突變的呼腸孤病毒及其製備和使用方法

2023-06-10 13:19:31

專利名稱：突變的呼腸孤病毒及其製備和使用方法
突變的呼腸孤病毒及其製備和使用方法 相關申請的交叉引用
本申請要求2007年5月21日提交的美國臨時申請第60/939,255號的權益。
背景
呼腸孤病毒建立生產性感染的能力需要蛋白水解外衣殼。蛋白水解將 病毒體轉變為稱為中間亞病毒體粒子(ISVP)的形式，該形式具有穿透細胞 膜的能力並因此接近病毒基因表達所需的細胞質成分。對完整呼腸孤病毒 病毒體部分蛋白水解以產生ISVP還可在體外使用蛋白酶諸如糜蛋白酶或 胰蛋白酶進行。參見例如，Golden等人.(2002, Mra/., 76:7430-43)和 Chandran & Nibert (1998，丄Mra/., 72:467-75)。
概述
本公開描述了缺乏d3多肽表達或展示o3多肽表達減少或缺乏功能性 cj3多肽的突變的呼腸孤病毒。本文所述的突變的呼腸孤病毒可用於產生和 穩定地繁殖ISVP。
描述了一種突變的呼腸孤病毒，其包含減少o3多肽表達、實質上消 除cr3多肽表達、或導致功能性o3多肽不存在的第一突變。該第一突變可 在編碼所述a3多肽的核酸中或在調節所述d3多肽表達的核酸中。在某些 情況中，該核酸是S4基因。代表性的突變包括遺傳改造的取代和遺傳改 造的插入或缺失一個或多個核苷酸。通常，該第一突變減少所述cj3多肽 表達的至少30%。如本文所述的突變的呼腸孤病毒可包含一種或多種另外的突變。該另 外的突變可為減少多肽表達、實質上消除pl多肽表達、或導致功能性
pl多肽不存在的突變；減少X2多肽表達、實質上消除X2多肽表達、或導 致功能性多肽不存在的突變；和/或減少crl多肽表達、實質上消除cj1 多肽表達、或導致功能性al多肽不存在的突變。
還提供一種遺傳改造的呼腸孤病毒感染性亞病毒粒子(ISVP)。這種呼 腸孤病毒ISVP可被遺傳改造以展示a3多肽表達減少、以缺乏cj3多肽表 達、或以表達非功能性cj3多肽。如本文所述的呼腸孤病毒ISVP可被遺傳 改造以包含第一突變。該第一突變可在編碼所述a3多肽的核酸中或在調 節所述cy3多肽表達的核酸中。在某些情況中，該核酸是S4基因。代表性 突變包括取代和插入或缺失一個或多個核苷酸。通常，該笫一突變減少所 述cj3多肽的表達的至少30%。
如本文所述的突變的呼腸孤病毒可包含一種或多種另外的突變。所述 另外的突變可為減少lil多肽表達、實質上消除pl多肽表達、或導致功能 性pl多肽不存在的突變；減少人2多肽表達、實質上消除多肽表達、 或導致功能性X2多肽不存在的突變；和/或減少dl多肽表達、實質上消除 ol多肽表達、或導致功能性cjl多肽不存在的突變。
提供一種製備具有增加的感染性的呼腸孤病毒的方法。這種呼腸孤病 毒可通過以下步驟來製備突變第一呼腸孤病毒以產生突變的呼腸孤病 毒，其中所述突變的呼腸孤病毒展示a3多肽表達減少、缺乏cj3多肽表達、 或表達非功能性cj3多肽，和分離所述突變的呼腸孤病毒，其中所述突變 的呼腸孤病毒與所述第一呼腸孤病毒相比具有增加的感染性。增加的感染 性可由以下證實與所述第一呼腸孤病毒相比所述突變的呼腸孤病毒可感 染的瘤細胞範圍增加、或與所述第一呼腸孤病毒相比所述突變的呼腸孤病 毒感染的細胞數目增加。
還提供一種獲得遺傳改造的呼腸孤病毒感染性亞病毒粒子(ISVP)的方 法。這種方法包括遺傳改造第一呼腸孤病毒以展示a3多肽表達減少、 以缺乏o3多肽表達、或以表達非功能性o3多肽；培養所述遺傳改造的呼 腸孤病毒，並分離ISVP從而獲得遺傳改造的呼腸孤病毒ISVP。方法 包括向所述受治療者施用本文公開的突變的呼腸孤病毒或本文公開的遺 傳改造的呼腸孤病毒ISVP。這種方法還可包括至少一種選自手術、化療、 放療和免疫抑制療法的程序。
提供包含本文所述的突變的呼腸孤病毒或本文所述的遺傳改造的呼
腸孤病毒ISVP的藥物組合物。這種藥物組合物進一步可包含一種或多種
化療劑和/或 一種或多種免疫抑制劑。
還提供一種包含突變的a3多肽，所述突變產生不結合入病毒衣殼的cj3 多肽或以減少的水平結合入所述衣殼的a3多肽。
除非另外限定，否則本文所用的所有技術術語和科學術語與本發明方 法和組合物所屬領域的普通技術人員所通常理解的具有相同含義。下文描 述了適合的方法和材料，儘管與本文描述的方法和材料相似或等價的方法 和材料可用於實踐或測試本發明的方法和組合物。此外，材料、方法和實
例僅僅是示例性的並不意為限制。本文提到的所有出版物、專利申請、專 利和其它參考文獻通過引用以其全部內容併入本文。


圖1是顯示呼腸孤病毒病毒體和呼腸孤病毒ISVP的結構元件的示意圖。
詳述
本文描述了缺乏cj3多肽表達或展示o3多肽表達減少或缺乏功能性a3 多肽的突變的呼腸孤病毒。除了在編碼或調節d3多肽的核酸中含有突變， 本文所述的突變的呼腸孤病毒還可在一種或多種其它外衣殼蛋白中含有 另外的突變。本文提供的突變的呼腸孤病毒可用於產生中間亞病毒體粒子 (ISVP)，其可以ISVP穩定地繁殖用於多次傳代。與呼腸孤病毒自身相比 ISVP通常展示增加的感染性和/或減少的免疫原性，但ISVP通常缺乏以穩 定方式繁殖的能力。相反，以突變的呼腸孤病毒形成的ISVP證實了可用於多次複製的穩定繁殖，不同於酶處理或類似方法產生的ISVP。
炎ir^呼應孤^毒fp翔備才法
如本文所述的突變的呼腸孤病毒可含有減少o3多肽表達或實質上消 除a3多肽表達或導致功能性o3多肽不存在的第一突變。消除cj3多肽表 達或導致功能性cj3多肽不存在的突變可在編碼o3多肽的核酸(即S4基因) 中或在編碼調節cj3多肽的表達或功能的多肽的核酸中。
o3多肽長度為365個胺基酸並具有41 kDa的分子量。完整病毒體含 有600個拷貝的o3多肽。cj3多肽很可能與包括例如pl、 X2和al的其它 外衣殼蛋白相互作用，並還可能在RNA選擇或RNA包裝中起作用。呼腸 孤病毒病毒體的圖表明，o3多肽象手指一樣在病毒體表面上伸出並對病毒 體密度有顯著貢獻。參見圖1。
本文所用的減少cj3多肽表達的突變是指與表達野生型水平cj3多肽的 呼腸孤病毒相比，導致d3多肽的量減少至少30%(如，至少40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或95%)的突變。本文所用的實質上消除cj3多肽表 達的突變是指相對於野生型呼腸孤病毒產生的多肽的量，導致cj3多肽 的量減少至少95%(如，96%、 97%、 98%、 99%或100%)的突變。本文所 用的導致功能性a3多肽減少或不存在的突變是指允許cj3多肽表達但導致 a3多肽不能組裝或結合入病毒衣殼的突變。應理解的是，對於o3多肽可 能期望或需要保持其它功能性(如，結合RNA的能力)以使突變的呼腸孤病 毒保持繁殖能力。
如本文所述的o3多肽突變可產生以減少的水平結合入衣殼的a3多 肽，該減少是相對於不含有該突變的cj3多肽(如野生型cr3多肽)而言。如 本文所述的cj3多肽突變還可產生不能結合入病毒衣殼的a3多肽。不受任 何具體機制限制，cj3多肽可具有減少的功能或缺乏功能，例如，由於a3 多肽和pl多肽不能適當地結合，或由於減少或禁止cr3多肽結合入衣殼的 構象改變。
根據本公開的突變的呼腸孤病毒可為3型哺乳動物正呼腸孤病毒。3 型哺乳動物正呼腸孤病毒包括但不限於Dearing和Abney毒抹(分別是T3D或T3A)。參見例如，ATCC登記號VR-232和VR-824。如本文所述的突變 的呼腸孤病毒可含有自發產生的突變或遺傳改造的突變。例如，可突變天 然產生的呼腸孤病毒(如分離自天然來源，如從患者分離)或可產生不表達 cj3多肽或缺乏功能性cj3多肽的重組的呼腸孤病毒(參見如美國專利第 7,163,678號)。注意到在S4基因中攜帶突變的呼腸孤病毒，諸如Clark等 人(2006,丄80:671-81)、 Ebert等人(2001,丄,/., 75:3197-206)和 Wetzel等人(1997乂. Mra/., 71:1362-9)描述的那些不是本發明突變體的部分 並從本發明突變體排除，因為這種突變體被認為表達功能性cr3多肽。
本文所指的突變可為取代或插入或缺失一個或多個核苷酸。點突變包 括，例如單個核苷酸轉變(嘌呤到噪呤或嘧啶到嘧夂)或顛換(。票呤到嘧啶 或反之亦然)和單個或多個核苷酸缺失或插入。核酸中的突變可導致編碼 的多肽中一種或多種保守性或非保守性胺基酸取代，這可能造成構象改變 或失去或部分地失去功能，翻譯讀碼框中位移("移碼")導致從該位點起 開始編碼的完全不同的多肽，提前終止密碼子導致平截的多肽("平截")， 或呼腸孤病毒核酸中的突變完全不改變編碼的多肽("沉默"或"無義")。 參見例如，Johnson & Overington, 1993,丄Afo/. 5,。/., 233:716-38; Henikoff & Henikoff, 1992,屍rac. 爿cad[/&4, 89:10915-19;和美國專利第
4,554,101號公開的保守性和非保守性胺基酸取代。
使用本領域已知的任何多種方法可在呼腸孤病毒的核酸中產生突變。 例如，位點定向誘變可用於修飾呼腸孤病毒的核酸序列。位點定向誘變的 一種最常用方法是針對寡核苷酸的誘變。在針對寡核苷酸的誘變中，將編 碼序列中期望改變的寡核苷酸退火到目標DNA的一條鏈，並作為開始 DNA合成的引物。以這種方式，將含有序列改變的寡核苷酸併入新合成的 鏈。參見例如，Kunkel, 1985, P亂編ia"c/. ,, 82:488; Kunkel等 人，1987,她仇五，膨/., 154:367; Lewis & Thompson, 1990,油c/.勿<* i^y., 18:3439; Bohnsack, 1996, A/e仇A/o/.說o/., 57:1; Deng & Nickoloff, 1992,加/. Aoc/zew., 200:81;和Shimada, 1996,嵐57:157。 本領域中例行使用其它方法來修飾蛋白或多肽的序列。例如，使用PCR或 化學合成可產生含有突變的核酸，或可化學合成胺基酸序列中具有期望改變的多肽。參見例如，Bang & Kent, 2005,屍rac. 爿cad "&4,
102:5014-9和其中的參考文獻。
除了消除cj3多肽表達或減少a3多肽表達或產生非功能性a3多肽或 導致cj3多肽功能減少的突變，如本文所述的突變的呼腸孤病毒還可包-舍 其它呼腸孤病毒衣殼多肽(如，)Lll、人2和/或ol)之一中的一種或多種另外 的突變(如，第二、第三或第四突變)。可對含有影響(J3多肽的突變和任選 地在任何或所有其它外衣殼蛋白中的另外的突變的呼腸孤病毒篩選這種 突變的呼腸孤病毒感染和導致細胞溶解的能力。例如，耐受野生型呼腸孤 病毒溶解的瘤細胞可用於篩選本文所述的突變的呼腸孤病毒。
例如，另外的突變可減少或實質上消除pl多肽的表達或導致功能性pl 多肽不存在。M2基因編碼的jil多肽可能牽涉在細胞滲透中並可能在轉錄 酶活化中起作用。每個病毒體包含約600個拷貝的pi多肽，其以與ct3多 肽的1:1複合體形式存在。pl多肽在其N-末端^皮豆蔻醯化(myristolated)， 隨後豆蔻醯化(mynstolated)的N-末端42個殘基被切除，形成C-末端片段 OIC)。此外或選擇性地，另外的突變可減少或實質上消除人2多肽的表達 或導致功能性X2多肽不存在，和/或另外的突變可減少或實質上消除dl多 肽的表達或導致功能性al多肽不存在。X2多肽由L2基因編碼，牽涉在粒 子組裝中，並展示鳥苷酸轉移酶和甲基轉移酶活性。crl多肽由S1基因編 碼，牽涉在細胞附著中並作為病毒血凝素。
使用可購得的標準核酸方法可從呼腸孤病毒粒子分離核酸。還參見例 3口, Schiff等人，"Orthoreoviruses and Their Replication(正呼腸孑瓜病毒和其 複製)，"第52章，f7e/血Mra/ogy(費氏病毒學)，Knipe & Howley編輯，2006, Lippincott Williams & Wilkins。本文所用的分離的核酸是指與通常伴隨它們 的其它核酸分開的核酸。因此，分離的核酸包括但不限於基本上沒有非-呼腸孤病毒(如宿主細胞)核酸的呼腸孤病毒核酸，或基本上沒有對應其它 基因組區段的核酸的呼腸孤病毒基因組區段。此外，分離的核酸可包括工 程化核酸諸如重組或合成核酸。
可使用本領域已知方法通過重構含有影響cj3多肽的至少第一突變的 基因組區段來產生感染性亞病毒粒子(ISVP;如遺傳改造的ISVP)而產生如本文所述的突變的呼腸孤病毒。參見例如，Schiff等人，"Orthoreoviruses and Their Replication(正呼腸孤病毒和其複製),，，第52章，F/e/必Wra/ogy(費氏病 毒學)，Knipe & Howley編輯，2006, Lippincott Williams & Wilkins; Smith等 人，1969,〖々ra/ogv, 39(4):791-810;和美國專利第7,1S6，542; 750495〗27; 6,808,916和6,528,305號。還可使用基於質粒的反向遺傳學系統通過表達 呼腸孤病毒基因組區段來產生ISVP而產生突變的呼腸孤病毒。參見例如， Kobayashi等人，2007, Ce〃 //oW cfe M/craZ)e, 1:147-57 。本文所用的遺傳改造 的或突變的ISVP是突變的呼腸孤病毒並指從攜帶影響至少cj3多肽的遺傳 改造的或自發產生的突變的呼腸孤病毒產生的ISVP。本文所述的ISVP是 穩定的並可以ISVP繁殖用於多次(如多於一次，如，2、 3、 4、 5、 10、 20、 50或更多)傳代。
經由遺傳改造的ISVP或經由基於質粒的反向遺傳學系統產生的本文 所述的突變的呼腸孤病毒可培養在例如人類瘤細胞或L929小鼠成纖維細 胞。本文公開的突變的呼腸孤病毒可培養在僅允許缺乏a3多肽的呼腸孤 病毒毒林的細胞中。使用這種細胞系來傳代本文所述的突變的呼腸孤病毒
使用標準方法可純化突變的呼腸孤病毒。參見例如，Schiff等人, "Orthoreoviruses and Their R印lication(正呼腸孤病毒和其複製),"第52章, F,'e/A F/ra/ogy (費氏病毒學)，Knipe & Howley編輯，2006, Lippincott Williams Smkh等人，1969, Mra/ogy, 39(4):791-810;和美國專利 第7,186,542; 7,049，127; 6,808,916和6,528,305號。可以例如針對。3多 肽的抗體使用親和色譜來除去含有g3多肽的呼腸孤病毒並允許缺乏cj3多 肽的突變體流過。本文所用的純化的突變的呼腸孤病毒是指已經從天然伴 隨其的細胞組分分離的呼腸孤病毒。通常，當至少70%(如至少75%、 80%、 85%、 90%、 95%或99%)乾重的呼腸孤病毒不含天然伴隨該病毒的蛋白和 其它細胞組分時，認為呼腸孤病毒是純化的。
本文所述的突變的呼腸孤病毒如與非突變的呼腸3瓜病毒(如，對照呼腸 孤病毒)相比展示增加的感染性和/或減少的免疫原性，並可根據這種性狀 來選擇。增加的感染性可由以下證實與表達功能性cj3多肽的呼腸孤病毒(如，完整病毒體；如，野生型呼腸孤病毒)相比，突變的呼腸孤病毒感 染的瘤細胞範圍增加和/或感染的細胞數目增加。突變的呼腸^^病毒的減少 的免疫原性可由這種突變的呼腸孤病毒不能在受治療者中引起顯著的免 疫應答而證實。本文所述的突變的呼腸孤病毒還可才艮據其它期望性狀篩選
和選擇，所述性狀包括但不限於複製速率更快；包裝速率更快；誘導凋 亡的能力；實現溶解和有效殺死人類瘤細胞系的能力；釋放有效腫瘤表位 的能力；與標準化療的相互作用；和病毒後代數目增加。此外，突變的呼 腸孤病毒可根據溶解地感染瘤細胞(如，具有活性Ras途徑的哺乳動物細胞) 的能力來選擇。參見例如，美國專利第7,052,832號。
炎,弄l滲謬W^/V^呼廯遂^^ ^才法
如以前所述(參見例如，美國專利第6,110，461; 6,136,307; 6,261,555; 6,344,195; 6,576,234和6,811,775號)，呼腸孤病毒使用宿主細胞的Ras途 徑機制來下調雙鏈RNA-活化的蛋白激酶(PKR)並因此在細胞中複製。基於 這些發現，已經開發了使用呼腸孤病毒來治療哺乳動物增生性病症的方 法，哺乳動物諸如小鼠、犬、貓、綿羊、山羊、牛、馬、豬、非-人類靈長 類和人類。本文所述的突變的呼腸孤病毒可用於治療受治療者的增生性病 症。
增生性病症是任何細胞病症，其中細胞增殖比正常組織生長更快。因 此增殖細胞是比正常細胞增殖更快的細胞。增生性病症包括^旦不限於瘤， 也稱為腫瘤。瘤可包括但不限於胰腺癌、乳腺癌、腦癌(如成膠質細胞瘤)、 肺癌、前列腺癌、結腸直腸癌、曱狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、肝癌、神經 纖維瘤病1和白血病。瘤可為實體瘤(如肉瘤或癌瘤)或影響造血系統的癌 性生長(如淋巴瘤或白血病)。其它增生性病症包括但不限於神經纖維瘤病。
通常，在呼腸孤病毒用作療法的增生性病症中，至少一些增殖細胞可 具有突變，其中Ras基因(或Ras信號轉導途徑的元件)被直接地(如通過活 化Ras中的突變)或間接地(如通過活化Ras途徑中的上遊或下遊元件)活 化。活化Ras途徑中的上遊元件包括，例如藉由表皮生長因子受體(EGFR) 或Sos的轉化。參見例如，Wiessmuller & W他mghofer, 1994, CW/"/"r S,g"a/,"g, 6(3):247匿267;和Barbacid, 1987,4朋.Wev.說oc/^肌，56, 779-827。活化Ras途徑中的下遊元件包括，例如B-Raf內的突變。參見例如，Brose 等人(2002, C朋cerPe&, 62:6997-7000)。此外，呼腸孤病毒可用於治療PKR 突變或失調引起的增生性病症。參見例如，Strong等人(1998, 17:3351-62)。
本文所述的突變的呼腸孤病毒可施用於患有增生性病症的哺乳動物。 本文所用的施用是指遞送突變的呼腸孤病毒(如，ISVP)以使突變的呼腸孤 病毒接觸增殖細胞。施用突變的呼腸孤病毒的途逕取決於病症類型和增殖 細胞的位置。可釆用多種施用途徑，並且以下僅通過示例方式提供而不意 為以任何方式限制。
對於實體瘤，例如，可通過包括向腫瘤直接注射或通過注射、輸注或 類似方式系統施用(如靜脈內)的方法施用突變的呼腸孤病毒。對於造血的 瘤，例如，可靜脈內或血管內施用突變的呼腸孤病毒。例如，對於轉移瘤 或瘤諸如腦瘤，突變的呼腸孤病毒可經由使其系統轉運過身體的方式施用 (如鞘內、靜脈內或肌內)。突變的呼腸孤病毒還可皮下地、腹膜內地(如對 於卵巢瘤)、局部地(如對於黑素瘤)、口地(如對於口瘤或食管瘤)、直腸地(如 對於結腸直腸瘤)、陰道地(如對於子宮頸或陰道瘤)、鼻地或通過吸入噴霧 劑(如對於肺瘤)施用。可由多於一種途徑施用突變的呼腸孤病毒和/或施用 突變的呼腸孤病毒到受治療者中多於一處位置。
如本文公開的突變的呼腸孤病毒以足以治療增生性病症的量施用(如， 有效量)。當向增殖細胞施用突變的呼腸孤病毒實現細胞溶解(如溶瘤作 用)、導致增殖細胞數目減少、瘤大小減小、和/或增生性病症相關的症狀(如 疼痛)減少或消除時，認為治療了該增生性病症。本文所用的術語溶瘤作用 是指溶解至少10。/。的增殖細胞(如溶解至少約20%、 30%、 40%、 50%或75% 的細胞)。可確定溶解百分比，例如，通過測量哺乳動物中瘤大小的減小或 增殖細胞數目的減少，或通過體外測量溶解的細胞的量(如根據增殖細胞的 活組織檢查)。
將在個體基礎上確定突變的呼腸孤病毒的有效量，並且可以至少部分 地基於所用的具體突變的呼腸孤病毒；個體的尺寸、年齡、性別；和增殖 細胞的大小和其它特徵。例如，對於治療人類，可使用大約103至1012個蝕斑形成單位(PFU)的突變的呼腸孤病毒，這取決於增殖細胞或存在的瘤
的類型、大小和數目。例如，有效量可為從約1.0 PFU/kg體重至約1015 PFU/kg體重(如從約102 PFU/kg體重至約10" PFU/kg體重)。可以單劑量 或多劑量(如二、三、四、六或更多劑量)施用突變的呼腸孤病毒。可同時 或連續地(如經過數天或數周時間)施用多劑量。突變的呼腸孤病毒的治療 可持續數天至數月，或直到實現減少疾病。
預期如本文公開的突變的呼腸孤病毒可聯合手術或除去增殖細胞(如 瘤)施用。還預期突變的呼腸孤病毒可聯合放療施用或除放療以外施用。進 一步預期突變的呼腸孤病毒可聯合抗癌化合物、化療劑和/或免疫抑制劑施 用或除抗癌化合物、化療劑和/或免疫抑制劑以外施用。這種劑包括但不限 於5-氟尿嘧啶、絲裂黴素C、甲氨蝶呤、羥基脲、吉西他濱、環磷醯胺、 達卡巴口秦、米託蒽醌、蒽環類(如，表柔比星和多柔比星(doxurubicin));微 管蛋白穩定劑(如，長春花生物鹼)、針對受體的抗體諸如HERCEPTIN (赫 賽汀⑧)(Genentech, South San Francisco, CA)、依4乇泊普禾口 pregnasome、 ^白 化合物諸如碳鉑和順鉑、紫杉烷類諸如TAXOL (紫杉醇⑧)(Bristol-Myers Sqmbb， New York， NY)和TAXOTERE (多西紫杉醇⑧)(Rhone-Poulenc Rorer SA, Antony, France)、激素治療劑諸如他莫昔芬和抗雌激素、千擾素、 芳香酶抑制劑、促孕劑和LHRH類似物。還預期如本文公開的突變的呼腸 孤病毒可聯合血管滲透劑施用或除血管滲透劑以外施用，血管滲透劑諸如 但不限於IL-2、 TNF-a、 VEGF、 AVASTIN (Genenteeh)和鬆弛素。
秀參i 合參
提供包括如本文所述的突變的呼腸孤病毒的藥物組合物。參見例如，
美國專利第6,576，234號。除了 一種或多種突變的呼腸孤病毒，藥物組合 物通常包括藥學上可接受的載體。藥學上可接受的載體可以是作為突變的 呼腸孤病毒的運載體、載體或介質的固態、半固態或液態材料。因此，含 有突變的呼腸孤病毒的組合物可為以下形式片劑、丸劑、粉末劑、錠劑、 嚢劑、扁嚢劑、酏劑、懸浮劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑、氣溶膠(作為固體 或在液態介質中)、含有例如達10。/。的重量的活性化合物的軟膏劑、軟和硬 明膠膠嚢、栓劑、無菌注射溶液和無菌包裝粉末。適合載體的一些實例包括磷酸鹽緩衝鹽水或另一種生理上可接受的 緩沖劑、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯膠、磷酸 鈣、藻酸鹽、黃芪膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖 維素、無菌水、糖漿和曱基纖維素。藥物組合物另外可包括但不限於，潤
滑劑諸如滑石、硬脂酸鎂和礦物油；潤溼劑；乳化劑和懸浮劑；防腐劑諸 如苯曱酸曱酯和苯曱酸丙基羥基酯；甜味劑和調味劑。藥物組合物可配製 為在通過採用本領域已知程序施用後，提供突變的呼腸孤病毒的快速、持 續或延遲的釋放。除了下述的代表性製劑，用於藥物組合物的其它適合制 齊寸可見於7 ew/wgtow, T72e Sc/ewce 屍ra"/ce qf屍/zfi^77 acj(雷氏藥學5裡i侖禾口 實踐)(2003, Gennaro & Gennaro編輯，Lippincott Williams & Wilkens)。
對於製備固態組合物諸如片劑，可將突變的呼腸孤病毒與藥物載體混 合以形成固態組合物。任選地，片劑或丸劑可^皮包衣或以其它方式複合以 提供給予延長作用的益處的劑型。例如，片劑或丸劑可包括內劑量組分和 外劑量組分，後者為包封前者的形式。這兩種組分可被腸衣層分開，腸衣 層用於抵抗胃中的崩解並允許內組分完整地進入十二指腸或延遲釋放。多 種材料可用於這種腸衣層或包衣，這種材料包括多種聚合物酸(polymeric acid)和聚合物酸與諸如蟲膠、十六醇和醋酸纖維素等材料的混合物。
用於口服施用或用於注射的包括突變的呼腸孤病毒的液態製劑通常 包括水性溶液、適當調味的糖漿劑、水性或油性懸浮液和帶有可食用油諸 如玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油的調味乳劑、以及酏劑和類 似藥物運載體。
用於吸入或吹入的組合物包括藥學上可接受的水性溶劑或有機溶劑 或其混合物中的溶液和懸浮液，和粉末。這些液態或固態組合物可包含如 本文所述的合適的藥學上可接受的賦形劑。為了區域或系統作用，這種組 合物可通過口或鼻呼吸途徑施用。藥學上可接受的溶劑中的組合物可通過 使用惰性氣體霧化。可直接從霧化裝置吸入霧化溶液，或者所述霧化裝置 可與面罩幕(face mask tent)或間歇性正壓呼吸機連接。可從以合適方式 遞送製劑的裝置口地或鼻地施用溶液、懸浮液或粉末組合物。
可用於本公開方法的另一種製劑採用經皮遞送裝置(如貼片)。這種經皮貼片可用於提供連續或不連續的如本文所述的突變的呼腸孤病毒的輸 入。用於遞送藥物劑的經皮貼片的構造和使用是本領域公知的。參見例如，
美國專利第5,023,252號。這種貼片可構造為連續、脈動性或按需地遞送 突變的呼腸孤病毒。
如果需要，可將突變的呼腸孤病毒包^^在脂質體或膠束中以減少或防 止在對呼腸孤病毒有建成的免疫的哺乳動物中的免疫應答。這種組合物稱 為免疫保護的呼腸孤病毒。參見例如，美國專利第6,565,831和7,014,847 號。此外，本文所^Hf的突變的呼腸孤病毒(如，缺乏o3多肽或cj3多肽缺 陷或cj3多肽功能缺陷的突變的呼腸孤病毒)可^_酶蛋白水解地處理以除去 或部分地除去存在的任何其它外衣殼蛋白。
突變的呼腸孤病毒或包含這種突變的呼腸孤病毒的藥物組合物可包 裝到藥盒中。預期藥盒還可包含一種或多種化療劑、 一種或多種免疫抑制 劑和/或一種或多種抗-抗呼腸孤病毒抗體。藥物組合物可配製為單位劑型。 術語"單位劑型"是指適合作為用於人類受治療者和其它哺乳動物的單一 劑量的物理上離散的單位，各單位含有預先確定量的突變的呼腸孤病毒連 同適合的藥學上可接受的載體，該量是計算以產生期望治療效果的量。
根據本公開，可釆用本領域技術人員能力範圍內的常規分子生物學、 微生物學、生物化學和重組DNA技術。這種技術在文獻中充分闡釋。在 以下實施例進一步描述本發明的方法和組合物，以下實施例不限制本發明 範圍，本發明範圍描述於權利要求書。
實施例
實施例1 -產生突變的呼腸孤病毒
產生在組成型或誘導型啟動子控制下表達S4基因突變形式的構建體， 以便轉錄正鏈RNA。在一個實例中，翻譯S4基因的起始密碼子通過缺失、 插入或取代而突變。隨後以該構建體轉化易感染呼腸孤病毒的細胞系。
以呼腸孤病毒感染轉化的細胞系，且如果需要的話誘導S4基因的表 達。含有該突變的正鏈S4 RNA是病毒RNA-依賴性RNA聚合酶的底物，該酶產生^^皮包裝但非功能性的雙鏈突變的S4 RNA，至少關於將編碼的(i3多肽結合入衣殼是非功能性的。
來自轉化細胞的後代病毒包括表達cj3多肽的野生型呼腸孤病毒以及不表達cr3多肽的突變的呼腸孤病毒。不表達o3多肽的突變的呼腸孤病毒偶爾被稱為棵的呼腸孤病毒。
例如，用已證實在脫被步驟中阻滯的細胞系使用蝕斑滴定檢測選擇棵病毒。在這種細胞系中，野生型病毒不能有效複製。選擇和擴增最大的蝕斑。可選擇地，以針對a3多肽的抗體使用親和色譜將野生型呼腸孤病毒純化出來。a3多肽的存在或不存在通過蛋白印跡法和/或免疫沉澱法確定。
應理解的是，儘管已經結合其詳細的說明書描述了材料和方法，但是如上的說明書意為闡釋而不是限制材料和方法的範圍，材料和方法的範圍由所附權利要求書的範圍限定。其它方面、益處和修飾在如下權利要求書的範圍內。
公開了這樣的方法和組合物——其可用於公開的方法和組合物，可聯合公開的方法和組合物使用，可用於製備公開的組合物，或是公開的方法和組合物的產物。本文公開了這些和其它材料，應理解公開了這些方法和組合物的組合、子集、相互作用、組等。即，儘管可能沒有明確地公開所具體提到的這些組合物和方法的每一種不同的個體和集合的組合和排列，但是本文具體地預期和描述了每一個。例如，如果公開和討論了呼腸孤病毒的具體突變或具體方法，且討論了可對呼腸孤病毒進行的多種突變或可對方法進行的多種修飾，那麼除非明確地另外指出，否則明確地包含呼腸孤病毒和方法的每種和所有組合和排列。類似地，還明確地包含和7>開這些的任何子集或組合。
權利要求
1.一種突變的呼腸孤病毒，其中所述突變的呼腸孤病毒包含第一突變，其中所述第一突變減少σ3多肽表達、實質上消除σ3多肽表達、或導致功能性σ3多肽不存在。
2. 根據權利要求1所述的突變的呼腸孤病毒，其中所述第一突變在編碼所述(j3多肽的核酸中或在調節所述cj3多肽表達的核酸中。
3. 根據權利要求2所述的突變的呼腸孤病毒，其中所述核酸是S4基因。
4. 根據權利要求1所述的突變的呼腸孤病毒，其中所述笫一突變是遺傳改造的取代。
5. 根據權利要求1所述的突變的呼腸孤病毒，其中所述第一突變是遺傳改造的插入或缺失一個或多個核苦酸。
6. 根據權利要求1所述的突變的呼腸孤病毒，其進一步包含一種或多種另外的突變。
7. 根據權利要求6所述的突變的呼腸孤病毒，其中所述另外的突變選自以下組成的組減少pi多肽表達、實質上消除pl多肽表達、或導致功能性pl多肽不存在的突變；減少X2多肽表達、實質上消除X2多肽表達、或導致功能性X2多肽不存在的突變；和/或減少g1多肽表達、實質上消除ol多肽表達、或導致功能性cjl多肽不存在的突變。
8. 根據權利要求1所述的突變的呼腸孤病毒，其中所述第一突變減少所述cj3多肽的表達的至少30%。
9. 一種遺傳改造的呼腸孤病毒感染性亞病毒粒子(ISVP)。
10. 根據權利要求9所述的呼腸孤病毒ISVP，其中所述呼腸孤病毒ISVP被遺傳改造以展示o3多肽表達減少、以缺乏a3多肽表達、或以表 達非功能性o3多肽。
11. 根據權利要求10所述的呼腸孤病毒ISVP，其中所述呼腸孤病毒IS VP #皮遺傳改造以包含笫 一 突變。
12. 根據權利要求11所述的呼腸孤病毒ISVP，其中所述第一突變在編碼所述a3多肽的核酸中或在調節所述cj3多肽表達的核酸中。
13. 根據權利要求12所述的呼腸孤病毒ISVP，其中所述核酸是S4基因。
14. 根據權利要求11所述的呼腸孤病毒ISVP，其中所述第一突變是取代。
15. 根據權利要求11所述的呼腸孤病毒ISVP,其中所述第一突變是插入或缺失一個或多個核苷酸。
16. 根據權利要求11所述的呼腸孤病毒ISVP，其進一步包含一種或多種另外的突變。
17. 根據權利要求16所述的呼腸孤病毒ISVP,其中所述另外的突變選自以下糹且成的糹且減少pl多肽表達、實質上消除pl多肽表達、或導致功能性pl多肽不存在的突變；減少多肽表達、實質上消除人2多肽表達、或導致功能性多肽不存在的突變；和/或減少cj1多肽表達、實質上消除crl多肽表達、或導致功能性al多肽不存在的突變。
18. 根據權利要求10所述的呼腸孤病毒ISVP，其中所述多肽的表達淨皮減少至少30%。
19. 一種製備具有增加的感染性的呼腸孤病毒的方法，其包括突變第一呼腸孤病毒以產生突變的呼腸孤病毒，其中所述突變的呼腸孤病毒展示cj3多肽表達減少、缺乏cj3多肽表達、或表達非功能性a3多肽，和分離所述突變的呼腸孤病毒，其中所述突變的呼腸孤病毒與所述第一呼腸孤病毒相比具有增加的感染性。
20. 根據權利要求19所述的方法，其中所述增加的感染性由以下證實與所述第一呼腸孤病毒相比所述突變的呼腸孤病毒可感染的瘤細胞範圍增加、或與所迷第一呼腸孤病毒相比所述突變的呼腸孤病毒感染的細胞數目增加。
21. —種獲得遺傳改造的呼腸孤病毒感染性亞病毒粒子(ISVP)的方法，其包括遺傳改造第一呼腸孤病毒以展示o3多肽表達減少、以缺乏cj3多肽表達、或以表達非功能性a3多肽；培養所述遺傳改造的呼腸孤病毒，和分離ISVP從而獲得遺傳改造的呼腸孤病毒ISVP。
22. —種治療受治療者的增生性病症的方法，其包括向所述受治療者施用權利要求1所述的突變的呼腸孤病毒或權利要求9所述的遺傳改造的呼腸孤病毒ISVP。
23. 根據權利要求22所述的方法，其進一步包括至少一種選自手術、化療、^:療和免疫抑制療法所組成的組的程序。
24. —種藥物組合物，其包含權利要求1所述的突變的呼腸孤病毒或權利要求9所述的遺傳改造的呼腸孤病毒ISVP。
25. 根據權利要求24所述的藥物組合物，其進一步包含一種或多種化療劑和/或一種或多種免疫抑制劑。
26. —種包含突變的a3多肽，其中所述突變產生不結合入病毒衣殼的ct3多肽或以減少的水平結合入所述衣殼的(j3多肽。
全文摘要
本發明提供突變的呼腸孤病毒和遺傳改造的ISVP。具體地，本發明提供缺乏σ3多肽表達或展示σ3多肽表達減少或缺乏功能性σ3多肽的突變的呼腸孤病毒。其中所描述的突變的呼腸孤病毒可用於產生和穩定地繁殖ISVP。還提供了包含突變的呼腸孤病毒的組合物以及使用這種突變的呼腸孤病毒的方法。
文檔編號A61P35/00GK101679953SQ200880016669
公開日2010年3月24日 申請日期2008年5月21日 優先權日2007年5月21日
發明者B·G·湯普森, M·C·科菲 申請人:昂科利蒂克斯生物科技公司