一種鹽芥耐鹽性調控miRNA—tsa-miRn1927及其應用的製作方法

2023-06-10 19:30:41 1

專利名稱：一種鹽芥耐鹽性調控miRNA—tsa-miRn1927及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種鹽芥耐鹽性調控miRNA — tsa-miRnl927及其應用，屬於生物技術技術領域。
背景技術：
土壤鹽潰化已成為影響農作物生長發育、產量和品質的一個重要因素，是農作物減產的主要原因之一。目前，世界上約有20%的可耕地和至少40%的灌溉田具有不同程度的鹽潰化，隨著人口的劇增及工業化的高速發展，可耕地面積急劇下降，不合理灌溉、工業汙染的加劇和化肥使用不當，造成了大量良田的次生鹽潰化，預計到2050年全球將有50%的耕地發生不同程度的鹽潰化。自然界中，植物對鹽的適應有明顯的差異，適應範圍非常廣泛，既有鹽敏感的甜土植物，又有耐鹽的鹽生植物。由於大多數農作物為鹽敏感的甜土植物，鹽依然是影響農作物產量的主要限制因素。目前，對植物耐鹽機理的研究已有一定的進展，例如擬南芥S0S1、S0S2、S0S3途徑的發現及其耐鹽機理的闡明(Zhu J.K.Salt and drought stress signal transduction in plants.Annu.Rev.PlantBiol.，2002, 53:247-273.), Blumwald實驗室過量表達AtNHXl對於提高植物耐鹽性所產生的影響(Apse Μ.P, Blumwald E, etal.Salt Tolerance conferred by Overexpression ofa Vacuolar Na./H+antiporter in Arabidopsis.Science.1999，285:1256-1258.)等。但目前國際上對植物耐鹽機理的研究，主要集中於甜土植物，因而對於植物耐鹽性機理的了解還存在一定的局限性。鹽芥(Thellungiella salsuginea)是與擬南芥近緣的植物耐鹽分子遺傳學研究的新模式系統，鹽芥的基因組測序已由美國農業部在2011年底完成，其基因組序列網站參見:http://www.phytozome.net/thellungiella.php。鹽芥和擬南芥同為十字花科植物，在cDNA水平上兩者存在90%- 95%的相似性。但相對於甜土植物擬南芥，鹽芥為一種典型的鹽生植物，能天然適應於鹽脅迫的環境，即使短時間暴露於500mM NaCl也可完成其生長史。隨著鹽芥基因組測序的完成，鹽芥功能基因組學尤其是耐鹽相關基因的功能已成為其研究工作的重點。miRNA為廣泛存在於真核生物中大約21_24nt的非編碼RNAs，植物miRNAs大多靶向轉錄因子等調控蛋白，從而處於植物基因表達調控的中心位置。而逆境脅迫(鹽、硫或磷匱乏和氧化脅迫等)不僅會誘導植物蛋白質編碼基因的表達，也誘導一些非蛋白質編碼基因miRNA的表達。植物miRNAs是目前國際研究的熱點，但僅有少數實驗室關注耐鹽相關miRNAs，且主要是以模式植物擬南芥和水稻等為試材，例如在擬南芥、水稻和楊樹等物種中克隆到與鹽、磷缺乏、硫缺乏、氧化和力學脅迫等相關的miRNAs ;結果表明miRNAs作為革巴蛋白的負調節因子，其調節功能不僅在於植物發育、也在對鹽等逆境脅迫的應答等過程中擔任重要的調控作用。鑑於土壤鹽潰化已成為限制農業生產的主要因素之一，通過研究植物耐鹽脅迫的生理生化和分子生物學機制，挖掘耐鹽基因資源，並運用基因工程手段培育耐鹽作物，對於提高農作物的產量具有重要的現實意義。因而，以鹽芥這一耐鹽分子遺傳學研究的新模式系統為試材，進行其miRNAs及其與耐鹽性關係的研究，具有一定的前瞻性和創新性。另外，在可檢索的現有技術中，對鹽芥miRNAs的研究還未見報導。

發明內容
本發明針對現有技術的不足,提供來源於鹽芥的miRNA—tsa_miRnl927鹽芥耐鹽性調控miRNA、其前體序列及其應用。為解決上述技術問題，本發明所採取的技術方案如下:一種鹽芥耐鹽性調控miRNA，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。上述鹽芥耐鹽性調控miRNA的前體，核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。編碼上述鹽芥耐鹽性調控miRNA的前體的DNA片段，核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。上述鹽芥耐鹽性調控miRNA、鹽芥耐鹽性調控miRNA的前體在培育耐鹽轉基因作物中的應用。作為上述應用的一種優選技術方案，步驟如下:在作物中過表達SEQ ID N0.1所示的鹽芥耐鹽性調控miRNA 或者SEQ ID N0.2所示的鹽芥耐鹽性調控miRNA的前體，或抑制SEQ ID N0.1所示的鹽芥耐鹽性調控miRNA或者SEQ ID N0.2所示的鹽芥耐鹽性調控miRNA的前體，培育出具有高耐鹽性的轉基因作物。上述作物為小麥、水稻、玉米或棉花。本發明的實驗Solexa測序結果證明，tsa-miRnl927受鹽脅迫的調節,說明其在鹽芥的高鹽耐性機制中起重要作用。鑑於此，可利用該基因進行耐鹽轉基因作物的培育，進而對於提高作物的產量具有潛在的應用價值。有 益效果本發明採用Solexa高通量測序技術及隨後的生物信息學分析和實時定量PCR的技術，首次從鹽芥中鑑定了 tsa-miRnl927, tsa_miRnl927在鹽處理後下調，鹽處理小RNAs庫中其計數0，而對照中為2363，tsa-miRnl927在鹽處理後表達受到嚴重抑制；經驗證，tsa-miRnl927在植物耐逆性尤其是耐鹽性中起重要作用，並在耐鹽作物培育中具潛在的應用價值。


圖ltsa_miRnl927前體序列的二級結構圖；其中:陰影部分為成熟miRNA所在位置；圖2Solexa測序中tsa_miRnl927在對照和鹽處理下的表達豐度的柱狀示意圖；其中:CL為正常生長鹽芥tsa-miRnl927的表達水平，TL為200mM NaCl處理下鹽芥tsa_miRnl927的表達水平；圖3tsa-miRnl927 對靶基因 Ninja-family 蛋白 AFP4、轉錄因子 PH0X2/ARIX 和絲氨酸/蘇氨酸蛋白質磷酸酶基因的mRNA降解示意圖；圖4為轉基因鹽芥與野生鹽芥在不同濃度鹽脅迫條件下鮮乾重的柱狀示意圖；其中:A圖為鮮重的柱狀示意圖，M3-14為轉基因鹽芥M3-14、M5-3為轉基因鹽芥M5-3、WT為野生型鹽芥；B圖為乾重的柱狀示意圖，M3-14為轉基因鹽芥M3-14、M5_3為轉基因鹽芥M5-3、WT為野生型鹽芥。
具體實施方案下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步說明，但本發明所保護範圍不限於此。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為本領域常規方法。實施例1:鹽芥種子採集和種植在山東省東營市黃河三角洲鹽鹼地收集野生型鹽芥(Thellungiellasalsuginea)的種子，曬乾,經過表面消毒:體積百分比為70%的酒精,處理lmin, lwt%NaC10溶液，渦旋15min，無菌雙蒸水衝洗後播種於MS培養基中，光照培養箱的溫度設定:白天25°C，16h，晚間22°C，8h。待長出2片真葉後轉移到Hogland液體培養基上，培養5周後，進行分組。NaCl處理組為Hogland營養液中加入NaCl使其終濃度為200mM，培養24小時；對照組為不含NaCl的Hogland營養液，培養24小時。MS培養基組分如下:大量元素50ml/L,韓鹽溶液50ml/L,微量元素溶液5ml/L,鐵鹽溶液10ml/L，維生素溶液10ml/L，蔗糖30g/L，瓊脂粉7.5g/L。其中，大量元素為20 倍母液，組分為:KN0338g/L，NH4N0333g/L, MgSO4.7H207.4g/L, KH2P043.4g/L ；鈣鹽溶液為20倍母液，組分為=CaCl2.2H208.8g/L ；微量元素溶液為200 倍母液，組分為:K10.166g/L，H3BO3L 24g/L，MnSO4.4H204.46g/L, ZnSO4.7H201.72g/L, Na2MoO4.2H200.05g/L, CuSO4.5H200.005g/L, CoCl2
6H200.005g/L ；鐵鹽溶液為100倍母液組分為:FeS04—EDTA3.67g/L ；維生素溶液為100倍母液，組分為:煙酸0.05g/L,維生素B60.05g/L,維生素BI0.0lg/L,甘氨酸 0.2g/L，肌醇 10g/L。Hogland 營養液每升組分如下:Ca (NO3) 2945mg, KN03607mg, (NH3) 3P03 磷酸銨115mg，MgS04493mg,鐵鹽溶液IOml，微量元素溶液5ml，調節pH值到6.0。其中鐵鹽溶液為100倍母液，組分為:FeS04—EDTA3.67g/L ；微量元素溶液為200 倍母液，組分為:K10.166g/L，H3BO3L 24g/L，MnSO4.4H204.46g/L, ZnSO4.7H201.72g/L, Na2MoO4.2H200.05g/L, CuSO4.5H200.005g/L, CoCl2.6H200.005g/Lo實施例2:鹽芥miRNA文庫的構建和Solexa測序
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將實施例1得到的正常生長條件下-對照組(CL)和200mM NaCl處理下-處理組(TL)的鹽芥樣品送往深圳華大基因研究所構建miRNA文庫，進行Solexa測序。測序後去除3』接頭、汙染序列、小於18nt序列和polyA序列後，在CLmiRNA文庫中總共獲得高質量小RNA片段(sRNA) 12010658條，在TL miRNA文庫中總共獲得高質量小RNA片段(sRNA)12330771條。生物信息學預測結果顯示tsa-miRnl927成熟體序列為:CAAGGCAGAAGAAGGCUGUUU (SEQ ID N0.1)。
tsa_miRnl927 前體序列為:GCAAAGUGAUCAAGGCAGAAGAAGGCUGUUUUGGCAAUAGGAUUAGCGCUGAUCCUAUUGCCAAAACAGCCUCUUCUUCCUUGUUUACUUUGA (SEQ ID N0.2),其在基因組中位置為:scaffold_19:2418388:2418480:+。根據tsa_miRnl927的前體和成熟體序列，用RNAstructure軟體得到tsa_miRnl927前體的二級結構，如圖1所示，陰影部分為成熟miRNA所在位置，其前體序列摺疊成一種穩定的莖環結構，能量值為-63.1。屬於miRNA前體典型的二級結構，符合miRNA前體的結構特徵。測序結果顯示tsa_miRnl927在正常條件下的測序豐度為2363，鹽處理後的測序豐度為0，表明tsa-miRnl927的表達在受到鹽脅迫後被抑制(圖2)。預示著tsa_miRnl927在鹽芥適應高鹽脅迫機制中起重要作用。在農作物(例如玉米、小麥、水稻、油菜、大豆等)中過量或者抑制tsa-miRnl927的表達，將影響作物對鹽脅迫的適應能力。實施例3:tsa-miRnl927祀基因的驗證和功能分析利用miRNA和靶基因的互補性，通過生物信息學的方法在鹽芥全基因組水平預測tsa_miRnl927 的祀基因。按照 Schwab 等的方法(Schwab R et al.,Specific effects ofmicroRNAs on plant transscriptome.Dev.Cell, 2005)使用以下規則:sRNA與祀基因間的錯配不得超過4個(G-U配對認為0.5個錯配)；在miRNA/靶基因複合體中不得有超過2處發生相鄰位點的錯配；在miRNA/靶基因複合體中，從miRNA的5』端起第2_12個位點不得有相鄰位點都發生錯配；miRNA/靶基因複合體的第10-11個位點不得發生錯配^miRNA/靶基因複合體中，從miRNA的5』端起第1-12個位點不得有超過2.5個錯配;miRNA/靶基因複合體的最低自由能(MFE)應不小於該miRNA與其最佳互補體結合時MFE的75%。用Mireap軟體在鹽芥全基因組水平預測靶基因。表ltsa_miRnl927 靶基因預測
權利要求
1.一種鹽芥耐鹽性調控miRNA，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.權利要求1所述鹽芥耐鹽性調控miRNA的前體，核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
3.編碼權利要求2所述鹽芥耐鹽性調控miRNA的前體的DNA片段，核苷酸序列如SEQIDN0.3 所示。
4.權利要求1所述鹽芥耐鹽性調控miRNA、權利要求2所述鹽芥耐鹽性調控miRNA的前體在培育耐鹽轉基因作物中的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其特徵在於，步驟如下:在作物中過表達SEQID N0.1所示的鹽芥耐鹽性調控miRNA或者SEQ ID N0.2所示的鹽芥耐鹽性調控miRNA的前體,或抑制SEQ ID N0.1所示的鹽芥耐鹽性調控miRNA或者SEQ ID N0.2所示的鹽芥耐鹽性調控miRNA的前體，培育出具有高耐鹽性的轉基因作物。
6.如權利要求5所 述的應用，其特徵在於，所述作物為小麥、水稻、玉米或棉花。
全文摘要
本發明涉及一種鹽芥耐鹽性調控miRNA—tsa-miRn1927及其應用。鹽芥耐鹽性調控miRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本發明還涉及鹽芥耐鹽性調控miRNA的前體、鹽芥耐鹽性調控miRNA的前體的DNA片段及其在培育耐鹽轉基因作物中的應用。本發明提供的鹽芥耐鹽性調控miRNA—tsa-miRn1927在植物耐逆性尤其是耐鹽性中起重要作用，並在耐鹽作物培育中具潛在的應用價值。
文檔編號A01H5/00GK103146701SQ201310039148
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月31日 優先權日2013年1月31日
發明者王興軍, 趙傳志, 張荃, 趙術珍, 侯蕾, 夏晗, 李長生, 李愛芹 申請人:山東省農業科學院高新技術研究中心