用於間質幹細胞優化擴增和移植的方法與組合物的製作方法

2023-06-10 15:22:26 1

專利名稱：用於間質幹細胞優化擴增和移植的方法與組合物的製作方法
用於間質幹細胞優化擴增和移植的方法與組合物
背景技術：
本發明整體上涉及用於幹細胞分離、擴增及植入有需要的宿主的組合物和方法。 更特別的，本發明涉及採用在優化的生長條件下擴增的自體間質幹細胞對靶組織進行置換 和修復。
背景技術：
間質幹細胞屬於多能母細胞或胚胎樣細胞，其位於血液、骨髓、皮膚和骨膜中。通 常，這些細胞經過一段時間以及在各種環境條件下能夠自我更新，並且分化為軟骨、骨及 其他結締組織。最近，不同的研究者研究了使用這些細胞修復或再生靶組織例如，骨、軟 骨等的可能性。據報告，MSC以這種方式在多個動物模型中有再生的能力。參見Acosta 等，(2005)Neurosurg Focus 19(3) :E4 ；Barry (2003)Novartis Found Symp. 249 :86-102, 170-4,239-41 ；Brisby 等，(2004) Orthop Clin. North Am. 35(1) 85-89 ；Buckwalter 禾口 Mankin(1998)Instr Course Lect. 47 487-504 ；Caplan (1991)J Orthop Res. 9(5) 641-650。而且，這些研究結果正在拓展到對人的臨床試驗中，然而，大部分這些臨床試驗需 要運用高濃度重組細胞因子和生長因子進行分離的非自體MSC的體外擴增。例如，大多數 用於人的研究利用從骨髓(或外周血)分離的MSC，然後用摻加(spkie)有不同重組生長 因子的胎牛血清(FBS)培養基在實驗室裝置中對細胞進行離體(ex vivo)擴增。這些補充 FBS的培養基顯示出支持MSC擴增的能力，但也存在感染載體的交叉汙染風險；使用未經食 品與藥品管理局(FDA)批准的藥物/因子，例如重組TGFHGF，表現出種間反應，並有可 能導致癌症性祖細胞形成的潛力提高。此外，大多數MSC用於人的研究均需要受訓的實驗室人員和實驗室設備，以進行 分離的MSC的擴增。這些技術並非醫師和/或醫院人員應該具備的技能，尤其是考慮到醫 師在法律上受FDA協議及有關非FDA批准藥品的程序的約束。因此，基於MSC的治療很難 以實際應用方式加以實施，實際應用方式，即利用醫院的設備由醫院工作人員。由於存在這 樣各種各樣的顧慮，大多數基於MSC的研究針對非自體細胞，這些細胞已經被分離並培養 成永久細胞系。Doucet(Doucet，Ernou 等。2005 J. Cell Physiol 205(2) :288_36)最近描述了一 項技術，即用5%富含培養基的血小板裂解物擴增年輕健康供體的MSC。然而，Doucet的研 究並未確定這些程序對年長患者、退行性關節病(例如骨關節炎)患者或其他患者特異性 病症的治療效果。除了用富含5%血小板裂解物的培養基之外，該研究未以其他任何擴增條 件進行過。由此可見，已經表明，在患者中MSC生長會由於患有或沒有骨關節炎、年齡、性別 以及基於某些遺傳表型而有寬範圍的變化。因此，Doucet的研究的實用性非常受限於實際 生命狀況，其中大多數需要基於MSC的治療的患者通常是年長的，或者患有退行性關節、器 官或脊椎疾病。Doucet數據也不適用與其它骨代謝疾病如非血管性壞死或骨壞死。此外， Doucet的結論結果不是性別或年齡特異性的，其對於如何治療不同的性別或如何從高齡的 患者擴增MSC幾乎沒有指導。在培養中，MSC能夠容易分化，其取決於細胞因子暴露、環境條件(壓力、附著機會、傳代處理等)或其他化學物質暴露。例如，暴露於不同水平的TGF-0、FGF和/或PDGF， 均能影響培養物中產生的細胞的最終細胞表型。此外，將細胞長時間保留在培養物中也會 影響其分化潛能。可以將細胞培養達到一定程度的細胞形態、匯合或密度，所有這些都影響 所產生的細胞終產品及其用於特定類型組織修復的可能性。因此，本發明集中於控制因子 /參數，以期獲得均一化且具有一定促恢復性質的的細胞產品。在用MSC進行置換或修復組織的過程中，其中一個考慮就是非自體細胞的使用。 儘管MSC傳統上被認為是免疫豁免(immun印rivileged)細胞，最近研究證明，MSC在外 源性宿主體內活化自然殺傷細胞系統(Spaggiari，Capobianco等。2006 Blood 107(4) 1484-90)。這就使得使用非自體細胞變得困難，因為預料宿主免疫系統會攻擊這些外源細 胞，並有可能大量殺死(decimate)移植的MSC群，這就嚴重限制了其修復能力。此外，Ueda 發表的最近一項研究對非自體細胞的使用具有深遠的意義(Ueda，Inaba等。2007 Stem Cells 25(6) 1356-63) 這項研究證明，患有骨質疏鬆的年老小鼠通過骨髓載體將疾病傳 給了正常的小鼠。這暗示，年老的骨質疏鬆小鼠的MSC—旦轉移到正常健康小鼠體內就會 將患病狀態也傳給正常健康小鼠。傳播疾病的遺傳載體值得關注，這是因為理論上任何供 體MSC都需要對所有已知的遺傳易感性與由供體轉移的疾病進行篩選。在本領域中存在對這樣的MSC擴增技術的需求，其不使用未經FDA批准的藥物或 生長因子，且能夠有效用於置換有需要的患者的組織。這種置換術應當利用自體細胞，其中 所述自體細胞已經基於患者的醫療狀況、年齡、性別和其他相關置換條件而進行優化擴增。 此外，存在對自體技術的需求，以產生具有已知的再生能力並進行嚴格質量控制的同源細 胞系。本發明旨在克服解決以上討論的一個或更多個問題。

發明內容
本發明的實施方式提供用於自體人間質幹細胞(MSC)離體擴增以及後續植入有 需要的患者靶組織的組合物和方法。這些MSC就它們的移植以及置換/再生靶組織的能 力而被優化，例如，再生膝關節軟骨組織的能力。如上所述，它們還通過嚴格的質量控制被 優化以產生均一的細胞系，表達一種或更多種下列細胞表面抗原⑶29、⑶44、⑶59、⑶73、 ⑶90、⑶166和⑶105，在某些實施方式中表達兩種、三種、四種、五種、六種或七種上述細 胞表面抗原。另外，本文所述的某些優化的細胞不表達一種或更多種下列細胞表面抗原 CD14、CD31、CD45 和 / 或 CD106。本發明的一些方面包括新型擴增組合物，其不需要純化的或重組生長因子、細胞 因子或非天然存在的人體因子。特別是，擴增組合物被設計為包括引入不同數量(在不同 時機)血小板裂解物，用於優化細胞生長、尤其是優化細胞在植入目標患者時的細胞生長。 某些情況下的優化包括以一種可控制的方式擴增細胞，以促進細胞向有需求患者體內的成 功移植；在某些情況下細胞生長與細胞生長條件受到監測和改變，以維持細胞在預先設定 的「生長通道(growth channel)」內，S卩，在進入有限數量的細胞傳代之前將細胞擴增至需 要的數量。這些基於血小板裂解物的生長條件提供在這一生長通道內MSC離體增殖必需因 子的持續自分泌釋放。此外，為了保證均一性和嚴格的質量控制，該「生長通道」具有多項 反映指標，如細胞密度、形態特徵和培養模式。而且，這些被設計為產生符合已知細胞修復特性的細胞擴增，因為這種細胞生長配方的一些小變動都將導致產生具有不同分化及修復 特性的完全迥異的細胞產物。本發明的一些方面亦包括使患者做好接受經過優化培養的MSC的準備，其通過移 植含特定數量血小板或血小板裂解物的細胞。細胞與血小板的移植可同時發生或者相繼發 生。在典型的實施方式中，MSC、血小板和血小板裂解物均來自即將向其移植MSC、血小板/ 血小板裂解物的患者。本發明的一些方面還包括從需要基於MSC的恢復治療的患者分離MSC的方法，運 用通過不同數量血小板裂解物和基於細胞特性(例如匯合、形態特徵、細胞培養模式等等) (為保證滿足特定需要的適當均一性生長所必需，即在生長通道中生長)的培養決定因素 獲得的細胞特異性擴增數據對分離的MSC進行優化擴增，以及含有或不含相互依賴的MSC 生長促進物質的擴增細胞的移植。本發明的一些方面是在當收集細胞並將其重新植入骨關節炎或其他軟骨病或骨 代謝病(如非血管性壞死或骨質疏鬆)患者內時特別有用，條件是從這些患者常規收穫的 這些細胞顯示了幾乎沒有在置換療法中的使用前景。然而，這一觀點並不意味著將本發明 的範圍或用途僅限於一個應用。本發明的一些方面還提供一個生長通道，確保收集的MSC以一種天然的方式保 持，這樣有利於細胞被移植回到患者體內。這些細胞是自體的，並優化在靶中的生長潛能， 其僅使用來自與收穫細胞的相同宿主細胞的天然因子，即沒有合成的或重組因子以促進細 胞生長。在典型的生長通道實施方式中，細胞在進行第10次傳代之前被擴增並準備好實 施，在其他實施方式中細胞通過它們的第3次、第4次、第5次、第6次、第7次第8次或第9 次傳代(收集後)而被擴增並準備好實施。在大約第10次傳代之後移植的細胞表現出臨 床應用方面無效性升高趨勢。本發明的一些方面還提供通過手工細胞計數確保擴增的MSC保持在生長通道內。 在本發明的其他方面中，MSC通過可見的指示特徵考察確定細胞是否處於生長通道內，適當 的指示特徵包括培養形態、培養模式和培養密度。在某些方面，細胞數目和可見的細胞考察 指標用於指示細胞是否處於本發明的生長通道內。注意，可見的考察可在培養MSC的位點 進行，例如，已經籤約擴增這些細胞的醫院血庫，或者通過遙控位點實現，即經驗豐富的組 織培養技術人員通過數字顯微攝像機(現場攝像、更新圖片或其他類似技術)觀察細胞培 養狀況，然後向遠距離現場工作人員提供有關培養細胞狀態的反饋信息。最後，本發明的一些方面提供細胞群，其被使用本發明所述的方法就所鑑定的 表型進行富集，所述表型包括以下一種或更多種細胞表面抗原⑶29、⑶44、⑶59、⑶90、 ⑶166、⑶73和⑶105。本文所鑑定的細胞進一步典型地是下列陰性的⑶14、⑶31、⑶45和 ⑶106細胞表面抗原。在某些實施方案中，經過優化和擴增的細胞群同時表達⑶29和⑶44 與下列至少一種其它表面抗原⑶59、⑶90、⑶105和⑶66。因此，在某些實施方案中，本發 明優化的細胞群表達至少⑶29、⑶44和⑶59 ；表達⑶29、⑶44和⑶90 ；表達CD29、⑶44 和 CD105 或者表達 CD29、CD44 和 CD66。具有上述表型的用本文所述方法製備的細胞顯示出最佳的生長特徵用於植入有 需要的患者中。通過下面的詳細說明和所附權利要求，本發明的這些優點及其他各種特徵和優勢將變得清楚。附圖簡要說明

圖1A-E顯示本文所述的「生長通道」的各種圖解，其中包括細胞生長速率、細胞密 度、細胞形態和細胞培養模式。A 細胞生長速率以優化用於修復的擴增。倍增時間定義為 單層培養中細胞數目加倍的天數。這是一個關鍵指標，因為具有修復能力的細胞易於在培 養中指數生長。使倍增時間處在可接受生長通道內所需要的血小板裂解物百分比濃度也決 定需要進行體內細胞擴增與移植的血小板裂解物的量。細胞培養行為預期的生長通道以上(> 3天)增加血小板裂解物濃度直至生長速率在預期的 生長通道內；以更高密度接種直至生長速率在預期的生長通道內。預期的生長通道以下( 100的PSIS得率將核化細胞轉化為集落形成培養物， 並從集落形成培養物中得到約700，000個MSC(裂解物的濃度20%，培養7_10天後)。在 這個實施例中，生長通道顯示出倍增時間有些滯後導致產生上述細胞培養行為。細胞培養 行為如圖示預期生長通道以上增加血小板裂解物濃度直至生長速率在預期的生長通 道內；以更高密度接種直至生長速率在預期的生長通道內；如圖示預期生長通道以下減小血小板裂解物濃度直至生長速率在預期的生長通 道內；以更低密度接種直至生長速率在預期的生長通道內。C:細胞匯合的定義為，單層培養細胞之間自有空隙所佔的百分比。如圖所示，包裝 過於緊密的細胞將迅速進入分化狀態，而包裝過於疏鬆的細胞則不會達到目標生長速率。 細胞的空間分布可用下列方程進行定量分析表面積匯合)/細胞數目。這個值範圍 應該在18-23之間。細胞培養行為預期生長通道以下( 23)以更高密度接種直至匯合符合預期通道(從12X 103 個細胞/cm2到15X 103個細胞/cm2)；顯著高於預期生長通道(> 27)；增加血小板裂解物濃度。D:細胞分布的定義為，細胞在二維空間(單層培養)中存在隨機性。隨機分布的 細胞在該生長通道內，結塊的或不均勻分布的細胞不屬於該生長通道。細胞培養行為在預期的生長通道之外(不均勻分布)以更高的密度接種直至細胞均勻分布；相 對於預期較早地進行細胞傳代。E 與本發明相關的MSC形態學類型及非相關類型。可以利用各種環境刺激和條 件，將MSC培養為相對於其他表型而傾向於一種表型。此處顯示的為與本發明不相關的表 型。與本發明相關的表型為紡錘形。或如圖所示的I型。任何與這種形態特徵的偏差都需 要本文所述的細胞培養行為。I型根據本發明所述的生長通道要求生長的iMSC的I型MSC顯微圖像(10x)。II型II型MSC的顯微圖像(10x)，該圖像取自與環境接觸的人間質幹細胞 ^M^'iSi^lia-MM^i Denitsa Docheva*, Cvetan Popv, Wolf Mutschler, MatthiasSchieker J. Cell Mo1. Med. Vol 11，No 1，2007pp.21-38.III型III型MSC的顯微圖像(20x)，該圖像取自脂肪組織間質幹細胞與 骨髓間質幹細胞肝臟生成分化的比較，RaquelTalens-Visconti，Ana Bonora, Ramiro Jover, Vincente Mirabet, FranciscoCarbonell, Jose Vincente Castell, Maria Jose Gomez-Dechon World J. Gastroenterol 2006 年 9 月 28 日；12 (36) :5834-5845。IV型IV型MSC的顯微圖像(10x)，該圖像取自自體骨髓衍生培養的間質幹 細胞通過纖維素噴射器給藥後加速小鼠與人皮膚創面的癒合，V FALANGA, S IWAM0T0, M CHARTIER, T YUFIT, JBUTMARC, N K0UTTAB, D SHRAYER, P ；CARSON TISSUEENGINEERING Volume 13，Number 6，2007。細胞培養行為在預期通道之外(> 30% II型細胞)增加血小板裂解物濃度直至細胞形態為I 型，或者如果傳代次數> 5則移植；顯著超出預期通道(> 30% III型細胞或IV型細胞)；較預期時間早一些對細胞 進行傳代或移植；細胞可能不發揮理想的效果。圖2為細胞擴增圖，顯示當細胞在體外生長於5-10%血小板裂解物時，8位骨關節 炎患者細胞間生長速率與產率的差異。圖3A-E顯示5位患者分離的MSC群經過使用5_20%血小板裂解物的1_16天培養 後的條狀圖。圖4顯示用5-20%血小板裂解物培養時6位不同患者MSC擴增的條形圖，圖中顯 示患者細胞生長緩慢或生長迅速。圖5為針對5位不同患者的幹細胞生長通道疊加。圖6A和B為運用經過本發明實施方案優化的細胞進行MSC移植前後的「快速自旋 質子密度圖(fast spin proton density image) 」。圖7為顯示用10%或20%血小板裂解物的4位患者細胞首次傳代、第2次傳代或 第3次傳代的細胞生長的條形圖。圖8顯示在兩種不同骨髓抽取條件下一位3-4期非血管性壞死患者的細胞擴增。 條件1 兩種10cc骨髓抽取物產生4800萬核化細胞，這些細胞在10%血小板裂解物存在時 不發生擴增。培養物在2周後死掉。條件2:6小份取自兩側PSIS區域的l-2cc骨髓產生 1億6400萬核化細胞。顯示的是MSC在20%血小板裂解物中生長的擴增圖。圖9A和9B為運用經本發明實施方案優化的細胞進行MSC移植前後的「快速自旋 質子密度MRI圖像」。顯示中前膝蓋彎月面的部分再生。分離自非血管性患者臀部的MSC 的擴增。細胞移植前(左圖拍於2007年1月)和移植後3個月(右圖拍於2007年6月) 右膝蓋的連續匹配圖。圖10A與10B為運用經本發明實施方案優化的細胞進行MSC移植前後的透射圖。 顯示的是肱骨錯位骨折的部分恢復。圖11A和11B為用本發明實施方案擴增的MSC移植前後伴有膝關節中部彎月面重 度退化、隨後彎月面部分再生的骨關節炎患者的質子密度矢狀面圖。詳細說明本發明的實施方案提供用於在最佳生長條件下收集、擴增和移植自體間質幹細胞的方法和組合物。擴增條件基於患者特定MSC群的個性化生長特徵，無需合成的或重組的 生長因子。在典型的實施方案中，最佳生長條件至少部分由同一患者的血小板裂解物提供。 這些血小板裂解物組合物提供患者自身生長因子組合的持續而有效地釋放。注意本發明 的一些方面同樣適用除MSC外的其他細胞類型，例如，幹細胞、軟骨細胞等等，只是出於方 便，本文所述的實施方案僅局限於MSC。此外，優化生長的細胞可與自體分泌的因子一起進 行移植，增強細胞發揮更強療效的能力，例如，與血小板或血小板裂解物聯用，即從將接受 MSC的同一患者體內收集的血小板。最後，本文所述的本發明實施方案包括通過本文所述的 優化生長條件獲得的就均一表型被富集的MSC，經鑑定確定這樣的細胞可作為最佳細胞用 於基於再生性MSC的治療。定義提供下列定義將有助於理解本文常用的特定術語，但其並不為了限制本發明的範圍。「個性化生長特徵」指所收集細胞的個體特異性離體生長。例如，典型地收集自許 多骨關節炎患者個體的細胞表現出生長緩慢，需要變動生長特徵確保細胞具有最佳生長， 以便準備被移植入患者內。「間質幹細胞」或「MSC」指能夠分化為成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、脂肪細胞、神經 元細胞、胰島細胞等(見下文)的多能幹細胞。「天然擴增因子」指對於有需要的患者而言是天然的因子，如同暴露於從體外來源 製備的合成或重組擴增因子。天然表達因子典型地與血小板裂解物有關並從其釋放。「血小板裂解物」指包含於血小板中的天然生長因子的組合，通過裂解血小板而釋 放。這可通過化學方法獲得，即CaCl2、滲透作用(運用蒸餾水)、或通過冷凍/融化程序。 本發明的血小板裂解物也可來自全血，例如根據在《美國專利號5，198，357》中所述進行制 備，通過參照將其併入本文。「蛋白質」、「肽」及「多肽」可交換使用，表示胺基酸的聚合物或一組互相作用或鏈 接的兩個或更多個胺基酸的聚合體。「幹細胞」指任何具有非特化並能長期通過細胞分裂進行更新、亦能被誘導變成特 異性功能細胞的細胞。「細胞培養行為」指血小板裂解物濃度的改變、以不同的密度在培養物中再接種細 胞、或計劃傳代時間的改變(即，在更換培養基前保留在培養基中更長或更短的時間)。「傳代」指在單層細胞培養中更換用過的培養基或者以其他方式改變培養基以改 善細胞培養微環境。MSC與血小板裂解物的來源間質幹細胞為位於骨髓、外周血、脂肪組織及其他類似來源組織的多能幹細胞。 MSC具有分化為許多細胞類型的能力，其中包括成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、脂肪細胞及 3胰島細胞。本發明的MSC來源典型地收穫自需要恢復/置換治療的患者(或合適供體)的髂 嵴，本文提及的這種患者指「有需要的患者」(注意其他來源如脂肪組織、滑液組織及結締組 織最近已通過鑑定，並被認為可作為本發明範疇內的MSC來源)。在一個實施方案中，收集 了大約10-20CC骨髓，並運用Centeno的《美國專利申請號60/761，441》中所述方法或者通過Caplan等的《美國專利號5，486，359》中所述的塑料粘附法對其進行分離。這些參考文 獻的每一篇均以完整形式一併歸入本文。本發明還對標準骨髓抽取程序做了改動，以便使用本文所述的血小板裂解物技術 獲得適當的核化細胞產量。由於已經公開的大多數研究都是在健康人或動物中進行，這項 技術針對患有不同疾病患者的應用尚未進行過研究。圖8顯示了一個實施方案，其中來自 一位AVN(需要AVN部位的骨骼修復)的骨髓抽取物通過上述兩側10cc抽取技術導致在血 小板裂解物中擴增失敗。但是，運用每側抽取3小份2-3cc骨髓(總共6份)的改良技術 得到了所需要的核化細胞產量，這些細胞在20%血小板裂解物中進行了成功的擴增。本文使用的血小板裂解物由利用Doucet法獲得的骨髓收集物製備，這一方法通 過參照整體併入本文。典型的裂解物包括從數千萬到數千億個血小板。正如Martineau等 (Biomaterials,2004 25 (18)p4489_503)(通過參照整體併入本文)的研究所顯示的那 樣，血小板裂解物本身包括促進MSC同步生長所需的生長因子。在典型的實施方案中，血小 板裂解物與MSC屬於自體物質，且數量上亦屬有效量，故能刺激MSC的同步擴增(見下文詳 述)。由其應當注意的是，儘管諸如TGF-0等生長因子的水平在血小板裂解物中遠遠低於 常用於MSC擴增的水平，但認為，當包含於血小板裂解物的所有低水平生長因子一起使用 時存在明顯的協同效應。生長通道要求如本發明的發明人所揭示，本發明收集的MSC在離體不晚於第10次傳代，優選離 體不晚於第5次傳代(一次傳代相當於細胞的收集與接種平鋪，使細胞數目增加，用於培 養基和/或組織培養物定居/作為底物)後植入患者體內時可提供最佳恢復/再生性治 療。正因為如此，每位患者的MSC必須在有限的傳代次數中擴增至治療所必需數量，而無需 加入FDA未批准的藥物或生長因子。本發明的實施方式提供運用血小板裂解物確保收集的 MSC擴增至所需數量的生長通道條件，因此擴增的MSC被優化用於移植並用於目標患者。確定一位患者MSC生長潛能(確保所需數量的細胞)存在不同的要求，也就是說， 需要個性化的生長特徵(見上述定義)。這些要求包括MSC來源，即年齡、性別、遺傳限制及 退行性疾病如骨關節炎等的存在。就從骨關節炎患者收集的MSC而言，發明人已經鑑定了兩種不同的細胞生長類 型「緩慢生長」與「快速生長」。患者中存在緩慢生長細胞提出了一個實際的問題，即迅速 擴增細胞並在這組細胞內保持最大分化潛能的能力。不具備最大分化潛能的細胞很可能在 移植過程中停止分化。Crisostomo等，Shock, 2006 26(6) :p 575-80。因此，需要更高水 平的患者血小板裂解物去刺激所需要的MSC生長。所以，這些細胞的處理與分離自一個年 輕而健康個體的MSC必須完全不同。注意，表現出有限離體擴增潛能的細胞，即經過整個傳 代過程(<3天)細胞數目增加不到100%，被認為對於本發明的應用目的來說屬於緩慢生 長。在本發明的一個實施方式中，最佳MSC離體培養擴增需要的血小板裂解物的量通 過監測不同生長條件下生長的收集細胞來確定。當細胞涉及骨關節炎、骨質疏鬆、AVN或骨 骼、軟骨或結締組織疾病患者時，這就顯得尤為重要。MSC擴增依賴於許多變量患者血小 板裂解物中生長因子的量(因而改變裂解物的百分比濃度可滿足最大生長速率需要)、生 長因子的生物利用率(即這些因子對患者細胞的效應)、生長因子的相對濃度及患者初始源細胞的質量/數量。在本發明的一個實施方案中，為了在這些變量下優化MSC生長，本文 提出了「生長通道」的概念，其含義即是，相對於一個預定的時間段和/或細胞傳代次數(對 於最佳生長條件來說不超過10次)患者細胞的目標擴增速率。這種生長通道考慮了所有 產生一個特異的均一的細胞群落所需要的必需細胞培養條件。在本發明的一個實施方式中，目標MSC離體培養擴增需要的血小板裂解物的量與 可見參數相結合，從而確定最佳生長條件。特別是，這一實施方式要求上述血小板裂解物條 件應當與收集的MSC集落形成及MSC單層培養擴增要求相結合。一方面，在集落形成過程 中必須防止MSC過度生長，也就是說，必須防止出現封閉集落的集落邊緣細胞。另一方面， 在集落形成過程中必須防止MSC生長不足，也就是說，細胞不增殖。如果MSC在集落形成過 程中過度生長，必須從集落形成培養物中將其去除並置於單層培養中，如果MSC在集落形 成過程中生長不足，就應當去除部分培養基(大約一半)並加入新鮮培養基(加入之前使 用的血小板裂解物濃度)。另一方面，對單層擴增中的細胞必須進行觀察，看其是否出現過 度生長，即高密度和高接種密度如10，000-12, 000個細胞/cm2，或是否出現生長不足，即細 胞形態為圓形、旗形或細胞膨脹等。當細胞出現這種形態時血小板裂解物濃度應當增加至 至少 10-15%。更詳細地說，本文所提及的細胞生長最大擴增速率與最大修復能力的「生長通道」 包含以下四個不同的方面1.單層培養中的細胞生長速率；2.單層培養中的細胞密度；3.單層培養中的細胞培養模式；和4.單層培養中的細胞形態。這些概念在圖1的圖表中亦有解釋。「單層培養中的細胞生長速率」-由於血小板裂解物含有因患者不同而水平各異的 生長因子，因而直到能確定生長因子對培養擴增速率的影響作用時才有方法確定其生物活 性。因此，在「生長通道」內擴增的一個關鍵因素就是最小生長速率。將其定義為，調整血 小板裂解物濃度參數和/或接種密度直至倍增時間為1-3天。這將使細胞在進行第5至第 7次傳代前數量增加大約50-100倍(見圖1圖表1)。也正如圖1 (圖表2)所示，這是生長 通道起始於兩側10cc骨髓抽取物(僅用於圖解所述目的)的一個例子。從上述生長通道 的偏離將需要實施圖1圖表1所描述及相關說明中的細胞培養行為。「單層培養中的細胞密度」-細胞密度可影響細胞生長與分化能力。Doucet (上文 引用)描述了一個大約每毫升幾千個細胞的低接種密度(在其它健康的對照中)。但是，我 們已經發現，患有諸如骨關節炎、AVN及錯位骨折的患者需要更高的接種密度，而且在傳代 中保持高接種密度對產生具有修復能力的擴增細胞十分重要。因而，圖1圖表3就顯示了 本發明一個實施方案的可接受的細胞匯合通道(優化細胞的體內修復能力)。本發明所述 的MSC空間分布可通過下列方程進行定量分析表面積匯合)/細胞數目。該圖的範 圍應當為18-23。如果該值 27，那麼就應當增加血小板裂解物濃度。單層培養中的細胞培養模式-本發明中細胞生長模式十分重要，因為細胞之間均勻分布的距離就有利於促進連續擴增並使細胞保持未分化狀態。為了保證這一點，均勻分 布的MSC是本文所述生長通道的部分。在圖1圖表4中有進一步說明。任何從上述細胞培 養模式的偏離將會要圖1圖表4及其他相關說明中所述的細胞培養行為進行矯正。單層培養中的細胞形態單層培養中的細胞形態對於本發明涉及的特異MSC表型 十分重要。由於它只適用於間質幹細胞，最佳形態為單層培養中呈紡錘形(成纖維細胞)。 應當注意的是，其它間質幹細胞系常常表現出多角或旗形形態，這一形態不屬於所述生長 通道的表型。注意已經針對本發明的目的建立了一個分類系統，其中包括1-4型，與本發 明有關的最佳細胞類型為I型。關於這點在圖1圖表5中有更詳細的說明。需要注意的一 點是，2-4級顯示在圖1的圖表5中，選自以前的文獻，引文的每位作者都認為這些是他們的 MSC所能接受的形態。另外，處於所述生長通道內的優選形態為紡錘形，其細胞表面積小，不 像2-4型中的MSC，其表面積比最佳1型的大50%。一旦培養物有> 30%的2_4型MSC，就 應當將血小板裂解物濃度從10%增至15-20%。細胞群落應當在這個點上進行移植，以避 免發生從理想形態的潛在偏離。從上述細胞形態通道的任何偏離將需要圖1圖表5及相關說明中所述的細胞培養 行為進行矯正。在一個實施方案中，生長通道表示自體MSC在離體培養物中的生長特徵，這一特 徵可保證獲得1000萬到1億個細胞植入靶位點，例如膝關節。擴增細胞的數目一定程度上 取決於需要再生的靶位點，例如椎間盤的再生需要大約每毫升100萬到1000萬個細胞，而 膝關節表面需要的細胞數目則為每毫升數千萬個到數億個細胞。對收集的細胞進行監測， 一般通過運用不同濃度的血小板裂解物來調整其生長。本發明離體擴增的MSC生長可通過細胞計數和/或可見細胞參數進行監測。細胞 計數技術建立的基礎在於，當細胞數量超過那些細胞的容納的空間/密度時，從組織培養 容器或培養基中收集細胞並進行傳代。細胞計數技術必須由一名熟練技工現場進行，這名 技工可收集細胞並從計數小室裝置如血球計數器或光譜圖計數器中獲取細胞數目。正如 本發明其他地方所述，細胞計數亦可通過網際網路向經驗豐富技工遠距離傳遞數字圖像而進 行。如上文所述，本文公開的可見細胞培養參數包括觀察本發明細胞形態，確定收集 細胞和傳代的難易度。可見參數包括細胞培養形態、細胞培養模式和細胞培養密度。特別 是，下列特定的定量參數可被考察集落形成過度生長、集落形成生長不足、單層擴增培養 物過度生長、單層擴增培養生長不足、血球計數器中血小板圖像和幹細胞數目、抽取骨髓後 首次接種的粘附細胞數、確定收集時間的集落形成到產生集落(包括生長過度與生長不 足)、細胞接到培養瓶後分布的均勻度(即在單層擴增期間細胞應均勻分布於培養瓶中)、 接種密度、確定何時該進行細胞傳代的匯合時期和可見細胞分裂、細胞形成集落時培養瓶 表現出的血液類似性、通過旋轉離心獲得血小板後血液組織的分離特性、離心後從紅細胞 分離有核細胞後骨髓分離物的形態(即膨脹的亮球狀、分散排列)。目標培養物的可見觀察可由組織培養熟練技工現場進行，亦可通過數字顯微攝像 技術遠距離進行(現場錄像)，或者通過本文所述的生長通道運行期間用數字顯微攝像機 拍攝的更新圖像進行。當需要更多地有限控制多細胞培養部位時可進行遠距離細胞培養的 監測。例如，從大量遠距離培養物中由一位訓練有素的專家提供可見數據。專家將獲得某種可見參數是否有效的信息，例如，特定細胞密度、培養模式或細胞形態，這些信息對膝關 節再生、穩定非血管性壞死、癒合錯位骨折等等提供了良好的臨床效果。然後專家會知道如 何將培養形態與所有此類培養物聯繫起來(可是即使大量的現場工作人員花費數月乃至 數年時間也做不了這種關聯性分析)。在一個實施方案中，具有均一的、非過度生長等細胞 培養形態的細胞將被認為是最佳狀態細胞，處於生長通道內，因而易被收集與傳代。本發明的血小板裂解組合物包括大量已知細胞分裂必要的生長因子，其中包括 hFGF、PDGF-BB、TGF-0和VEGF。將血小板裂解組合物加入無血清生長培養基使得培養基中 含有目標數量的裂解物，例如，10%血小板裂解物包含10%體積的血小板組合物。在優選實 施方案中無血清基礎培養基為DMEM、Hams F12、MEM或其他類似培養基。生長因子的有效量 與患者血小板裂解物有關，並將隨著患者不同而變化。在典型的實施方案中，患者細胞最初培養在含10%血小板裂解物的培養基中孵育 7-10天，形成集落，然後重新計數(集落形成)。如果患者有骨關節炎，將細胞轉至單層培 養中用初始弄度為10%的血小板裂解物培養。細胞生長2-4天，將其與特定患者治療程序 所需要的細胞總數作比較。在某些實施方案中，細胞可進行可見參數考察。上述不在生長 通道內的細胞將改變其培養基，增加血小板裂解物濃度(例如15-20% )，而處於生長通道 內的細胞將被繼續培養至少2-4天，然後再重複以上步驟。依賴於生長通道條件的其他細 胞培養行為包括以更低或更高密度再次接種、更頻繁或更少更換培養基或者更遲或更早移 植細胞。注意可見參數亦可被用於確定細胞是否處於生長通道內(見上文)。注意MSC擴增速率的可變性取決於患者收集的MSC和患者血小板內生長因子的 水平。因此，在某些情況下，需要更高水平的血小板裂解物來維持MSC處於生長通道內，這 不僅因為細胞生長特徵，而且因為需要更多的血小板裂解物提供所需水平的生長因子，也 就是說，與其他血小板裂解物相比，患者的血小板裂解物可具有低濃度生長因子，亦可含有 低濃度生長因子。令人驚奇的是，本發明發明人已經確定，與同樣數量在非最佳條件(非生 長通道)(例如需要15次傳代的細胞培養物具有足夠的數量實施需要的治療效果)得到生 長的細胞相比，在最佳生長條件下生長的細胞可獲得更佳的療效。例如，發明人發現，與運 用本文所述生長通道方法在最佳條件下生長的細胞相比，運用10cc兩側PSIS骨髓抽取物 (總共20cc骨髓)在非最佳擴增條件下生長的細胞產生的臨床療效更差(MRI未見或極少 見明顯的軟骨再生，未見或極少見彎月面再生)。自體MSC置換的方法本文所述實施方案包括有需要的患者部位進行恢復性治療的方法。例如，需要治 療的退化性椎間盤或關節軟骨的治療恢復其他實施方案包括MSC擴增的應用心肌再生、 皮膚創面癒合、骨折或骨錯位癒合、神經修復、宿主移植治療及其他免疫應用和其他應用， 置換胰島細胞、治療骨質疏鬆、治療聽力喪失及其他用途。本文所述的方法利用自體MSC進 行恢復性治療，其中MSC用天然(非合成/非重組)生長因子(典型地通過在不同濃度血 小板裂解物下培養而獲得)處理。最初，MSC來源從一位需要幹細胞治療恢復患者體內收集而獲得。獲得的MSC源 保持在無菌環境中，並在無菌條件下進行整個操作過程。如上文所述，收集的細胞接種並在 維持細胞在生長通道內的條件下離體培養這是本發明的實施方案(MSC分離自上述MSC來 源)。這就要求血小板裂解物應由患者按上述實施例1方法製備而獲得。對在最佳擴增條件下生長的自體MSC進行監測，準備在細胞進行第10次傳代前實施移植術。細胞目標產量 為1千萬-1億個細胞(靶位點的細胞總數可被鑑定，見上文)。在某些實施方案中，自體 MSC在進行第5次傳代前開始培養並檢測其是否適合移植，其細胞目標產量為1-4千萬個細 胞。在其他實施方案中，自體MSC在進行第6、7、8或9次傳代前開始培養並檢測其是否適 合移植，其細胞目標產量為1-4千萬個細胞。隨後將製備的MSC組合物植入靶位點，並監測 在接下來的幾個月中細胞的治療效果。這一過程是否需要重複取決於想要的療效。已經在 導致在4-7次傳代中產生1-4千萬個細胞的條件下經過處理的細胞為最適於移植的細胞， 可移植於需要移植患者的靶位點。尤其是，在某些實施方案中，本發明還包括用在最初集落形成和附著培養中分離 的骨髓有核細胞接種紅細胞的方法。由於紅細胞同樣含有生長因子，這將進一步豐富細胞 生長的環境，並對分離的MSC具有其他分化效應。注意此法的實施方案用自體細胞和生長因子進行，故避免了許多在其他非自 體MSC置換治療中出現的免疫感染問題。由於最近研究證明，非自體MSC活化宿主的自 然殺傷細胞系統，故本發明在這點上具有顯著的優勢。Spaggiari等，Blood，2006107 (4) 1484-90 ;Rasmusson 等，Transpantation，2003 76(8) :1208_13。這些實施方案還對移植 細胞在靶位點的擴增及分化為所需細胞(關節表面的軟骨細胞、骨缺損中的成骨細胞等) 的潛能進行了優化。如下一個實施方案所述，血小板組合物(或者血小板本身)可通過注 射植入靶位點，同時或隨後進入MSC移植程序。運用本文所述的細胞生長實施方案，製備可用於目標患者的最佳生長細胞。根據 本文所述的方法生長的細胞用FACS進行分析，確定細胞表型，即，確定細胞表面抗原。本發 明的一方面，篩選細胞群落並擴增，使其至少表達下列一種或更多種表面抗原CD29、CD44、 ⑶59、⑶73，、⑶90、⑶105和⑶166。注意上述陽性結果為至少有90%待測細胞通過鑑定 表達特定細胞表面抗原FACS分析表現為陽性。在典型的實施方案中，相似細胞群落對至少兩種下列細胞表面抗原為陽性CD29、 ⑶44、⑶59、⑶73、⑶90、⑶105和⑶166。在更多的典型實施方案中，細胞群落對至少三種 下列表面抗原為陽性⑶29、⑶44、⑶59、⑶73、⑶90、⑶105和⑶166。在甚至更多的實施 方案中，細胞群落對至少四種下列表面抗原為陽性⑶29、⑶44、⑶59、⑶73、⑶90、⑶105和 ⑶166。在甚至更多的實施方案中，細胞群落對至少五種下列表面抗原為陽性⑶29、⑶44、 ⑶59、⑶73、⑶90、⑶105和⑶166。最後，在某些實施方案中本文所述的細胞群落對⑶29、 ⑶44、⑶59、⑶73、⑶90、和⑶105中的六種或七種細胞表面抗原為陽性。本文的實施方案 顯示，具有潛在表達這些細胞表面抗原能力的細胞最適合用於治療。此外，本文的實施方案 顯示，細胞群落含有上述細胞表面抗原，但卻缺乏下列至少一種抗原⑶14、⑶31、⑶45和 CD106。在其他實施方案中細胞群落具有上述表面抗原但缺乏下列至少兩種或更多種抗原 ⑶14、⑶31、CD45和CD106。在其他實施方案中細胞群落為陽性，表達CD29、⑶44、⑶59、 CD73、CD90、CD105 和 CD166 等表面抗原，但不表達 CD14、CD31、CD45 和 CD106。直接向靶位點注射血小板在本發明的某些實施方案中，血小板組合物被直接注射進入患者靶位點。血小板 注射可在MSC置換術、聯用MSC置換術(同時)之前或有助於優化MSC生長環境的MSC置 換後進行。在典型的實施方案中，用本發明的血小板裂解物培養基和生長通道條件擴增的MSC被收集(當時仍處於生長生長通道內)，並與自體血小板或血小板裂解物一起被注射入 靶位點。為了確定需要直接向靶位點注射的血小板的數目，可進行下列運算。首先需要確 定維持最大離體MSC生長速率所需要的平均血小板數/cc。例如，如果患者細胞顯示需要 10%血小板裂解物培養3天，20%裂解物培養3天和30%裂解物培養3天，運用最高的血小 板裂解物濃度確定靶位點需要補充血小板的數目。每天每cc血小板的最大利用率在該實 施例中為30% (三天)。如果每cc血小板的起始體積為1.0X109，那麼需要的條件為，在 這個時間段3天內每cc體積消耗3X 108個血小板，或每天每cc消耗1 X 108個血小板。Marineau 等，Biomaterials，200425(l8) :p 4489_502 (併入本文參考文獻)提供 通過血小板生長因子釋放促進體內MSC生長所需要的凝血酶與鈣水平檢測方法。這是促進 組織生長和血管生成的第一周自然發生的事件。從這些研究可以推測，血小板一經凝血酶 和鈣經7天培養活化就會釋放大多數生長因子。因此，每天每cc 1X108個血小板被擴增7 倍，每cc最終需要量為7X 108個血小板。患者的最終注射體積被加入初始關節滑液容積 (IFJV)，獲得最終關節滑液容積(FFJV)。因此，運用上述運算，每cc 7X108個血小板被擴 增12.5倍，產生8.75乂109個血小板。這個數目表示最終血小板劑量(見公式1)(維持MSC生長的每cc消耗的平均血小板數/培養基更換之前維持這個水平的天 數)X (培養基更換之前需要維持這個水平的天數(7)(最終關節滑液容積))=PHC血小 板劑量。(公式⑴)。或者，這種補充可用血小板裂解物等同物進行，直至促進擴增、調整關節容積和更 頻繁補充所需的最高離體血小板裂解物百分比濃度。MSC移植的位點監測本文所述的移植細胞可被監測，以保證這些細胞在體內存活，並最終使這些細胞 分化為需要的細胞類型，獲得所需的修復。在一個實施方案中，進行MRI標記實現患者靶位 點的無創監測(但是，注意這一程序需要磁性粒子，且只提供細胞定位、細胞擴增或分化狀 態等信息)。因此優選實施實時細胞檢測。移植了優化擴增的細胞後，從植入位點進行經皮液 體洗滌。獲得自由漂浮細胞和最小粘附MSC後進行MSC(如果有)計數、細胞類型、分化狀 態及形態等分析，以及MSC增殖狀態的分析。關節洗滌亦可進行監測或分析關鍵物質如粘 多糖表達、主要蛋白、基因表達或其它表明關節微環境改善的重要化學物質或遺傳標記。可進行兩種類型的實時監測靶位點滑液隨機取樣和/或位點滑液的高壓「敲 除」。運用針或導管(典型相當於14-22注射器(gauge))進行高壓敲除，其中高壓液體從 敲除最少的粘附MSC處流下。或者，亦可用針形關節鏡或者傳統關節鏡獲得組織樣品進行分析。在MSC被移植之前(形成一個與後續樣品作比較的樣品)於基底處進行經皮取 樣。取樣亦可在MSC植入靶位點後1周、可能2周及可能3周進行。特別是，移植後一周時，進行關節洗滌或者組織取樣，進行觀察分析。儘管可以認 為，細胞群落可離體很容易檢查，並無需體內取樣即可被調整為生長培養基，但是在體內卻 無法進行同樣的必需調整保證體內生長和移植。然而，在實時監測的基礎上，靶位點群落和 /或血小板裂解物濃度補充的改變卻能實施。這個程序是否需要重複因需要而定。此外，可向靶位點植入額外的自體培養MSC。最後，一旦確定移植MSC存活且能增殖或者關節微環境適於細胞存活和移植，即 可給靶位點加入分化促進劑。此外，經實時監測獲得的細胞可在不同分化促進劑存在條件 下培養，以確定哪一種最適合獲得要求療效。代表性的促進劑包括成骨蛋白2、地塞米松、透 明質酸及類似物。此外，炎症細胞在實時監測中恢復時，可在處理中加入抗炎藥物，在發生 脫水部位加入透明質酸。此外，運用試驗方法可監測細胞移植後體內狀況，看是否發生繼發性組織再生效 應如產生粘多糖(GAG)、已知退化性酶及其他因子水平降低。本發明這一部分的重點在於移 植後對細胞的直接或間接監測。而且，這使我們能獲得移植後的實時變化信息，確保細胞存 活及移植成功和分化功能正常。作為一個代表性的例子，MSC—旦分化為早期軟骨細胞即 可進行GAG產生監測，保證其功能完全，使其分化為成熟的健康的軟骨細胞生物等效物。此 外，某些促進分化的或補充的物質可能監測的被導入關節，以便增強被監測的GAG產生。同 樣的例子亦能適用於組織再生的其他區域，例如體內由MSC分化為胰島細胞過程中胰島細 胞的置換和胰島素合成的監測。治療應用本發明的方法和組合物可用於治療，也就是說，修復和維持需要MSC的患者的靶 組織。可用本文所述的實施方案治療的疾病包括骨關節炎、退行性椎間盤病，固定骨骼非血 管性壞死部位、癒合骨折或骨錯位、心肌再生、連接修復、皮膚創面癒合、神經修復、免疫抑 制或調節的細胞治療、0 -胰島細胞置換、聽力細胞與結構的置換、治療骨質疏鬆、和其他功 能紊亂症，在這些情況下MSC可分化為可修復並置換受損、缺失或退化的細胞。
實施例下列例子旨在解釋而非專門限制本發明的範圍。實施例1 與生長通道相關的患者MSC生長通道從患者後髖嵴處收集有核細胞，並用離心法從RBC中分離(血清呈濃度梯度)。從靶患者處收集大約10ml骨髓，再轉至細胞培養實驗室的15ml離心管中。骨髓 樣品以100g離心2-3分鐘。檢查RBC沉澱，確保這批RBC中半數樣品生長緩慢，且清晰區 位於RBC沉澱與頂部級分區之間。注意，如果頂部級分不到總體積的40-50%，需要重複離 心操作。又然後去掉頂部級分區置於15ml離心管中，以1000g離心10分鐘。注意，有核細 胞沉澱可能呈現紅色，也許是包裝鬆散所致，這取決於所存在RBC的數目。去掉血清上清， 重新加入RBC沉澱中。用lml鹽溶液重懸有核細胞沉澱。重複上述步驟直至獲得另外的有 核細胞。按1 20用水稀釋細胞懸液後(裂解RBC)進行有核細胞的計數。用1 2000 稀釋液對RBC進行計數。然後接種有核細胞進行單層培養。每cm2接種約0. 66-1. 25X 106個有核細胞和 0. 16X109RBC(用來自RBC懸液的細胞將RBC補加到有核細胞懸液中)。將組合的細胞混合 液以1000g離心10分鐘，再用DMEM+Cipro+肝素+10%血小板裂解物(10%被選作初始劑 量，這是基於Doucet所述的5%裂解物可使細胞擴增處於明顯的次級優化狀態這一事實) 重懸。然後將細胞懸液於37°C保溫30分鐘。將保溫的細胞懸液平鋪於一個大小合適的組織培養瓶中，加入新鮮培養基。細胞培養物在5%二氧化碳、37°C孵育7-12天。如圖1所示，來自八位患者MSC的生長在上述條件下進行，並作細胞數目對天數的 生長功能曲線圖。一個可接受的生長通道已經與細胞數目擴增相重疊。在第7天，Gi細胞 數量充足，最適於移植，第8天時，St細胞充足，適於移植，第10天時，C1細胞充足，適於移 植。所有其他細胞均未在可接受的生長速率內，需要增加培養基中血小板裂解物的濃度，保 證最佳生長狀態。t施例2 患者MSC牛長依賴幹患者彳律康狀況從患有骨關節炎的個體收集MSC，按照實施例1所述使其生長。每位患者細胞的生 長速率和整體產率均得到測定。收集的MSC在不同含量血小板裂解物(5-10% )中生長，並對11天的過程作圖 (500%患者原血小板濃度，並通過冷凍法裂解)。圖2中的圖表數據顯示，MSC產率和生長 速率發生了顯著變化。本實施例說明不同患者間細胞生長存在差異，需要優化MSC生長速率。實施例3 在優化MSC牛長條件下，5%血小板裂解物無效。如實施例1所述，從骨關節炎患者收集的MSC(緩慢生長MSC)，用5 %血小板裂 解物、10%血小板裂解物或20%血小板裂解物進行MSC擴增。如圖3A-E所示，與生長在 10-20%裂解物中的細胞比較，許多用5%血小板裂解物生長的細胞系不能表現出最大擴增 速率。注意，對於大多數在20%裂解物下生長的細胞系與10%裂解物相比只表現出最小的 擴增優勢。然而，必須強調的是，我們的實驗數據顯示，OA患者的擴增速率變化極大，有幾 位患者能在5%裂解物條件下達到生長通道要求，大多數為10%，還有一些患者需要20% 裂解物。此外，患有其他疾病如非血管性股骨頭壞死的患者細胞在甚至10%裂解物存在時 都不擴增，需要作多重的變動，由實驗規程決定(看下文實施例)。圖4進一步說明，從骨關節炎患者收集的MSC通常需要高濃度血小板裂解物(10% +)才能獲得最佳擴增狀態。但是，健康個體的MSC具有正常的生長，在5%或10%血小板裂 解物下很少表現出變化。本實施例中的數據表明，Doucet等所述的條件在骨關節炎患者收集的細胞條件下 不產生最佳擴增狀態。需要更高濃度裂解物表現出最佳擴增狀態。然而，在細胞收集為快速生長型細胞條件下，細胞可在5或10%血小板裂解物條 件下生長。實施例4 5位患者的圖示生長通道5位患者捐獻MSC並按實施例1中收集方法收集。用不同的裂解物濃度使細胞生 長，並計算細胞數目。細胞生長數據如圖5所示，本發明的生長通道被重疊。在細胞生長通 道參數內能夠擴增的細胞被認為是最適於且已準備好用於臨床目標者，可是5位患者的細 胞生長產率很低，臨床治療成功率也最小。因此，基於調節細胞生長條件的血小板裂解物應 當用於在所述的生長通道內獲得細胞生長。此外，基於細胞密度的已經介紹的細胞培養決 定因素細胞培養模式和形態也需要得到應用。實施例5 細胞在生長通道參數內生長時MSC表達細胞表面抗原收集MSC並用本文實施方案所述和實施例1和實施例2中所述的方法擴增細胞， 為了確定培養細胞的表型，將其與螢光標記單克隆抗體(mAbs) —起孵育，該單抗為針對已知細胞表面抗原的單抗(表1和表2列出了所用的MAbs)。用FACSCalifur流式細胞儀對來自2位受試者培養細胞的細胞表面抗原表達水平 進行分析。結果見表1和表2。表1: 表2: 表1顯示每個靶細胞表面抗原的平均螢光強度(MFI)。表2列出了每個細胞表面 抗原的陽性百分率值。如表2所示，對於移植入目標患者而優化的細胞有大於99%的表達 CD29、CD44、CD59、CD73、CD90、CD105 和 CD166。相反地，很少有細胞表達 CD14、CD31、CD45 和CD106，而一般認為這些表面抗原不出現在具有最佳移植能力的細胞表面。實施例6 運用本文實施方案講行的MSC移棺提供體內軟骨細胞置換從一位57歲需要進行軟骨置換糾正膝關節缺損的患者獲得一份骨髓樣品。收集 骨髓，然後用實施例1所述的方法分離MSC。細胞生長在10-20%血小板裂解物上，經過6 次傳代獲得了 1000萬個細胞。將細胞維持在本發明的生長通道內。然後用自體MSC將細 胞植入靶位點。圖6(A與B)顯示矢狀面快速自旋質子密度3. 0T MRI圖像。圖A顯示一側股骨骨 節後方承重面的軟骨缺損。39天後重新拍攝圖像，發現軟骨缺損已經被填充(如圖6B所 示)。本實施例的數據顯示，運用本文所述的方法和組合物可有效糾正靶位點的軟骨缺損。實施例7更高水平血小板裂解物的時機可通過增加細胞生長動力使生長緩慢型MSC符合生長通道目標下列實施例說明，在離體擴增期間改變血小板裂解物濃度會極大改善MSC產率。 20%血小板裂解物濃度(「裂解物激發劑(boost)」)用於在細胞突出於集落形成結構表面 時細胞的初始擴增。對4位患者的細胞群落進行了測試，分別用符號Re、Gi、Ve和Ca。對 生長條件進行監測，結果如表3和圖7所示。在表3列出的4位患者中，注意對於Gi和Ve，其MSC在每一次傳代的生長期數目 成倍增加，生長狀況得到了明顯改善。對於受試者Gi，當運用20%的裂解物激發劑時，每次 傳代的細胞數增加倍數總和從9. 74增至12. 96。對於Re這個數值則從6. 88幾乎翻倍增至 10.34。需要注意的是，兩位患者均在用MSC進行靶位皮膚表觀和再生性治療(均被診斷患有骨關節炎(OA)，年齡分別為50多歲和60多歲)。對於年輕的受試者Ve (無已知的OA)， 每一次傳代的細胞增加倍數總數只是稍有改善(5. 0到5. 7)。在最年長的70多歲並有重度 多關節OA的受試者中，其測定值也只有中等程度的改善(5. 08到5. 13)。由於4位受試者中有兩位有明顯的產率改善，其他兩位產率未見降低，只是稍有 改善，提示本文所述方法和組合物可有效改善需要進行再生治療的OA患者試驗組的MSC產 率。t施例8 需要MSC移棺的患者的細胞』牛長條件從患有非血管性壞死的44歲白人女性患者提取10cc PSIS骨髓抽取物，將其細胞 按本發明的方法進行處理。她的有核細胞產率很低，用10%裂解物生長於單層培養中，但 是傳代兩次以上時就不再擴增了。重新召回該患者，對骨髓抽取技術做了改進，從其左右側 PSIS取3小份骨髓，然後當其還處在集落形成階段時用20%裂解物激發細胞，再放在20% 裂解物中生長。圖8顯示兩次細胞擴增圖，從中可看出，許多患有這種疾病的患者需要改進 骨髓抽取技術來改善有核細胞計數，還需要集落形成期間的裂解物激發劑和單層培養擴增 期加入更高濃度的血小板裂解物。實施例9 本發明細胞的盲接灃射伴有9個月之久的肱骨骨折的37歲白人女性患者曾用開放減壓與外部固定術和 骨刺激劑治療。這種骨折表現出明顯的錯位，如圖10a所示。從患者PSIS提取lOOcc骨髓 抽取物，其MSC分離後在10 %血小板裂解物中生藏。隨後，將這些細胞在螢光顯微鏡導弓I下 通過一根無菌套管針經皮植入骨折錯位部位。圖10b顯示注射細胞後5周錯位部位明顯愈 合。該實施例說明用本發明技術進行擴增的MSC在體內具有骨生成能力。實施例10 膝關節軟骨置換患有重度膝蓋中腔退行性疾病的43歲白人男性患者表現出中前彎月面明顯有退 行性病變。圖11A顯示3.0T質子密度矢狀面MRI圖像，其中明顯退化的中部彎月面幾乎從 前方全部缺損。圖11B為經皮植入MSC後3個月的圖片，該MSC按照本文所述的生長通道 方法獲得並進行了擴增。圖11B顯示彎月面的再生以及後續的3-D圖像容積分析結果，可 看出彎月面容積增加了 32.5%。注意，彎月面再生發生在彎月面內部，即眾所周知的「白」 或「非血管」區。因為進行了這一移植術，血管被引入了這一區域。這是該特異細胞系所具 有的性質，或極有可能是由於血小板裂解物注射在細胞移植後賦予關節的特性。例如，眾所 周知，血小板裂解物具有顯著的VEGF水平，可引起新血管生成。表3 每次傳代時細胞生長的增加倍數 儘管已參考許多實施方案對本發明進行了特別地描述，但本領域技術人員能夠理 解對於本文所公開的實施方案的形式和細節可以進行變化而不離開本發明的範圍和主旨， 並且本文所公開的各種實施方案並不為了作為對本發明權利要求的限制。本文含有許多對專利、專利申請和出版物的引用，通過參照將它們均併入本文。
權利要求
用MSC移植治療患者的方法，該方法包括從患者獲得MSC；從患者獲得血小板；從患者的血小板製備血小板裂解物，其中製備含有一定量患者的血小板裂解物的生長培養基；用所述生長培養基擴增MSC；以及在有此需要的部位，將擴增的自體MSC植入患者。
2.權利要求1的方法，其還包括在移植擴增的MSC後，對患者的靶部位進行體內監測。
3.權利要求1的方法，其還包括在移植擴增的自體MSC的過程中或之後，將血小板或血 小板裂解物直接注射到患者的靶修復位點，以進一步促進MSC擴增。
4.權利要求1的方法，其中所述含有血小板裂解物的培養基包含5體積％到30體積％ 的血小板裂解物。
5.權利要求1的方法，其中所述MSC被擴增以在離體第十次傳代之前具有最佳生長。
6.權利要求5的方法，其中所述MSC被擴增以在離體第七次傳代之前具有最佳生長。
7.權利要求1的方法，其中所述有此需要的部位為退化的椎間盤。
8.權利要求1的方法，其中所述有此需要的部位為心肌。
9.權利要求1的方法，其中所述有此需要的部位為天然神經元。
10.權利要求1的方法，其中所述有此需要的部位為退化的關節。
11.權利要求3的方法，其中通過最大化離體MSC擴增所需的裂解物濃度測定所注射血 小板或裂解物的濃度。
12.權利要求1的方法，其中所述患者是已經被診斷患有骨關節炎的患者。
13.用於離體擴增MSC的細胞培養基，其包含基礎培養基和大約5% 大約30 %的血小 板裂解物。
14.權利要求13的細胞培養基，其中所述血小板裂解物為大約10% 大約20%。
15.權利要求13的細胞培養基，其中所述血小板裂解物對於MSC是自體的。
16.權利要求13的細胞培養基，其中在MSC擴增期間中的某些時候，使用更高濃度的裂 解物以使產率最大化。
17.用於擴增細胞的生長通道，其中所述細胞可用於植入患者，所述生長通道包括某些 參數，用於保證患者的細胞在從患者取出後的十次傳代內可以被擴增並移植，其中一個參 數是用於擴增細胞的血小板裂解物的水平。
18.權利要求1的方法，其中非自體供體提供MSC和血小板裂解物用於擴增。
19.生長通道，其用於MSC擴增以優化擴增產率。
20.權利要求2的方法，其中從體內監測獲得的數據被用於調整體內補充，以優化位點 的修復。
21.分離的人MSC群，其包含已經就下列細胞表面抗原進行富集的細胞⑶29、⑶44和 CD59。
22.權利要求21的分離的人MSC群，其中所述細胞還包括⑶73。
23.權利要求21的分離的人MSC群，其中所述細胞還包括⑶73和⑶90。
24.權利要求21的分離的人MSC群，其中所述細胞還包括⑶73、⑶90和⑶105。
25.權利要求21的分離的人MSC群，其中所述細胞還包括⑶73、⑶90、⑶105和⑶166。
26.權利要求17的方法，其中所述參數為細胞培養接種密度、更換培養基前的細胞培 養時間、細胞形態和細胞生長模式。
27.權利要求1的方法，其中用於治療退化區的MSC的劑量為100萬到1億個細胞。
28.權利要求1的方法，其中所述骨髓抽取技術包括提取多份l-10ml抽取物，以激發 MSC產率。
29.權利要求1的方法，其中紅細胞用於初始集落形成培養，以改善本文所述的特異性 MSC表型的附著和集落形成。
30.權利要求2的方法，其中所述體內監測包括通過外科手術、關節鏡和/或經皮途徑 直接觀察正被處理的區域。
31.權利要求2的方法，其中所述體內監測包括取出粘附和非粘附細胞，用於離體觀察。
32.權利要求2的方法，其中所述體內監測包括次生化學物質或細胞產物如粘多糖、 酶、蛋白質、肽、多肽和脂類的檢驗。
全文摘要
本發明提供了用於優化擴增間質幹細胞以及將其植入有此需要的患者的組合物和方法。對於需要MSC的患者是自體的間質幹細胞(MSC)被收穫、擴增，其在新型生長參數內，並且在位於患者血小板上的自體生長因子的影響下。
文檔編號A61K45/00GK101878297SQ200880105820
公開日2010年11月3日 申請日期2008年6月25日 優先權日2007年7月5日
發明者C·J·岑特諾, C·克奧罕 申請人:再生科學有限責任公司