Pon基因簇在製備用於治療動脈粥樣硬化的藥物中的用途的製作方法

2023-06-10 13:08:16

專利名稱：：Pon基因簇在製備用於治療動脈粥樣硬化的藥物中的用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及對氧磷酶基因簇在製備用於促進動脈粥樣硬化癍塊穩定性藥物中的用途。本發明還涉及PON基因簇轉基因小鼠模型的培育方法及PON基因簇在培育的PON基因簇陽性的動脈粥樣硬化轉基因小鼠模型中的用途。
背景技術：
：1.動脈粥樣硬化及其癍塊破裂心血管疾病是我國以及發達國家的最主要的致死和致病因素，而動脈粥樣硬化是導致心血管疾病的首要因素(Libby，2002)(Glass和Witztum，2001)。現在認為導致動脈粥樣硬化相關的缺血綜合症(特別是心肌梗死和中風)的主要原因是動脈粥樣硬化癍快的破裂和繼發血栓形成，而不是癍塊本身導致的血管腔狹窄(Lee和Libby，1997)。臨床治療動脈粥樣硬化及其併發症迫切需要有效的針對導致癍塊破裂的因素的治療手段。氧化性低密度脂蛋白(Oxidizedlowdensitylipoprotein,oxLDL)在引發癍塊形成和惡化的炎症中起著至關重要的作用(Libby，2002；Steinberg，1997)，它可以刺激內皮細胞等表達粘附分子、趨化因子及其他細胞因子，進而介導單核/巨噬細胞的粘附和招募致內皮下層，並分化為巨噬細胞(Lusis，2000)。招募來的巨噬細胞吞噬並進一步氧化LDL，過多地吞噬使其自身凋亡壞死，並轉化為泡沫細胞。轉化後的巨噬細胞不但形成早期的脂質條紋和壞死核心，而且因為可以分泌大量的炎症分子及基質金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)而成為活躍的炎症中心。活躍的炎症反應進一步推動癍塊的發展，並最終導致破裂，引起併發症(Galis,2004；Schwartz等人，2007)。2.對氧磷酶(PON)和oxLDL以及動脈粥樣硬化的關係2.1對氧磷酶(PON)家族介紹對氧磷酶(paraoxonases)家族又稱PON家族，是一類控制酯類水解的蛋白酶家族。截至目前，研究發現該家族有3個成員PONl，P0N2和P0N3(Primo-Parmo等人，1996)，而大多數研究主要集中在PONl和P0N2上。人類PONl基因含有9個外顯子和8個內含子，編碼355個胺基酸組成的蛋白質，相對分子量約為43kDa(Mackness等人，1998)。對於PONl蛋白結構的研究表明，它是由6片層beta-螺旋和唯一的活性位點及一個基於His-His結構的異化中心組成(Harel等人，2004)。人類PONl基因有3個半胱氨酸殘基，其中第42位和第352位形成分子內的二硫鍵，而第284位半胱氨酸處於游離的自由狀態，是優化對氧磷酶及芳基酯酶活性所必需的。PONl在肝臟內合成進而被分泌進入血液，並專一的結合於HDL上。PONl可以水解芳香族酯類底物，例如乙酸苯酯，硫代乙酸苯酯和2-乙酸萘酯。除此之外，一些芳香內酯和脂肪內酯以及環化碳酸酯也可以被PONl水解。PONl還可以催化酯化反應的逆反應-水解反應(Mackness等人，2002；Ng等人，2001)。P0N2是對氧磷酶基因家族在染色體上的第二個成員，和PONl—樣有9個外顯子和8個內含子，與PONl同源性達7990%，但P0N2不存在HDL上，而是位於膜脂蛋白上。P0N2在人體肝、腦、腎等組織中廣泛表達，P0N2的芳基脂酶及對氧磷酶的活性比PONl要差(Ng等人，2001)。P0N3含有5個外顯子和3個內含子，編碼353個胺基酸組成的蛋白質，蛋白約為40kDa，在人體內主要存在於HDL顆粒上，但是其濃度要比PONl低50倍左右(Draganov等人，2000)。P0N2和P0N3與PONl有著相當的結構和功能上的相似性。在哺乳動物的組織中，P0N2的表達很廣泛，並被認為是細胞內延緩LDL氧化程度的抗氧化劑。而P0N3則是和PONl很相似，在肝臟內合成並與HDL結合發揮其抗氧化的功能(Ng等人，2005)。2.2P0N家族成員和OXLDL的關係PON是對氧磷酶，具有催化水解反應的活性，可以降解由酯化反應形成的各種酯類。而oxLDL的形成正是酯化反應，也就是說PON可以對抗oxLDL的形成。而PON家族的3個成員在機體內有著不同的分布位置，功能上卻十分相似，都是具有對氧磷酶的活性，可以催化酯化反應的逆反應水解反應。因此，可以說PON正是對抗oxLDL形成的重要因素之一(Aviram禾口Rosenblat,2004)。2.3P0N家族成員在動脈粥樣硬化中起的作用2.3.1P0N1和動脈粥樣硬化的關係PONl存在於HDL顆粒上，可以對抗LDL的氧化，降低oxLDL的水平，達到對抗動脈粥樣硬化的作用(Watson等人，1995)。PONl對抗動脈粥樣硬化的作用已經由動物水平PONl的轉基因和敲除實驗證明。實驗證明純化的POm可以對抗LDL的氧化損傷，還可以加速氫過氧化磷脂的降解(Watson等人，1995)。而PONl可以水解人體內冠狀動脈粥樣癍塊中的氧化性脂類也已經被證實(Hedrick等人，2000)。同時關於PONl的過表達和敲除動物實驗也提示了PONl對抗動脈粥樣硬化的保護性作用。PONl基因敲除小鼠，飼餵高脂飲食就會引起比對照小鼠更嚴重的AS的發生，而其體內的HDL也喪失了保護LDL不被氧化的作用(Shih等人，1998)。而人PONl基因過表達的小鼠在同等條件下則會對抗AS的發生(Tward等人，2002)。同時臨床試驗也提供了關於PONl功能的證據，PONl的SNP相關研究證明PONl體內活性低會增加罹患動脈粥樣硬化的機率(Watzinger等人，2002)。2·3·2P0N2與動脈粥樣硬化的關係P0N2在哺乳動物體內的表達很廣範，並且被認為具有在細胞內對抗LDL氧化的作用(Ng等人，2001)。過表達P0N2的細胞可以降低細胞內LDL氧化的程度並且可以更為有效的對抗H2O2和氧化性脂類引起的細胞內氧化應激(Ng等人，2001)。同時有P0N2的動物水平的敲除研究證明其敲除鼠較同窩的野生型小鼠更易產生動脈粥樣硬化癍塊(Ng等人，2006)，這也有力的證明了P0N2也是具有對抗動脈粥樣硬化的作用。同時，有關P0N2的SNP研究也提示了P0N2和血漿內總膽固醇濃度，甘油三酯的調控，腎病和II型糖尿病都有著密切的關係(Hegele等人，1997)。而P0N2和動脈粥樣硬化發展的關係還可以通過其與患有家族遺傳性的高膽固醇血症的高加索人的動脈內膜增生的關係得到解釋(Leus等人，2001)。2.3.3P0N3和動脈粥樣硬化的關係P0N3是一個由肝臟合成的40kDa的蛋白，在人和兔的血清中會結合在HDL上而不與LDL結合。而在HDL上，P0N3的濃度比PCMl要低50倍(Draganov等人，2000)。有研究表明，用P0N3預處理過的人動脈內皮細胞具有對抗輕微oxLDL產生並使已經形成的oxLDL失活的特性。但是P0N3的水解活性不如PONl，不能水解對氧磷脂，在HepG2細胞和高脂飲食刺激的小鼠肝臟中，P0N3的表達不受氧化性磷脂的調控。這些表明P0N3在對抗動脈粥樣硬化上發揮的作用沒有POm強大，但是仍有一定的功能(Reddy等人，2001)。有研究表明在動脈粥樣硬化易感模型的ApoE敲除鼠中，腺病毒介導的P0N3的表達會對抗動脈粥樣硬化的發生(Ng等人，2007)。而P0N3的轉基因小鼠也表現出對抗動脈粥樣硬化的能力(Shih等人，2007)。綜上所述，PON家族的3個成員雖然在功能上效果強弱不一，但是總體上效應卻是一致的，都有著對抗動脈粥樣硬化發生、發展的作用，然而，已公開的數據均只是側重於單個PON家族成員在減小動脈粥樣硬化癍塊面積中的作用，截止目前，尚未有關於PON家族作為一個基因簇是否能夠在抑制癍塊發展的基礎上進一步穩定動脈粥樣硬化癍塊的進一步研究。
發明內容如前所述，已有的針對P0N1、P0N2和P0N3單個基因的研究表明它們能夠通過抑制LDL的氧化而抑制動脈粥樣硬化。本發明則涉及PON作為基因簇對動脈粥樣硬化癍塊的作用。因此，本發明的第一方面涉及PON基因簇在製備用於治療哺乳動物動脈粥樣硬化的藥物中的用途，優選地，所述哺乳動物為小鼠或人，更優選地，所述哺乳動物為人。本發明的第二方面涉及一種PON基因簇轉基因動物模型的培育方法，其包含下述步驟a)將包含人PON基因簇的載體用適當限制酶切線性化取出載體DNA，並常規處理用於顯微注射；b)將上述DNA用顯微注射緩衝液稀釋為約l_2ng/μL，顯微注射到代孕動物的受精卵；c)將注射過的受精卵置於M16培養基中，CO2孵箱37°C培養1_2天；d)將步驟c)的受精卵移卵假孕的代孕動物，娩出小動物後，通過使用PCR和SouthernBlot篩選PON基因簇陽性轉基因動物。優選地，載體為BAC載體RP11-104H16，限制酶為NotI。優選地，所述動物為小鼠。優選地，所述受精卵為C57BL/6J受精卵。本發明的第三方面涉及PON基因簇在培育PON基因簇陽性的動脈粥樣硬化轉基因小鼠模型中的用途。優選地，在於所述轉基因小鼠模型通過下述步驟獲得a)將根據權利要求7獲得的小鼠與動脈粥樣硬化模型apoE+鼠雜交，得到PON基因簇陽性和apoE+基因型的小鼠；b)將步驟a)獲得的小鼠與apoE+鼠再雜交一代，得到PON基因簇陽性和apoE+基因型的小鼠，即PON基因簇陽性的動脈粥樣硬化轉基因小鼠模型；及可選的c)將步驟b)獲得的小鼠與apoE+鼠繼續雜交以獲得大量的PON基因簇陽性的動脈粥樣硬化轉基因小鼠。換言之，本發明選用了含全部3個PON基因序列及其相應調控序列的PON基因簇構建轉基因小鼠，並將其與研究動脈粥樣硬化的經典模型apoE基因敲除小鼠雜交，獲得PON基因簇轉基因陽性而apoE基因純合缺失的小鼠模型進行了動脈粥樣硬化相關研究，通過提取轉基因小鼠的腹腔巨噬細胞研究PON基因簇在巨噬細胞系統內作用於動脈粥樣硬化的機制，發現與單個PON基因，即P0N1、P0N2和P0N3的作用機理不同，PON基因簇通過促進動脈粥樣硬化癍塊的穩定性而實現治療動脈粥樣硬化的目的。PON基因簇的這種獨特的作用機制為開發通過提高動脈粥樣硬化癍塊的穩定性而實現治療動脈粥樣硬化的藥物提供了依據。圖1顯示了本發明的整體實驗設計思路。圖2:顯示了包含有PON基因簇的基因組片段結構。顯微注射的片段是一個包含有P0N1、P0N2和P0N3結構基因(陰影部分)和旁側序列(空白部分)的長170kb的人基因組DNA。圖3顯示了用4對引物來通過PCR的方法鑑定BAC克隆04H16。圖4顯示了BAC-RPl1-104H16的PFGE圖，分子量標準是來源於NEB的小片段Pi7G分子量標準N0350。圖5顯示了通過PCR來鑑定轉基因鼠。P1-P5轉基因鼠，WT:野生型，BAC:RPll-104hl6,DL2000分子量標準。圖6顯示了通過SouthernBlot來鑑定轉基因鼠。Southernblot分析的DNA是按照如下所示分離所得的第1泳道，人基因組DNA；第2泳道，Pl株PC轉基因鼠；第3泳道，P2株PC轉基因鼠；第4泳道，P3株PC轉基因鼠；第5泳道，P4株PC轉基因鼠；第6泳道，P5株PC轉基因鼠；第7泳道，野生型小鼠。所有的DNA用EcoRI消化，分別與3對引物雜交較低的引物針對人PONl基因序列(人BAC克隆RP11-104H16的10090-10515位)；中間的引物是針對人的P0N3基因序列(人BAC克隆RP11-104H16的96169-96727位)；更高的引物針對人的P0N2基因序列(人基因組的165366-165663位)。圖7顯示了人(H)P0N1、P0N2和P0N3基於在轉基因鼠的組織中的表達情況，包括心臟(Ht)、腎臟(Kd)、肝臟(Li)、肺(Lu)、肌肉(Ms)、小腸(In)、脾臟(Sp)、胃(St)、主動脈(Ao)、卵巢(Ov)以及腦(Br)，小鼠內源性的(M)P0N1、P0N2、P0N3和肌動蛋白作為對照。圖8顯示了野生型鼠的各器官中沒有HPON基因的表達。圖9顯示了5株轉基因鼠中，P2株轉基因鼠在肝臟中的人PONl基因表達最高。圖10顯示了人P0N1、P0N2和P0N3蛋白在P2株轉基因鼠的肝臟和主動脈中的表達情況。圖11顯示了人PONl基因在PC轉基因鼠的HDL中的表達情況。圖12顯示了通過對氧磷酶活性試劑盒，對禁食的野生型(淺色柱)和PC轉基因鼠(深色柱)地HDL進行相對的對氧磷酶活性檢測。顯示的數值是每種基因型各10隻小鼠的平均值。*代表P<0.05。圖13顯示了PC轉基因/ApoE+的小鼠和對照的ApoE+的小鼠相比，癍塊面積更小、脂質面積更小。ApoE+小鼠AS癍塊HE染色結果。PC轉基因/ApoE+的小鼠⑶的癍塊面積比對照組的ApoE+小鼠(A)要低30.8%(C)0PC轉基因/ApoE+小鼠(B)的癍塊脂質核心(圖中癍塊內的黑色區域)面積比對照ApoE+小鼠㈧要低13.1%(D)0*代表ρ<0.05，**代表ρ<0.01。各組中η=10。圖14顯示了PC轉基因/ApoE+小鼠的癍塊比對照ApoE+小鼠的更加穩定。分離出來的主動脈竇用油紅0對脂質進行染色(Α&Β)，苦味酸和Sirius染膠原(C&D)，SMA染SMC(E&F)，Moma-2染巨噬細胞(G&H)。I:PC轉基因/ApoE+小鼠的癍塊與對照的ApoE+鼠相比，膠原百分比(76.9%增加)，SMC(15.8%增加)，巨噬細胞(22.3%)和脂質面積(9.5%)降低。*代表ρ<0.05，#代表ρ<0.01。各組中η=10。J:PC轉基因/ApoEv-小鼠的癍塊穩定性得分比ApoE+小鼠的高70%。具體實施方式通過參考下述的一些具體實施例可進一步理解本發明，這些實施例僅用於說明本發明，其無意於對本發明的範圍做出任何限制。顯然，可以對本發明做出多種改動和變化而不脫離本發明的實質，因此，這些改動和變化同樣在本申請要求保護的範圍內。實施例實施例1研究方法和材料轉基因用細菌人工染餼體(BAC)包含人PON基因簇的BAC載體(RP11-104H16)購自ChoriBacPac公司，這個克隆包含人P0N1，P0N2和P0N3結構基因及他們相應的旁側序列，全長170kb。如圖2所示。BAC經PCR、PFGE及網上檢索，確認無誤。實驗用小鼠及飼料C57BL/6小鼠，C57BL/6與FVB雜交Fl代雄鼠和小鼠專用飼料由中國軍事醫學科學院動物中心提供。小鼠飼養於二級動物房，清潔飲水，除說明的情況外自由取食。環境採用十二小時明暗循環，早七點到晚七點照明，晚七點到次日早七點無照明。所有動物實驗都按照中國醫學科學院實驗動物管理條例進行。用於誘導動脈粥樣硬化的高脂飲食由中國醫學科學院動物研究所提供，成分為每10千克含有基礎食物8875g、甘油三酯lOOOg、膽固醇125g。PON基因簇轉基因小鼠的構建將BACDNA用NotI酶切線性化取出載體DNA序列，並常規處理用於顯微注射(Gao等人，2005)。完整DNA稀釋為1.2ng/μL濃度顯微注射到C57BL/6J受精卵構建PON基因簇轉基因小鼠。癍塊組織形傑學分析及其穩定件判斷高脂飲食誘導16周後，處死小鼠。經左心室行冷PBS和4%多聚甲醛溶液相繼體循環灌注。收集保留升主動脈的心臟(10隻/組)以OTC包埋，之後進行主動脈根部連續冰凍切片，厚度10μm,以主動脈瓣為切片的位置標記(Ni等人，2001)。每個染色指標以5張連續的相隔80μm的切片進行分析。獲得的切片先行H&E進行形態學分析。然後分別以油紅0和苦味酸-天狼星紅染色脂質核心和膠原；分別用抗-α-平滑肌細胞(SMC)-Actin(Abcam，ab5694抗體和抗M0MA-2(Serotec,MCA519G)抗體免疫組化染色SMC和巨噬細胞。相應的染色區域結果掃描成像後以Imag印roPlus5軟體進行定量分析。癍塊穩定性的比較通過分別比較癍塊主要成分及脂質核心、膠原組織、平滑肌細胞和巨噬細胞的百分比進行。總體的穩定性以癍塊穩定分數來反映，癍塊穩定分數=(SMC面積+膠原面積)/(巨噬細胞面積+脂質核心面積)(Ni等人，2001)。統計學分析所有的值均計算為均值士標準差。兩組之間的數值以Student'sttest進行檢驗分析。當P<0.05認為有統計學意義。實施例2研究結果BACRP11-104H16包含人完整PON基因簇元件顯微注射用BACRP11-104H16經針對不同位點PCR鑑定，證明其克隆的正確性及完整性(參見圖3)。BACRP11-104H16經PFGE鑑定，大小約為170kb，與預期一致(參見圖4)。顯微灃射用DNA的製備得到高質量和高純度的DNA可以用於顯微注射。測定DNA濃度，約為25-30ng/μ1，再用顯微注射緩衝液將其稀釋為l-2ng/y1，每管20μ1分裝，存放於_20°C，用於顯微注射。顯微注射後將注射過的受精卵置於M16培養基中，CO2孵箱37°C培養1_2天，觀察到受精卵二分裂率大於90%，三分裂率大於40%，顯示該DNA的質量適合用於顯微注射受精卵製備轉基因小鼠。人PON基因簇轉基因鼠系的建立將純化好的PON基因簇線狀DNA顯微注射C57BL/6小鼠受精卵雄性原核，移卵假孕鼠，懷孕共娩出58隻新生小鼠。剪取鼠耳，消化後用PCR的方法鑑定陽性轉基因鼠。設計的引物能與轉基因人源PON基因簇的PONl序列配對，但不會與小鼠內源基因配對。因此該引物在轉基因鼠基因組作為模板時可以擴增出陽性條帶，但在野生型小鼠基因組作為模板時不會擴增出產物。使用該引物能初步鑑定陽性轉基因鼠，先後在5隻新生小鼠中檢測到陽性擴增片段，分別命名為PI、P2、P3、P4和P5(參見圖5)。應用SouthernBlot方法對5株轉基因陽性小鼠進一步確認。剪取鼠尾提取基因組DNA，選取EcoRI消化基因組，轉膜，雜交。探針模板P1、P3和P2分別對應於轉基因片段上的人P0N1、P0N3和P0N2基因序列。序列在網上經BLAST比對顯示與小鼠內源基因組無明顯同源性。完整的轉基因經探針雜交分別產生約2kb、5kb和7kb大小的條帶，而正常的小鼠基因組不會有雜交條帶產生。實驗結果顯示雜交條帶大小均與預期相符，證實所得5株小鼠均為陽性轉基因小鼠(參見圖6)。轉基因在小鼠體內ιΗ確的表達在建立轉基因小鼠之後，進一步檢測轉入的PON基因簇的3個基因成員是否在小鼠體內能實現正確的組織特異性表達，以RT-PCR檢測轉入基因在小鼠體內的表達產物。分別取轉基因和陰性同窩小鼠的心(Ht)、腎(Kd)Jf(Li)、肺(Lu)、肌肉(Ms)、小腸(In)、脾(Sp)、胃(St)、卵巢(Ov)、動脈(Ao)、腦(Br)組織，提取組織總RNA，進行反轉錄合成cDNA第一鏈。cDNA產物各取1μ1作為模板，所用引物見表1:以上引物退火溫度均為60°C，PCR反應除β-肌動蛋白為24個循環外，均為30個循環。PCR產物經電泳顯示轉入的3個PON基因成員的組織表達分布與相應的小鼠內源的3個PON基因基本一致，即Ρ0Ν1主要在肝臟高表達，而Ρ0Ν2和Ρ0Ν3則表達相對廣泛(參見圖7)。而陰性同窩鼠樣品中檢測不到轉入的人PON基因的表達(參見圖8)。再分別取5株轉基因小鼠和陰性同窩小鼠的肝臟勻漿提取蛋白質，用Westernblot檢測人POm蛋白的表達。結果顯示，在5株陽性轉基因小鼠肝臟中，P2株小鼠肝臟人PONl表達最高(參見圖9)。提取P2株轉基因鼠的肝臟和主動脈蛋白分別進行Western-Blot檢測，發現P2轉基因鼠肝臟可以表達人P0N1、P0N2、和P0N3，而其主動脈則主要表達人P0N2，同時在主動脈上還檢測到少量人POm及微量人P0N3，可能是主動脈中有HDL存在的結果(參見圖10)。分別取10隻P2株轉基因小鼠和10隻同窩對照小鼠的禁食血清，超速離心分離出HDL,兩組分別等量混合後，部分進行脫脂處理後行Western-Blot檢測人PON的蛋白表達，結果發現只在P2轉基因小鼠的HDL上檢測到人PONl蛋白(參見圖11)。另一部分分離的HDL以苯酸乙酯作為底物測量其對氧磷酶活性，結果發現P2-HDL的對氧磷酶活性比對照非轉基因小鼠HDL高約1.7倍(參見圖12)。綜上所述，轉基因實現了在小鼠體內的正確高水平表達，並具有相應的活性。依據以上實驗結果，我們選擇拷貝數較高的Pl和P2株轉基因小鼠進行後續的研究。主要出示P2株系的結果，Pl株系的相應結果只有與P2株系不同時單獨列出。轉基因鼠在ιΗ常條件無明顯表型各株系轉基因小鼠後代中外源基因的出現頻率接近50%，符合孟德爾遺傳規律，說明轉入的基因沒有胚胎致死效應。轉基因小鼠外觀行為上無明顯異常。當給予正常飲食時，雌性及雄性轉基因小鼠的體重、血漿總膽固醇(CHO)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-CHO)、低密度及極低密度脂蛋白膽固醇(LDL/VLDL-CH0)、甘油三酯(TG)、血糖水平均與同窩對照小鼠相近，見表2。hPCVapoEzzz鼠系的津立選擇Pl和P2兩株轉基因鼠與動脈粥樣硬化模型apoE+鼠雜交，用來研究轉入人PON基因簇對動脈粥樣硬化發生的影響。陽性鼠與apoE+鼠雜交第一代得到的hPC+/ap0E"_基因型的鼠，再與apoE+鼠雜交一代，可鑑定得到hPC7apoE+基因型的鼠，用這種基因型的鼠繼續與apoE+鼠繼續雜交，即可得到足夠數量的hPC+/apoE+基因型鼠和同窩的非轉基因apoE+基因型鼠，餵食高脂飲食誘導發生動脈粥樣硬化，用於觀察轉入人PON基因簇對動脈粥樣硬化發生的影響。在此過程中用基因型為apoE+的同性別的同窩小鼠作為對照。兩株轉基因鼠在雜交中產生的後代各種基因型出現的頻率符合孟德爾規律。兩株轉基因鼠在所有的實驗結果中都沒有差異，表明所得出的結果不是株系特異性的，而是具有普遍規律。PON基因簇轉基因促進動脈粥樣硬化癍塊的穩定性為了研究PON基因簇轉基因促進動脈粥樣硬化癍塊的穩定性，高脂飲食誘導16周後的雌性PCTg/ApoE缺失和ApoE缺失小鼠的心臟被收集並進行切片染色分析。H&E染色表明PCTg/ApoE缺失小鼠的癍塊面積比對照鼠小30.8%(參見圖13C)，而其無染色區面積(指示壞死核心)佔癍塊總面積的百分比也比對照鼠少13.(參見圖13D)。這樣的結果，一方面說明PON基因簇轉基因抑制了動脈粥樣硬化的形成；另一方面也提示PON基因簇轉基因鼠的癍塊可能具有更厚的纖維帽以及更小的壞死核心。進一步通過比較癍塊的組成進行穩定性分析表明，PCTg/ApoE缺失小鼠的板塊具有更多的膠原(76.9%，參見圖14C、圖14D和圖141)和平滑肌細胞(15.8%，參見圖14G、圖14H和圖141)，更少的巨噬細胞浸潤(22.3%，參見圖14E、圖14T和圖141)和脂質核心(9.5%，參見圖14A、圖14B和圖141)。以上癍塊組成性方面的系列變化說明PON基因簇轉基因促進了動脈粥樣硬化癍塊的穩定性。相應的，癍塊穩定分數也因為PON基因簇轉基因而增加(參見圖14J)。stress，andmacrophagefoamcellformationduringatherosclerosisdevelopment.FreeRadicBiolMed37，1304-1316.Draganov，D.I.，Stetson，P.L.，Watson，C.E.，Billecke，S.S.，andLaDu,B.N.(2000).Rabbitserumparaoxonase3(P0N3)isahighdensitylipoprotein-associatedlactonaseandprotectslowdensitylipoproteinagainstoxidation.JBiolChem275,33435-33442.Galis，Z.S.(2004).Vulnerableplaque:thedevilisinthedetails.Circulation110，244-246.Gao,J.，Wei，Y.，Huang，Y.，Liu,D.，Liu,G.，Wu,Μ.，Wu,L.，Zhang，Q.，Zhang，Ζ.,Zhang,R.，etal.(2005).TheexpressionofintactandmutanthumanapoAI/CIII/AIV/AVgeneclusterintransgenicmice.JBiolChem280，12559-12566.Glass，C.K.，andWitztum,J.L.(2001).Atherosclerosis,theroadahead.Celll04，503-516.Harel，M.，Aharoni，A.，Gaidukov，L，Brumshtein，B.，Khersonsky，0.，Meged，R.，Dvir，Η·,Ravel1i,R.B.，McCarthy，Α·，Toker，L，etal.(2004).Structureandevolutionoftheserumparaoxonasefamilyofdetoxifyingandanti-atheroscleroticenzymes.NatStructMolBiol11,412-419.Hedrick，C.C.，Hassan，K.，Hough，G.P.，Yoo,J.H.，Simzar,S.，Quinto，C.R.，Kim,S.Μ.，Dooley，Α.，Langi，S.，Hama,S.Y.，etal.(2000).Short-termfeedingofatherogenicdiettomiceresultsinreductionofHDLandparaoxonasethatmaybemediatedbyanimmunemechanism.ArteriosclerThrombVascBiol20，1946—1952.HegeleiR.A.,ConnellyiP.W.,SchereriS.W.,HanleyiA.J.,HarrisiS.B.，Tsui，LC·，andZinman，B.(1997).Paraoxonase~2gene(P0N2)G148variantassociatedwithelevatedfastingplasmaglucoseinnoninsulin-dependentdiabetesmellitus.JClinEndocrinolMetab82，3373-3377.Jiang，Z.Y.，Hunt，J.V.，andWolffiS.P.(1992).Ferrousionoxidationinthepresenceofxylenolorangefordetectionoflipidhydroperoxideinlowdensitylipoprotein.AnalBiochem202，384-389.Lee,R.Τ.,andLibby,P.(1997).Theunstableatheroma.ArteriosclerThrombVascBiol17，1859-1867.Leus,F.R.，Zwart,Μ.，Kastelein,J.J.，andVoorbij,H.A.(2001).P0N2genevariantsareassociatedwithclinicalmanifestationsofcardiovasculardiseaseinfamilialhypercholesterolemiapatients.Atherosclerosis154，641—649·Libby,P.(2002).Inflammationinatherosclerosis.Nature420,868-874.LusisiA.J.(2000).Atherosclerosis.Nature407，233—241.Mackness，Μ.I.，Mackness，B.，andDurrington，P.N.(2002).Paraoxonaseandcoronaryheartdisease.AtherosclerSuppl3，49—55·Mackness，Μ.I.，Mackness，B.，Durrington，P.N.，FogeIman,A.M.，Berliner，J.，Lusis，A.J.，Navab,Μ.，Shih，D.，andFonarow,G.C.(1998).Paraoxonaseandcoronaryheartdisease.CurrOpinLipidol9,319-324.Ng,C.J.，Bourquard，N.,Grijalva,V.,Hama,S.,Shih,D.Μ.,Navab,Μ.,FogeIman,A.M.，Lusis，A.J.，Young，S.，andReddy,S.T.(2006).Paraoxonase~2deficiencyaggravatesatherosclerosisinmicedespitelowerapolipoprotein-B-containinglipoproteins:anti-atherogenicroleforparaoxonase-2.JBiolChem281,29491-29500.Ng,C.J.，Bourquard，N.，Hama,S.Y.，Shih，D.，Grijalva，V.R.，Navab,Μ.，FogeIman,Α.Μ.，andReddy,S.Τ.(2007).Adenovirus-mediatedexpressionofhumanparaoxonase3protectsagainsttheprogressionofatherosclerosisinapolipoproteinE—deficientmice.ArteriosclerThrombVascBiol27，1368—1374.Ng，C.J.，Shih,D.Μ.，Hama,S.Y.，Villa，N.，Navab,Μ.，andReddy，S.Τ.(2005).Theparaoxonasegenefamilyandatherosclerosis.FreeRadicBiolMed38，153—163.Ng，C.J.，Wadleigh,D.J.，Gangopadhyay,Α.，Hama,S.，Grijalva,V.R.，Navab,Μ.,Fogelman,A.Μ.,andReddy,S.Τ.(2001).Paraoxonase-2isaubiquitouslyexpressedproteinwithantioxidantpropertiesandiscapableofpreventingcell-mediatedoxidativemodificationoflowdensitylipoprotein.JBiolChem276，44444—44449.Ni，W.，Egashira，K.，Kitamoto，S.，Kataoka，C.，Koyanagi,Μ.，Inoue，S.，Imaizumi,K.，Akiyama，C.,Nishida,K.I.，andTakeshita,Α.(2001).Newanti-monocytechemoattractantprotein—1genetherapyattenuatesatherosclerosisinapolipoproteinΕ-knockoutmice.Circulation103,2096-2101.Primo-Parmo，S.L，Sorenson，R.C.，Teiber,J.，andLaDu,B.N.(1996).Thehumanserumparaoxonase/arylesterasegene(P0N1)isonememberofamultigenefamily.Genomics33,498-507.Reddy,S.T.，Wadleigh,D.J.，Grijalva,V.，Ng，C.，Hama,S.，Gangopadhyay,Α.，Shih,D.Μ.，Lusis,Α.J.，Navab,Μ.，andFogeIman,Α.Μ.(2001).Humanparaoxonase-3isanHDL—associatedenzymewithbiologicalactivitysimilartoparaoxonase-1proteinbutisnotregulatedbyoxidizedlipids.ArteriosclerThrombVascBiol21,542-547.Schwartz,S.M.，Galis，Z.S.，Rosenfeld，Μ.E.，andFalk，E.(2007).Plaqueruptureinhumansandmice.ArteriosclerThrombVascBiol27，705—713.Shih,D.M.，Gu,L，Hama,S.，Xia，Y.R.，Navab,Μ.，FogeIman,Α.Μ.，andLusis,Α.J.(1996).Genetic-dietaryregulationofserumparaoxonaseexpressionanditsroleinatherogenesisinamousemodel.JClinInvest97，1630—1639·Shih,D.M.，Gu，L.，Xia,Y.R.，Navab,Μ.，Li,W.F.，Hama,S.，Castellani,L.W.，Furlong，C.Ε.，Costa,LG.，FogeIman,Α.Μ.，etal.(1998).Micelackingserumparaoxonasearesusceptibletoorganophosphatetoxicityandatherosclerosis.Nature394,284-287.Shih,D.M.，Xia,Y.R.，Wang,X.P.，Miller,Ε.，Castellani,L.W.，Subbanagounder,G.，Cheroutre,H.，Faull，K.F.，Berliner，J.Α.，Witztum,J.L，etal.(2000).Combinedserumparaoxonaseknockout/apolipoproteinEknockoutmiceexhibitincreasedlipoproteinoxidationandatherosclerosis.JBiolChem275,17527-17535.Shih,D.M.，Xia,Y.R.，Wang,X.P.，Wang,S.S.，Bourquard,N.，FogeIman,A.M.，Lusis,A.J.,andReddy,S.T.(2007).Decreasedobesityandatherosclerosisinhumanparaoxonase3transgenicmice.CircRes100,1200-1207.Steinberg,D.(1997).Lowdensitylipoproteinoxidationanditspathobiologicalsignificance.JBiolChem272,20963-20966.Tward,A.，Xia,Y.R.，Wang,X.P.，Shi,Y.S.，Park,C.，Castellani,L.W.，Lusis,A.J.,andShih,D.Μ.(2002).Decreasedatheroscleroticlesionformationinhumanserumparaoxonasetransgenicmice.Circulation106,484-490.Watson,A.D.,Berliner,J.A.,Hama,S.Y.,LaDu,B.N.,Faul1,K.F.,FogeIman,A.M.,andNavab,M.(1995).Protectiveeffectofhighdensitylipoproteinassociatedparaoxonase.Inhibitionofthebiologicalactivityofminimallyoxidizedlowdensitylipoprotein.JClinInvest96,2882-2891.Watzinger,N.,Schmidt,H.,Schumacher,Μ.,Schmidt,R.,Eber,B.,Fruhwald,F.Μ.,Zweiker,R.,Kostner,G.Μ.,andKlein,W.(2002).Humanparaoxonaselgenepolymorphismsandtheriskofcoronaryheartdisease-.acommunity-basedstudy.Cardiology98,116-122.序列表中國醫學科學院基礎醫學研究所P0N基因簇在製備用於治療動脈粥樣硬化的藥物中的用途890038CG14PatentInversion3.3122DNA人工引物hPOm-RT-S1aaaggaatcgaaactggctctg22221DNA人工引物hPONl-RT-A2gactgttggggttgaagctct21321DNA人工引物hP0N2-RT_S3ctcttcgtgtatgacccgaac21423DNA人工引物hP0N2-RT_A4acccattgttggcataaactgta23521DNA人工引物hP0N3-RT_S5aactttgcgccagatgaacca21622DNA人工引物hP0N3-RT_A6tcatgtggggatgattcacaac722DNA人工引物mPONl-RT-S7tactggtggtaaaccatccaga22823DNA人工引物mPONl-RT-A8gcagctatatcgttgatgetagg23920DNA人工引物mP0N2-RT_S9gctctgagtttgctgggcat201020DNA人工引物mP0N2-RT_A10ccacgctaaagaaagccagg201119DNA人工引物mP0N3-RT_S11cctcactggacttccgtcg191223DNA人工引物mP0N3-RT-A12ggatcaacggtcaagttatccac231320DNA人工引物β_肌動蛋白-s13gtggggcgccccaggcacca201424DNA人工弓丨物β_肌動蛋白-a14ctccttaatgtcacgcacgatttc權利要求PON基因簇在製備用於治療哺乳動物動脈粥樣硬化的藥物中的用途。2.根據權利要求1所述的用途，其特徵在於所述哺乳動物為小鼠或人。3.根據權利要求1所述的用途，其特徵在於所述哺乳動物為人。4.一種PON基因簇轉基因動物模型的培育方法，其包含下述步驟a)將包含人PON基因簇的載體用適當限制酶切線性化取出載體DNA，並常規處理用於顯微注射；b)將上述DNA用顯微注射緩衝液稀釋為約l-2ng/yL，顯微注射到代孕動物的受精卵；c)將注射過的受精卵置於M16培養基中，CO2孵箱37°C培養1-2天；d)將步驟c)的受精卵移卵假孕的代孕動物，娩出小動物後，通過使用PCR和SouthernBlot篩選PON基因簇陽性轉基因動物。5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於載體為BAC載體RP11-104H16，限制酶為NotI。6.根據權利要求4或5所述的方法，其特徵在於所述動物為小鼠。7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述受精卵為C57BL/6J受精卵。8.PON基因簇在培育的PON基因簇陽性的動脈粥樣硬化轉基因小鼠模型中的用途。9.根據權利要求8所述的用途，其特徵在於所述轉基因小鼠模型通過下述步驟獲得a)將根據權利要求7獲得的小鼠與動脈粥樣硬化模型apoE+鼠雜交，得到PON基因簇陽性和apoE+基因型的小鼠；b)將步驟a)獲得的小鼠與apoE+鼠再雜交一代，得到PON基因簇陽性並且apoE+基因型的小鼠，即PON基因簇陽性的動脈粥樣硬化轉基因小鼠模型；及可選的c)將步驟b)獲得的小鼠與apoE+鼠繼續雜交以獲得大量的PON基因簇陽性的動脈粥樣硬化轉基因小鼠。全文摘要本發明涉及PON基因簇在製備用於治療哺乳動物動脈粥樣硬化的藥物中的用途，其中PON基因簇通過促進動脈粥樣硬化癍塊塊的穩定性而實現治療動脈粥樣硬化的目的。本發明還涉及PON基因簇轉基因小鼠模型的培育方法及PON基因簇在培育的PON基因簇陽性的動脈粥樣硬化轉基因小鼠模型中的用途。文檔編號C12N15/85GK101843905SQ200910081009公開日2010年9月29日申請日期2009年3月27日優先權日2009年3月27日發明者劉德培,折志剛,鄭偉,陳厚早,韋玉生申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所