min後用真空抽濾方式得到純化的量子點；(4)量子點的功能化修飾取步驟(3)所得的純化量子點溶於1.5-8. 5mL三氯甲烷溶液中，步驟(2)所得葉酸- β -環糊精溶於1. 5-6. 5mL去離子水中，混合後攪拌3_10min，500_2500r/min離心，取水層即得產物羧基化法β-環糊精修飾的低毒性功能化量子點。
3.根據權利要求2所述羧基化法環糊精修飾的低毒性功能化量子點的製備方法， 其特徵在於所述羧基化試劑為2-氯乙酸鈉，3-氯丙酸鈉，3-溴丙酸鈉，4-氯丁酸鈉，4-溴丁酸鈉。
4.權利要求1所述羧基化法環糊精修飾的低毒性功能化量子點的應用，其特徵在於所述量子點作為探針用於腫瘤標誌物的特異性螢光檢測。
全文摘要
本發明涉及一種羧基化法β-環糊精修飾的低毒性功能化量子點及其製備方法，屬於特異性分子識別診斷試劑領域。本發明通過化學修飾方法在β-環糊精上連接功能基團羧基，得到羧基-β-環糊精；在1-乙基-3-(3-二甲基丙胺)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀醯亞胺的作用下，葉酸經活化後先與雙氨基聚乙二醇偶聯，再與羧基-β-環糊精偶聯，得到葉酸-β-環糊精；利用銀，鋅等低毒性元素作為原料，製備油溶性的近紅外量子點，並用葉酸-β-環糊精對其進行水溶性的修飾，得到羧基化法β-環糊精修飾的低毒性功能化量子點。本發明製備的量子點具有良好的水溶性，低毒性，發射光譜在近紅外區，並且由於偶聯了葉酸，可以用於腫瘤的特異性螢光檢測。
文檔編號C08B37/16GK102206487SQ20111010007
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月21日 優先權日2011年4月21日
發明者邵建輝 申請人:無錫榮興科技有限公司