乳豬胸腺蛋白及其製備方法和用途的製作方法

2023-06-11 02:50:51

專利名稱：乳豬胸腺蛋白及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及的是具有促進細胞增殖效應的動物胸腺蛋白，尤其是具有促進細胞增殖效應的乳豬胸腺蛋白，以及它們的製作方法和用途。
胸腺是一個分泌激素和產生多種細胞因子的免疫器官，由胸腺產生的一族多肽和蛋白質能控制調節著免疫反應的質和量。近年，國外對胸腺提取物的研究已引起重視。受胸腺活性物質能影響角膜及淋巴結上皮細胞增殖研究的啟發，我們從乳豬胸腺中提取出一組中分子量水溶性蛋白質，簡稱胸腺蛋白，並對其進行促細胞增殖活性的研究。
1972年，Goldstein等人成功地從小牛胸腺中分離到一組能調節免疫系統的多肽，命名為胸腺肽F5，生化分析表明，胸腺F5是具有活性的單一肽類，均為小分子肽類成份，分子量均小於15000道爾頓，但Goldstein報導的方法中，需要有超高速離心，丙酮沉澱等過程，工藝複雜，很難推廣使用。
1975年，Hooper等人在小牛胸腺肽的製備中第一次採用超濾技術，通過截留分子量小於15000道爾頓的胸腺肽組份來製備製劑，簡化了提純方法。
在這幾年中，許多人對小牛胸腺肽的進一步分離有生物活性的單肽類作了大量的工作，從胸腺肽組織中分離的具有免疫活性成分的分子量如下表
從上述內容可以看出，目前已經公開的研究結果，主要集中在小分子胸腺肽，分子量小於15000道爾頓，還有的學者認為，胸腺中具有生物活性的成份均是分子量在6000道爾頓以下的較小的多肽。不難看出，目前所提取的胸腺肽主要是小分子量的，而且工藝條件複雜。有時還需要通過Sephader-150柱層純化，也有人採用生理鹽水浸提，凍融後經透析而成。
本發明的主要目的是利用包括離心分離，透析的方法，從乳豬胸腺中製取一組中分子量的乳豬胸腺蛋白。
本發明的另一目的是提供一種簡單的方法，從而能有效的，可滿足實際需要的來生產這種中分子量的乳豬胸腺蛋白。
本發明的再一個目的是利用上述中分子量的乳豬胸腺蛋白，並利用這種中分子量的乳豬胸腺蛋白所具有的生物活性，即具有促進細胞增殖的能力，可明顯促進內皮細胞，成纖細胞的生長。
本發明還有一個目的，是利用這種中分子量乳豬的胸腺蛋白所具有的促進細胞增殖的能力，作為化狀品的主要成份之一，可有效的促進人體表皮細胞的增殖和代謝，從而達到美容或類似的目的。
下面具體描述本發明所述的中分子量的乳豬胸腺蛋白的製備工藝。
首先，選用40-60天豬齡的健康乳豬的胸腺，拔除胸腺上的脂肪組織，將胸腺高速搗碎，所要注意的是，應在儘可能短的時間內完成這些工作，在此期間，勻漿屬低溫高速搗碎，將搗碎後的勻漿加溫，溫度保持在80-90℃之間，時間為10-30分鐘，然後，離心分離，離心分離後去沉澱，留上清液，進行透析，所述的透析可以採用透析器，透析膜，也可以是其它能達到此目的的透析用具，透析膜或透析器的截留分子量為5萬，然後再用截留分子量為3萬的透析裝置進行第二次透析，將二次透析的液體進行濃縮，再經過常規手段的處理，如除菌、分裝，凍幹，最後就得到了分子量在3-5萬道爾頓的中分子胸腺蛋白。
上述實例是用來說明本發明工藝，而不是用來限制本發明，類似的方法都在本發明的範疇之內。


圖1是不同濃度的乳豬胸腺蛋白(TP)對內皮細胞(EC)的增殖狀況。
圖2是不同濃度的乳豬胸腺蛋白(TP)對小鼠3T3成纖維細胞(FC)的增殖狀況。
圖3是乳豬胸腺蛋白(TP)、成豬胸腺蛋白(TP)、胸腺肽注射液(TF)、肝細胞生長素注射液(HGF)對內皮細胞的增殖效應。
圖4是乳豬胸腺蛋白(TP)、成豬胸腺蛋白(TP)、胸腺肽注射液(TF)、肝細胞生長素注射液(HGF)對成纖維細胞的增殖效應。
圖3、圖4中1是乳豬胸腺蛋白(TP)、2是成豬胸腺蛋白(TP)、3是胸腺肽注射液(TF)、4是肝細胞生長素注射液(HGF)。
將上述方法製備的中分子胸腺蛋白進行各次試驗，具體內容如下。
樣品包括本發明中分子量的乳豬胸腺蛋白(TP)，分子量3-5萬。胸腺肽注射液(TF)，由廣東省生物製品研究所提供。促肝細胞生長素注射液由廣東省陽江製藥廠提供。內皮細胞(EC)的製備取健康產婦分娩後3小時內的臍帶，用D-Hanks′液反覆衝洗臍靜脈至無血跡，灌入0.25%胰蛋白酶5ML，置37℃水浴內10分鐘，收集消化液，用5ml含20%小牛血清的1640培養液衝洗臍靜脈，收集衝洗液，將消化液及衝洗液合併收入離心管內，1000rpm，離心10分鐘，去上清。加入內皮細胞培養液(內含20%小牛血清，200u/ml青黴素，0.2ug/ml鏈黴素，200ug/mlECGS)稀釋沉澱細胞，將細胞接種於玻璃培養瓶內，置50%CO2，37℃細胞培養箱內培養，每2-3天換液一次。直至細胞單層形成，即進行傳代培養。
傳代培養時，用D-Hanks′液輕洗細胞單層2-3遍。用0.06%胰蛋白酶在室溫下消化1-2分鐘，棄消化液，加入內皮細胞培養液，並用吸管吹打20-30次，製成細胞懸液。以1∶2-3比率傳代。用於實驗的為2-3代細胞，經V因子相關抗原(VR.Ag)的抗體檢測，確認為血管內皮細胞後方作為生物效應測定用細胞。
小鼠3T3成纖維細胞(FC)由第一軍醫大學珠江醫院提供(培養基為1640培養基加20%小牛血清)。
本發明的乳豬胸腺蛋白生物效應測定每次取24孔塑料細胞培養板3塊，於每個培養孔內(面積2cm)加入2X10個細胞，內皮細胞或成纖維細胞各72孔，將各檢測樣品(乳豬胸腺蛋白、成年豬胸腺蛋白、胸腺肽注射液(TF)、肝細胞生長素注射液(HGF)，按不同濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml)分別加入3孔細胞中平行檢測。每份樣品設立3孔空白對照(與鹽水做對照)。將上述細胞置5%CO2，37℃細胞培養箱內靜置培養72小時，收穫細胞，臺盼藍染色，計數每孔內活細胞數。計數方法為置顯微鏡下每孔隨機計數5個高倍視野下的細胞數，取其均值，按下列等式換算成每平方釐米培養出的細胞數。
ECs/cm＝細胞計數均值/0.19625x100[ECs內皮細胞數，0.19625為每高倍鏡視野(X400)面積，單位mm]，數據經統計學處理。
不同濃度的乳豬胸腺蛋白(TP)對內皮細胞(EC)、小鼠3T3成纖維細胞(FC)增殖狀況見圖1.圖2。
圖1、圖2提示，本發明的乳豬胸腺蛋白(TP)對內皮細胞(EC)、小鼠3T3成纖維細胞(FC)均有明顯的促增殖生物效應，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，而且增殖效應與乳豬胸腺蛋白(TP)的最佳濃度有關(0.2mg-0.4mg/ml)。
各種不同檢測樣品對內皮細胞(EC)、小鼠3T3成纖維細胞(FC)增殖效應的影響比較，結果見圖3，圖4。
圖3、圖4提示1.本發明的乳豬胸腺蛋白(TP)有明顯促進內皮細胞(EC)、小鼠3T3成纖維細胞(FC)增殖的作用。2.成年豬胸腺蛋白、胸腺肽注射液(TF)、促肝細胞生長素注射液(HGF)三種被檢樣品均無明顯促內皮細胞(EC)、小鼠3T3成纖維細胞(FC)增殖活性，與對照組比較無明顯差異(P＞0.05)。3.促肝細胞生長素注射液(HGF)對內皮細胞(EC)雖然有低水平的刺激現象，但與乳豬胸腺蛋白(TP)相比仍有顯著性差異，與成年豬胸腺蛋白、胸腺肽注射液(TF)結果比較無明顯意義。說明乳豬胸腺蛋白(TP)中確存在著一組能提高內皮細胞(EC)、小鼠3T3成纖維細胞(FC)增殖的活性組份。
自1966年Goldstein等首先研究小牛胸腺的丙酮提取物，1975年進一步用硫酸銨劃分得到的Fr5以來，大多數學者均集中在小分子Fr5的理化特性，生物活性，作用機理、和開發利用方面的研究。對胸腺中分子及大分子蛋白類研究較少。本發明提取的中分子量乳豬胸腺蛋白(TP)經高效液相色譜分析共有6個組份峰、6條電泳帶，紫外掃描在波長280nm中有一主要吸收峰，仍屬一組中分子蛋白類混合物。本發明所述的中分子量乳豬胸腺蛋白(TP)提取方法簡便，性質穩定，成本低，經用內皮細胞(EC)，小鼠3T3成纖維細胞(FC)連續增殖傳代培養研究發現，乳豬胸腺蛋白(TP)中存在著一組能明顯促進內皮細胞(EC)，小鼠3T3成纖維細胞(FC)增殖效應的活性組紛，而且出現增殖效應與乳豬胸腺蛋白(TP)的最佳濃度相關的現象。乳豬TP中是否存在著一組與內皮細胞生長因子(EGF)，成纖維細胞生長因子(FGF)相同或類似的或組份和結構不同而功能相同的物質，目前仍未明了。但從乳豬胸腺蛋白(TP)提取材料的來源，提取工藝和物質分子量結果分析推測，本發明的中分子量乳豬胸腺蛋白(TP)與目前國內外報導的小分子(分子量＜1.8萬)多肽類物質，內皮細胞生長因子(EGF)，成纖維細胞生長因子(FGF)，胸腺肽注射液(TF)，促肝細胞生長素注射液(HGF)差異較大，而本發明圖3，圖4結果也表明，乳豬胸腺蛋白(TP)與成年豬胸腺蛋白(TP)、胸腺肽注射液(TF)、促肝細胞生長素注射液(HGF)的作用效應不同。
我們根據KomarovFI胸腺提取物與胃、十二指腸潰瘍有關的報導，採用本發明所述的中分子量乳豬胸腺蛋白(TP)外用治療口腔潰瘍(1×1.2cm)，皮膚感染糜爛長期不愈傷口(4×5cm)的患者，乳豬胸腺蛋白(TP)表現出良好的抗感染和明顯促進肉芽組織生長效果。研究初步表明本發明乳豬胸腺蛋白(TP)在實驗室促內皮細胞(EC)、小鼠3T3成纖維細胞(FC)增殖效應與臨床外用治療促進傷口癒合的結果相吻合。本發明乳豬胸腺蛋白(TP)是一種還末受到重視的中分子蛋白，有明顯促進內皮細胞(EC)、小鼠3T3成纖維細胞(FC)增殖的活性物質。至於胸腺蛋白本身的理化特性如何？乳豬胸腺與成年豬胸腺之間的差異，乳豬胸腺蛋白(TP)與目前國內外報導的各種細胞因子有什麼內在聯繫仍需進一步全面的深入研究探索。我們認為開展對乳豬胸腺中分子蛋白類的實驗研究有著新的廣闊前景，而且對進一步開發應用乳豬胸腺有十分重要的價值。
我們採用中分子乳豬胸腺蛋白初步臨床應用於治療口腔潰瘍及皮膚損傷取得了良好效果。用注射用水稀釋中分子乳豬胸腺蛋白至濃度為2mg/ml的水溶液。10例口腔潰瘍患者應用該液體塗抹潰瘍表面，每日2-3次。治療1-3日，10例患者(2例治療1天後，6例2天後，2例3天後)潰瘍瘡面均完全癒合，並無感染現象發生，較同期對照組(治療4-5天後癒合)療效顯著。另有3例皮膚損傷患者用以該品水溶液浸溼的紗布局部外敷皮膚瘡面，每天換藥一次，連續敷用4-5日後，發現其中2例感染糜爛傷口有新生的肉芽組織及表皮生成，瘡面炎性滲出及紅腫明顯消除。結果提示胸腺蛋白有良好的抗感染和明顯促進肉芽組織生長的效果，這與胸腺蛋白實驗室促進內皮細胞(EC)、小鼠3T3成纖維細胞(FC)的增殖效應相吻合。
圖3，4方框中空白為試樣，陰影為對照。
權利要求
1.一種中分子量乳豬胸腺蛋白，其特徵在於本發明所述的中分子量乳豬胸腺蛋白(TP)經高效液相色譜分析共有6個組份峰、6條電泳帶，紫外掃描在波長280nm中有一主要吸收峰，本發明所述的中分子量乳豬胸腺蛋白(TP)的分子量在3-5萬道爾頓之間。
2.權利要求1所述的中分子量乳豬胸腺蛋白的製備工藝，包括選料、搗碎、離心分離、透析、濃縮、除菌、分裝，凍幹，其特徵在於首先選用40-60天豬齡的健康乳豬的胸腺，拔除胸腺上的脂肪組織，將胸腺高速搗碎，所要注意的是，應在儘可能短的時間內完成這些工作，在此期間，勻漿屬低溫高速搗碎，將搗碎後的勻漿加溫，溫度保持在80-90℃之間，時間為10-30分鐘，然後，離心分離，離心分離後去沉澱，留上清液，進行透析，，透析的截留分子量為5萬，然後再用截留分子量為3萬的透析裝置進行第二次透析，將二次透析的液體進行濃縮。
3.權利要求2所述的中分子量乳豬胸腺蛋白的製備工藝，其特徵在於所述的透析可以採用透析器，透析膜，也可以是其它能達到此目的的透析用具。
4.權利要求1所述的中分子量乳豬胸腺蛋白的用途，其特徵在於所述的中分子量的乳豬胸腺蛋白，並利用這種中分子量的乳豬胸腺蛋白所具有的生物活性，即具有促進細胞增殖的能力，可明顯促進內皮細胞，成纖細胞的生長。
5.權利要求1所述的中分子量乳豬胸腺蛋白的用途，其特徵在於所述的中分子量乳豬的胸腺蛋白具有的促進細胞增殖的能力，作為化狀品的主要成份之一，可有效的促進人體表皮細胞的增殖和代謝，從而達到美容或類似的目的。
全文摘要
本發明涉及的是具有促進細胞增殖效應的動物胸腺蛋白，尤其是具有促進細胞增殖效應的乳豬胸腺蛋白，以及它們的製作方法和用途。本發明主要是利用包括離心分離，透析的方法，從乳豬胸腺中製取一組具有促進細胞增殖的能力、可明顯促進內皮細胞、成纖細胞生長的中分子量乳豬胸腺蛋白。本發明還有一個目的是利用這種中分子量乳豬胸腺蛋白所具有的促進細胞增殖的能力，作為化妝品的主要成分之一，可有效的促進人體表皮細胞的增殖和代謝，從而達到美容或類似的目的。
文檔編號C07K1/14GK1081445SQ9210564
公開日1994年2月2日 申請日期1992年7月18日 優先權日1992年7月18日
發明者陳光明, 楊富強, 謝汝錦, 邵巖, 張宜俊 申請人:中國人民解放軍空軍廣州醫院