抗人骨髓間充質幹細胞單克隆抗體zub4及應用的製作方法
2023-06-10 15:08:31
專利名稱：抗人骨髓間充質幹細胞單克隆抗體zub4及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及抗人骨髓間充質幹細胞單克隆抗體ZUB4及應用。
背景技術：
間充質幹細胞(Mesenchymal Stem Cells，間充質幹細胞)是近年來成體幹細胞研究領域的一個熱點，其可以從骨髓、臍帶血、脂肪組織、滑膜、骨骼肌、肺、乳牙中分離獲得，具有分裂、增殖、分化成多種細胞的潛能，在一定的體內或體外誘導條件下可以分化為各個胚層的細胞，如脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、肌腱細胞、肌肉細胞、星形膠質細胞、神經元細胞、上皮細胞等；間充質幹細胞免疫原性弱，不表達MHC-II類分子和T細胞共刺激分子，並具有免疫調節活性，這使異基因間充質幹細胞的應用成為可能；通過基因修飾方法，可使間充質幹細胞定向地表達某些特異的分子而作為細胞介導的基因治療的理想載體。間充質幹細胞是組織工程和再生醫學的種子細胞，在臨床應用中有廣闊的前景。目前美國和歐洲多個研究中心已開展自體和異基因間充質幹細胞治療多種疾病的I、II期臨床試驗，主要應用於心肌梗死、成骨不全、大塊的骨缺損、軟骨缺損、肌腱損傷、韌帶損傷的修復和重建，並對異染性腦白質營養不良(Metachromatic Leukodystrophy，MLD)、赫爾利症候群(HurlerSyndrome，MPSIH)、重型再生障礙性貧血、移植物抗宿主病等疾病的治療有一定的臨床療效；國內亦著手開展間充質幹細胞治療重大疾病的I期臨床研究。
骨髓間充質幹細胞是由Friedenstein在20世紀60年代首次證實，是在骨髓中的一種非造血系統的幹細胞。骨髓間充質幹細胞在骨髓中以低密度存在，約104～105個單個核細胞中含有一個間充質幹細胞，但其在體外培養可以倍增50次而不改變其表型特徵和分化潛能。迄今為止間充質幹細胞沒有特異性的表面標記，其不表達CD34、CD45、CD14、血型糖蛋白A及T或B淋巴細胞的表面標誌，認為相對特異性表面抗原有SH2、SH3、SH4、STRO-1、CD166等。目前各個實驗室主要還是通過密度梯度離心聯合貼壁培養方法和免疫分選法陽性或陰性篩選獲得間充質幹細胞，培養傳代的間充質幹細胞是一群相對均一的細胞，但是不同的分離培養條件導致獲得的間充質幹細胞可能來源於不同的亞群，其生物學特性可能存在一定的差異。研究者正努力尋求間充質幹細胞的特異性標記，以進一步認識其生物學特性。
20世紀90年代起研究者通過雜交瘤技術，研製開發了多種人間充質幹細胞相關的單克隆抗體1991年Paul J.Simmons等以骨髓CD34+細胞免疫小鼠獲得了人骨髓基質細胞新的單克隆抗體STRO-1；1992年Haynesworth SE等研製了3個間充質幹細胞的單克隆抗體SH2、SH3、SH4，之後進一步研究證實SH2的抗原表位位於CD105上，SH3、SH4的抗原表位位於CD73上；1997年J.C.Joyner等研製的單克隆抗體HOP-26，針對間充質幹細胞成骨分化的前體細胞有特異性，研究證實其抗原表位為CD63上的肽段；1997年S.P.Eruder等將骨髓間充質幹細胞誘導分化的成骨細胞免疫小鼠獲得單克隆抗體SB-10，與間充質幹細胞成骨分化相關，SB-10的抗原表位位於CD166上；2005年Hyun-Jung Hoo等報導採用骨髓間充質幹細胞及細胞膜蛋白提取物免疫小鼠，獲得單克隆抗體YS08、YS14、YS18。間充質幹細胞及其相關細胞的單克隆抗體的研究豐富了對間充質幹細胞表面分子及其分化抗原的認識，但目前對間充質幹細胞表型仍缺乏全面的認識，尚未發現其單一的特異性標記，因此進一步認識間充質幹細胞的特異性標記及生物學特性，將推進間充質幹細胞的研究和應用。
發明內容
本發明的一個目的是提供抗人骨髓間充質幹細胞單克隆抗體，該單克隆抗體亞型為IgG1、κ型，命名ZUB4，能與人骨髓間充質幹細胞表面分子特異性結合，用ZUB4通過免疫印跡法檢測提取的人骨髓間充質幹細胞蛋白，可獲得單一的特異性陽性條帶。該單克隆抗體與人外周血淋巴細胞、人血液系統細胞株及其他組織細胞株、人間充質組織及非間充質組織、大鼠間充質幹細胞、其他動物骨髓細胞無交叉反應。
本發明的第二個目的是提供抗骨髓人間充質幹細胞單克隆抗體的製備方法，通過以下技術方案實現(1)免疫原的準備以多供體來源的傳代培養、低溫凍存復甦後培養的第三～第五代的人骨髓間充質幹細胞作為動物免疫的抗原。人骨髓間充質幹細胞採用Ficoll-paque密度梯度離心結合貼壁篩選法分離培養獲得，目前公認的人間充質幹細胞表面分子CD29、CD44、CD166、CD105(SH2)陽性標記出現單峰，造血細胞分化抗原CD14、CD34、CD45、HLA-DR表達陰性，是一高度均質細胞群；可以多次傳代，擴增至第8代細胞數可達(2～3)×1010左右；通過體外定向誘導可分化為間充質來源的的成骨細胞和脂肪細胞，也能分化為其他胚層來源的細胞(如神經元樣細胞)；所用的凍存方法在復甦後人骨髓間充質幹細胞存活率高，不影響細胞的生長特性、免疫表型、及增殖和多向分化潛能。
(2)動物免疫選取2～3份供體來源的混合的人骨髓間充質幹細胞，免疫BALB/c小鼠，以期產生針對間充質幹細胞共同識別位點的特異性單克隆抗體。每隻小鼠以1.0×106細胞腹腔注射，每周1次，共3次；第4周加強免疫一次，3天後待融合。
(3)雜交瘤細胞系的建立取免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)以PEG介導融合。融合後細胞經HAT培養基選擇性培養，以間接免疫螢光法篩選陽性克隆。用有限稀釋法對陽性孔的雜交瘤細胞進行克隆化培養，直到克隆化細胞抗體陽性率為100％。將雜交瘤細胞經體外連續傳代3個月以上和反覆凍存、復甦，直到細胞系能穩定分泌單克隆抗體。
(4)單克隆抗體的製備與純化將建系的雜交瘤細胞注射到經石蠟油預處理的小鼠腹腔，誘生腹水。誘生的腹水用鹽析法和離子交換法獲得純化的單克隆抗體。
本發明的第三目的是提供產生單克隆抗體的雜交瘤細胞，它是由免疫的BALB/c小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤SP2/0細胞經融合、篩選、克隆、傳代和反覆凍存、復甦後獲得的小鼠雜交瘤細胞系ZUB4，能穩定分泌單克隆抗體ZUB4，其在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC No.C200511，保藏日期為2005年8月30日。
本發明的第四個目的是建立應用該單克隆抗體，通過流式細胞術、免疫組化、免疫螢光染色、免疫印跡等技術檢測間充質幹細胞的方法。
以抗人骨髓間充質幹細胞單克隆抗體ZUB4為探針，通過流式細胞術可以檢測培養擴增的間充質幹細胞及骨髓細胞懸液中的間充質幹細胞，並進行定量分析。
用抗人骨髓間充質幹細胞單克隆抗體ZUB4，採用免疫組織化學染色法檢測培養擴增的間充質幹細胞、骨髓組織切片和其他組織切片中的間充質幹細胞相應抗原的表達，並對間充質幹細胞的分布進行定位分析。
用抗人骨髓間充質幹細胞單克隆抗體ZUB4，結合螢光二抗，用免疫螢光染色法標記培養擴增的間充質幹細胞、全骨髓細胞、其他細胞及組織冰凍切片的相應蛋白分子，對間充質幹細胞的相應蛋白分子的表達進行定位和定量分析，並可檢測間充質幹細胞在組織中的分布。
用抗人骨髓間充質幹細胞單克隆抗體ZUB4，採用免疫印跡法(Western-blot)檢測單克隆抗體ZUB4的相應抗原在培養擴增的間充質幹細胞及其他相關細胞中的表達。
本發明應用建立的人骨髓間充質幹細胞的培養、凍存體系，採用多供者來源骨髓間充質幹細胞為抗原免疫BALB/c小鼠，成功了製備一種新的抗人骨髓間充質幹細胞單克隆抗體，可用於間充質幹細胞的鑑定，為研究間充質幹細胞的特異性標記提供了有效的工具，同時也為進一步闡明間充質幹細胞的生物學特性提供了平臺，並可推廣應用於多種檢測技術以及臨床研究。
圖1為用密度梯度離心和貼壁培養法獲取的人骨髓間充質幹細胞。A為培養的原代人骨髓間充質幹細胞，B為凍存復甦後培養的人骨髓間充幹細胞。
圖2為培養擴增第一代和第四代人骨髓間充質幹細胞的生長曲線。
圖3低溫凍存前後第四代人骨髓間充質幹細胞的生長曲線。
圖4培養的第四代人骨髓間充質幹細胞分別用CD14-FITC、CD45-FITC、CD44-FITC、HLA-DR-FITC、CD34-PE、CD29-PE、CD166-PE、CD105-PE標記，圖為流式細胞術分析圖。
圖5人骨髓間充質幹細胞向成骨定向誘導分化。A為誘導分化的成骨細胞，B為誘導成骨分化後Von Kossa法染色。
圖6人骨髓間充質幹細胞向脂肪定向誘導分化。A為誘導分化的脂肪細胞，B為誘導脂肪分化後油紅O染色。
圖7人骨髓間充質幹細胞向神經元樣細胞定向誘導分化。A為誘導分化的神經元樣細胞，B、C、D、E分別為誘導神經分化後用免疫組織化學染色法檢測神經幹細胞標誌物Nestin、神經元標誌物NSE、神經元標誌物NF-M、星形膠質細胞標誌物GFAP的表達。
圖8以單克隆抗體ZUB4，通過間接免疫螢光染色法檢測人骨髓間充質幹細胞。
圖9用免疫組織化學染色法檢測抗人骨髓間充質幹細胞單克隆抗體ZUB4的相應抗原在骨髓組織中的表達。
圖10以單克隆抗體ZUB4，通過流式細胞術檢測人骨髓間充質幹細胞。A為陰性對照，B為以ZUB4為探針的流式細胞術分析結果。
圖11以單克隆抗體ZUB4，通過免疫組織化學染色法檢測人骨髓間充質幹細胞。A為人骨髓間充質幹細胞爬片，B為人骨髓間充質幹細胞團塊。
圖12以單克隆抗體ZUB4，通過免疫印跡法檢測人骨髓間充質幹細胞中相應抗原的表達。
具體實施例方式
實施例1人骨髓間充質幹細胞分離培養、鑑定、凍存及復甦(1)人骨髓間充質幹細胞分離培養無菌條件下採集六份健康供者的骨髓，肝素抗凝，用Ficoll-paque(比重1.077)密度梯度離心收集單個核細胞，以4×105個細胞/cm2密度接種，用含10％(V/V)胎牛血清的低糖DMEM(LG-DMED)培養液，置於37℃、體積分數為5％CO2培養箱培養。48h後更換培養液，棄去非貼壁細胞可見有梭形貼壁細胞，之後每3d換液1次，15～20d原代培養細胞貼壁融合達80％～90％，排列有明顯方向性，成漩渦狀、網狀、輻射狀，與成纖維細胞形態相似(參見圖1)，用0.25％胰蛋白酶-1mmol EDTA消化，按1∶3比例分瓶傳代培養，並標記為P1細胞。傳代培養過程中每3d換液一次，細胞達90％融合後消化傳代，並標記為P2，以此類推。
(2)人骨髓間充質幹細胞生長特性的鑑定取培養傳代的人骨髓間充質幹細胞第一、第四代細胞，按2×104個細胞/孔的密度接種於24孔培養板內，分別培養1、2、3、4、5、6、7、8天，進行細胞動力學分析。培養具有以下共性特徵細胞經傳代培養後，12h細胞完全貼壁，細胞形態重新變成梭形細胞，傳代培養潛伏期約為24～36h；傳代培養對數增殖期約為4～5d；對數增殖期結束後進入平臺期；第四代與第一代細胞的生長沒有顯著差異(參見圖2)。
(3)人骨髓間充質幹細胞表型的鑑定取培養傳代的第一、三、五代細胞，以CD14-FITC、CD45-FITC、CD44-FITC、HLA-DR-FITC、CD34-PE、CD29-PE、CD166-PE、CD105-PE單克隆抗體為探針，用流式細胞術分析間充質幹細胞表面分子的表達。結果顯示CD29、CD44、CD166、CD105(SH2)陽性標記出現單峰，造血細胞分化抗原CD14、CD34、CD45、HLA-DR表達陰性(參見圖4)。經傳代擴增後的各代間充質幹細胞表面標記表達無明顯差異(參見表1)，表明培養擴增的人骨髓來源的間充質幹細胞是一均質細胞群。
表1 成人骨髓間充質幹細胞免疫表型(％，x±s)(n＝6)
(4)人骨髓間充質幹細胞多分化潛能的鑑定培養傳代細胞的接近70％融合時，更換培養液，加入成骨誘導培養液(LG-DMEM，10％胎牛血清、10-8M地塞米松、10mM β-磷酸甘油、0.25mM抗壞血酸)、脂肪誘導培養液、神經分化預誘導液(LG-DMEM，20％胎牛血清、1mM硫代甘油)。
經成骨誘導培養3～4d，大約30％細胞形態發生變化，由原來的紡錘型變為立方型或多角型，7d後出現鈣化斑點，隨著誘導時間的延長，立方型或多角型細胞以及鈣化斑明顯增加，約14～21d細胞形成廣泛均一的礦化結節樣結構。培養21d後，Von Kossa法染色，可以見到染成棕黑色的細胞外基質鈣鹽沉積(參見圖5)，對照組無礦化結節形成能力。
經成脂肪誘導培養1周後，細胞形態開始變成圓形或多角性，細胞排列無序，可觀察到胞漿中出現高折光性的小脂滴，隨著誘導時間的延長逐漸聚集成大的脂滴。培養21d後，油紅O染色，脂滴為橙紅色，約80％以上間充質幹細胞均誘導為脂肪細胞(參見圖6)。
經神經分化預誘導24後細胞形態未見明顯變化，更換含5mM硫代甘油的無血清LG-DMEM，在誘導後3-5h中，大多數間充質幹細胞變為典型的神經元樣細胞，簡單的雙級細胞和複雜的多級細胞均有出現，多個神經元樣細胞突起可相互延伸並形成網狀(參見圖7)。免疫組化染色分析，神經元樣細胞的胞體及部分突起神經幹細胞標誌物Nestin、神經元標誌物NSE、神經元標誌物NF-M表達陽性、星形膠質細胞標誌物GFAP表達陰性(參見圖7)。
(5)人骨髓間充質幹細胞的凍存和復甦將培養的間充質幹細胞消化後，用凍存保護液(LG-DMEM、5％DMSO、30％胎牛血清)重懸細胞，細胞終濃度為1×106/ml，用程控凍存方法凍存，計算機設定降溫程序以-1℃/min速率從4℃降至0℃，平衡5min，以-1℃/min速率降至-30℃，然後以-5℃/min速率降至-80℃，快速移入-196℃液氮罐保存。從液氮中取出細胞放入40℃的恆溫水浴箱快速解凍，在1min內解凍完畢，細胞復甦後經臺盼藍染色細胞計數，臺盼藍拒染回收率87.67±2.52％，復甦細胞接種後12h細胞完全貼壁，細胞形態重新變成梭形細胞。細胞經過2-3d休眠期後開始迅速增殖，約7～10d細胞可達80％～90％融合，細胞排列成漩渦狀、網狀、輻射狀，與凍存前細胞形態基本一致(參見圖1)。比較凍存前後的第四代細胞，細胞的生長特性(用MTT法測細胞生長曲線，參見圖3)、免疫表型(參見表2)、及誘導分化潛能(成骨細胞、脂肪細胞、神經元樣細胞)均未發生變化。
表2 第四代人骨髓間充質幹細胞凍存前後細胞免疫表型(％，x±s)(n＝6)
實施例2抗人骨髓間充質幹細胞單克隆抗體ZUB4的製備和純化(1)動物免疫取雌性6～8周齡的BALB/c小鼠，首次免疫用2份供者來源混合的第三～五代間充質幹細胞懸於PBS，約1.0×106/只注入小鼠腹腔。第8d、15d繼續免疫，免疫方法同第一次。第20天，把經三次免疫後小鼠眼球採血，離心分離血清，血清與培養的人間充質幹細胞共同孵育以間接免疫螢光染色法檢測血清抗體效價，選擇效價高的小鼠準備融合。融合前3天加強免疫一次，細胞數為2.0×106/只。
(2)雜交瘤細胞系的製備完成免疫過程的小鼠準備取脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)融合，在融合前一天製備飼養細胞。融合時無菌下取小鼠脾細胞，與SP2/0細胞以101混合，以50％PEG介導融合，離心後重懸於HAT選擇性培養基中，接種於含有飼養細胞的96板中，置37℃、5％CO2培養箱培養，融合後第3d、5d、7d用HAT培養液半量換液，兩周後換用HT培養液。
觀察雜交瘤細胞的生長情況，等克隆長至孔底面積的1/3～1/2，取培養上清液與間充質幹細胞孵育，用Ig(G+M)-FITC螢光二抗以間接免疫螢光染色法進行抗體檢測，篩選陽性克隆。以有限稀釋法對陽性孔的雜交瘤細胞進行克隆化培養，直到克隆化細胞抗體陽性率為100％，此時可將陽性克隆細胞進一步擴大培養。將雜交瘤細胞經體外連續傳代3個月以上和反覆凍存、復甦，定期收集上清，用篩選抗體的方法測定上清中的抗體，直到細胞系能穩定分泌單克隆抗體。
(3)單克隆抗體的製備和純化選用成年BALB/c小鼠，腹腔注射0.5ml液體石蠟，1～2周後收集生長狀態良好的單克隆雜交瘤細胞，每隻小鼠腹腔注射0.5～1.0×105細胞懸液。接種細胞14天左右的小鼠腹部可見明顯膨大，以頸椎脫臼法處死後打開腹腔，取出腹水。離心後吸取上清，分裝，-20℃保存。取10ml腹水抗體，加入10ml生理鹽水稀釋，用鹽析法以50％的硫酸銨粗提免疫球蛋白，之後用DEAE-纖維素離子交換柱純化。
(4)抗人骨髓間充質幹細胞單克隆抗體ZUB4腹水效價及亞型鑑定取小鼠腹水抗體，倍比稀釋後與免疫的間充質幹細胞孵育後，用間接免疫螢光染色法檢測(方法同抗體篩選)，抗人骨髓間充質幹細胞單克隆抗體效價為1106。抗體亞型測定取雜交瘤細胞培養上清，採用金免疫層析法檢測，屬IgG1型(輕鏈為κ型)。
實施例3單克隆抗體ZUB4的特異性的鑑定(1)單克隆抗體ZUB4在人血液系統細胞、及人類細胞株中特異性的鑑定細胞材料培養的人骨髓間充質幹細胞、外周血細胞、Ficoll-paque(比重1.077)分離的人外周血單個核細胞、全骨髓細胞、Ficoll-paque(比重1.077)分離的骨髓單個核細胞、HL-60(急性原髓細胞性白血病細胞株)、NB4(急性早幼粒白血病細胞株)、K562(慢性粒細胞性白血病急變期細胞株)、U-937(組織細胞淋巴瘤向單核巨噬細胞分化細胞株)、HEL(急性紅白血病細胞株)、Jurkat(急性T淋巴細胞性白血病細胞株)、Raji(Burkitt淋巴瘤細胞株，B淋巴細胞)、KM3(多發性骨髓瘤細胞株)。採用活細胞間接免疫螢光染色法檢測間充質幹細胞膜抗原的表達，以人骨髓間充質幹細胞為陽性對照(參見圖8)，全骨髓細胞及骨髓單個核細胞中可見散在的陽性細胞，其餘細胞均為陰性。單克隆抗體ZUB4與骨髓間充質幹細胞的特異性結合可用於區分骨髓中的間充質幹細胞與造血細胞，用於骨髓間充質幹細胞的鑑定。
(2)單克隆抗體ZUB4在人間充質組織及非間充質組織中特異性的鑑定組織材料肌腱、韌帶、肌肉、血管壁、神經、膽囊、皮膚、肺、肝、小腸、脂肪、骨髓，以上組織標本均來自外科手術標本。採用免疫組織化學染色法檢測，以人骨髓間充質幹細胞細胞團塊的石蠟切片為陽性對照，骨髓組織中可見散在的陽性細胞(參見圖9)，其餘組織均為陰性。
(3)單克隆抗體ZUB4在大鼠、小鼠、犬、兔、雞骨髓細胞及大鼠間充質幹細胞中特異性的鑑定細胞材料大鼠、小鼠、犬、兔、雞全骨髓細胞及培養的大鼠間充質幹細胞。採用間接免疫螢光染色法檢測，以人骨髓間充質幹細胞為陽性對照，結果顯示大鼠、小鼠、犬、兔、雞全骨髓細胞及培養的大鼠間充質幹細胞均為陰性，由此說明單克隆抗體ZUB4對人間充質幹細胞有特異性。
實施例4單克隆抗體ZUB4在流式細胞術檢測間充質幹細胞中的應用取體外培養的人骨髓間充質幹細胞，以單克隆抗體ZUB4為探針，用間接流式細胞術分析間充質幹細胞表面分子的表達。結果顯示明顯的陽性單峰(參見圖10)，間充質幹細胞表面分子表達為88.07％，傳代培養的間充質幹細胞上ZUB4相應抗原表達無顯著性差異。上述結果顯示單克隆抗體ZUB4與間充質幹細胞表面分子有較高的特異性結合，可用於間充質幹細胞的檢測和鑑定，並可定量檢測間充質幹細胞的數量。以單克隆抗體ZUB4為探針用流式細胞術檢測骨髓細胞中間充質幹細胞的數量，可用於研究骨髓中新鮮間充質幹細胞的特性及臨床診斷。
實施例5單克隆抗體ZUB4在免疫組織化學染色法檢測間充質幹細胞中的應用將體外培養的人間充質幹細胞爬片固定，用單克隆抗體ZUB4通過免疫組織化學染色法檢測間充質幹細胞相應抗原的表達，結果顯示大於95％的細胞呈陽性(參見圖11)。同樣用ZUB4通過免疫組織化學染色法檢測間充質幹細胞團塊及骨髓組織的石蠟切片中相應抗原的表達，結果顯示細胞團塊中大於95％的細胞呈陽性、骨髓組織中有散在的陽性細胞(參見圖9)。單克隆抗體ZUB4用於免疫組織化學染色法檢測方法，可以作為一種間充質幹細胞的標記，對組織中間充質幹細胞進行定位及定量的分析。
實施例6單克隆抗體ZUB4在免疫螢光染色法檢測間充質幹細胞中的應用以單克隆抗體ZUB4為探針，結合FITC標記的螢光二抗，採用間接免疫螢光染色法檢測體外培養的間充質幹細胞，結果顯示95％～100％的間充質幹細胞呈陽性(參見圖8)。單克隆抗體ZUB4可有效的應用於免疫螢光染色法，通過螢光顯微鏡、雷射共聚焦顯微鏡等工具可以有效的觀察間充質幹細胞中的相應抗原的表達，進一步研究該抗原在間充質幹細胞中的生物學特性。此外還可以用單克隆抗體ZUB4通過間接免疫螢光染色法檢測骨髓細胞及其他組織中的間充質幹細胞。
實施例7用單克隆抗體ZUB4，通過免疫印跡法檢測相應抗原的表達提取體外培養的間充質幹細胞總蛋白，用單克隆抗體ZUB4通過常規蛋白免疫印跡法檢測相應抗原的表達，可見一特異性的陽性條帶(參見圖12)。通過免疫印跡的方法可以進一步研究單克隆抗體ZUB4的相應抗原在間充質幹細胞及相關細胞中的表達，及該抗原的生物學特性。
權利要求
1.抗人骨髓間充質幹細胞單克隆抗體ZUB4，該單克隆抗體亞型為IgG1、к型，能與人骨髓間充質幹細胞表面分子特異性結合，產生該單克隆抗體的雜交瘤細胞是由免疫的BALB/c小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤SP2/0細胞經融合、篩選、克隆、傳代和反覆凍存、復甦後獲得的小鼠雜交瘤細胞系ZUB4，能穩定分泌單克隆抗體ZUB4，其在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCCNo.C200511，保藏日期為2005年8月30日。
2.根據權利要求1所述的抗人骨髓間充質幹細胞單克隆抗體ZUB4的製備方法，其特徵是通過以下技術方案實現(1)免疫原的準備以多供體來源的傳代培養、低溫凍存復甦後培養的第三～第五代的人骨髓間充質幹細胞作為動物免疫的抗原。人骨髓間充質幹細胞採用Ficoll-paque密度梯度離心結合貼壁篩選法分離培養獲得，目前公認的人間充質幹細胞表面分子CD29、CD44、CD166、CD105陽性標記出現單峰，造血細胞分化抗原CD14、CD34、CD45、HLA-DR表達陰性，是一高度均質細胞群；可以多次傳代，擴增至第八代細胞數可達2～3×1010左右；通過體外定向誘導可分化為間充質來源的的成骨細胞和脂肪細胞，也能分化為其他胚層來源的細胞；所用的凍存方法在復甦後人骨髓間充質幹細胞存活率高，不影響細胞的生長特性、免疫表型、及增殖和多向分化潛能。(2)動物免疫選取2～3份供體來源的混合的人骨髓間充質幹細胞，免疫BALB/c小鼠，以期產生針對間充質幹細胞共同識別位點的特異性單克隆抗體。每隻小鼠以1.0×106細胞腹腔注射，每周1次，共3次；第4周加強免疫一次，3天後待融合。(3)雜交瘤細胞系的建立取免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞以PEG介導融合。融合後細胞經HAT培養基選擇性培養，以間接免疫螢光法篩選陽性克隆。用有限稀釋法對陽性孔的雜交瘤細胞進行克隆化培養，直到克隆化細胞抗體陽性率為100％。將雜交瘤細胞經體外連續傳代3個月以上和反覆凍存、復甦，直到細胞系能穩定分泌單克隆抗體。(4)單克隆抗體的製備與純化將建系的雜交瘤細胞注射到經石蠟油預處理的小鼠腹腔，誘生腹水。誘生的腹水用鹽析法和離子交換法獲得純化的單克隆抗體。
3.根據權利要求1或2所述的抗人骨髓間充質幹細胞單克隆抗體ZUB4，在檢測人間充質幹細胞中應用。
4.根據權利要求3所述的抗人骨髓間充質幹細胞單克隆抗體ZUB4的應用，其特徵是以該單克隆抗體為探針，通過流式細胞術檢測培養擴增的間充質幹細胞及骨髓細胞懸液中的間充質幹細胞，並進行定量分析。
5.根據權利要求3所述的抗人骨髓間充質幹細胞單克隆抗體ZUB4的應用，其特徵是採用免疫組織化學染色法檢測培養擴增的間充質幹細胞、骨髓組織切片和其他組織切片中的間充質幹細胞相應抗原的表達，並對間充質幹細胞的分布進行定位分析。
6.根據權利要求3所述的抗人骨髓間充質幹細胞單克隆抗體ZUB4的應用，其特徵是結合螢光二抗，用免疫螢光染色法標記培養擴增的間充質幹細胞、全骨髓細胞、其他細胞及組織冰凍切片的相應抗原，對間充質幹細胞的相應抗原的表達進行定位和定量分析，並可檢測間充質幹細胞在組織中的分布。
7.根據權利要求3所述的抗人骨髓間充質幹細胞單克隆抗體ZUB4的應用，其特徵是採用免疫印跡法檢測單克隆抗體ZUB4的相應抗原在培養擴增的間充質幹細胞及其他相關細胞中的表達。
全文摘要
本發明提供了一種抗人骨髓間充質幹細胞單克隆抗體ZUB4。以人骨髓間充質幹細胞為抗原，應用雜交瘤技術製備了抗人間充質幹細胞的單克隆抗體，並建立了以該單克隆抗體為探針通過流式細胞術、免疫組化、免疫螢光染色、免疫印跡檢測間充質幹細胞的方法。本發明為研究間充質幹細胞的特異性標記提供了有效的工具，同時也為進一步闡明間充質幹細胞的生物學特性提供了平臺，並可推廣應用於多種檢測技術以及臨床研究。
文檔編號G01N33/577GK1821273SQ20051006103
公開日2006年8月23日 申請日期2005年10月10日 優先權日2005年10月10日
發明者黃河, 沈建根, 來曉瑜, 羅依 申請人:浙江大學