非自動失活的定位表達的逆轉錄病毒載體的製作方法
2023-06-10 14:06:26 3
專利名稱：非自動失活的定位表達的逆轉錄病毒載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及逆轉錄病毒載體，該逆轉錄病毒載體包括能進行啟動子轉變的載體(ProCon載體)。該載體系統能被用作定位基因治療的基因轉移載體。
將逆轉錄病毒載體用於基因治療業已得到許多關注，而且，目前已成為在美國和歐洲得到批准的多種方案中可選的轉移治療基因的方法(Kotani等，1994)。然而，上述方案大多要求在體外用帶有治療基因的逆轉錄病毒載體轉染靶細胞，隨後再把感染成功的細胞送回損傷了的個體內(Rosenberg等，1992；關於綜述，參見Anderson，1992)。這種來自體內的基因的治療方案適於治療醫學疾病，其中，所述靶細胞群易被分離(例如淋巴細胞)。另外，這種來自體內的靶細胞的感染使得可以給藥大量的濃縮了的病毒，而且該病毒在使用之前可作嚴格的安全試驗。
遺憾的是，僅有一部分可用於基因治療的靶細胞易被分離、培養，然後再被導入。此外，來自體內的基因的治療所需的複雜技術及相應的高花費，事實上妨礙了其在世界範圍內的廣泛應用。未來的簡便省錢的基因治療將要求一種體內途徑，在該途徑中，以注射病毒載體或產生病毒載體的細胞或簡單植入能產生逆轉錄病毒的細胞的形式直接對患者給藥。
當然，這種體內途徑會引起種種新問題。首先而且最重要的是，必須強調考慮到安全性。由於植入了能產生病毒的細胞而可能產生病毒，而且沒有機會預先檢驗所產生的病毒。明白有關使用該系統所會遇到的一定危險，以及爭取生產出能減少這種危險的新系統是重要的。
逆轉錄病毒載體系統由兩個部分組成(
圖1)1)該逆轉錄病毒載體本身是一種被修飾了的逆轉錄病毒(載體質粒)，其中，編碼病毒蛋白的基因已被有待轉移到靶細胞裡的治療基因和標記基因所取代。由於編碼病毒蛋白的基因被取代有效地破壞了該病毒，必需由該系統中的第二個部分對其進行拯救，該部分能提供上述被修飾了的逆轉錄病毒所缺少的病毒蛋白。
所述第二個部分是
2)能產生大量病毒蛋白，但缺乏產生可複製病毒能力的細胞系。該細胞系被稱為包裝細胞系，它由被另一種質粒轉染的細胞系組成，該質粒帶有使所述被修飾了的逆轉錄病毒載體能被包裝的基因。
為了產生所述包裝了的載體，將該載體質粒轉染到所述包裝細胞系中，在這些條件下，所述被修飾了的逆轉錄基因組(包括插入的治療基因和標記基因)由所述載體質粒轉錄，並被包裝到被修飾了的逆轉錄病毒顆粒(重組病毒顆粒)中。然後，用這種重組病毒感染靶細胞，在此過程中，載體基因組和所攜帶的任何標記或治療基因被整合到該靶細胞的DNA中。由這種重組病毒顆粒感染的細胞不能產生新的載體病毒，因為在這樣的細胞中沒有病毒蛋白。然而，帶有治療及標記基因的載體DNA被整合到細胞DNA上，並可以在被感染的細胞中表達。
由於原病毒形式的逆轉錄病毒基因組實際上是以隨機形式整合到受感染細胞的基因組中(Varmus，1988)，根據其插入激活可以鑑定若干細胞原癌基因(Varmus，1988；Van Lohuizen和Berns，1990)。由於類似機理可能會導致接受帶有被用於治療其它已存在的醫學疾病的治療基因的逆轉錄載體治療的患者長癌，已產生一再發生的倫理問題。大多數研究人員會同意，複製缺陷逆轉錄病毒載體，例如複製所有目前使用的整合至或靠近與有關控制細胞增殖的細胞基因的載體的可能性小到趨近於零。不過，通常還是承認，由單一的感染事件所引發的可複製逆轉錄病毒的極為迅速地發展會最終產生，足以使得這種表型整合變成極為真實的可能的整合事件。
對逆轉錄病毒系統進行優化，以減少出現可複製病毒的機會。不過，已有許多文獻證明，所述逆轉錄病毒載體系統的組份之間的重組，會導致潛在致病性可複製病毒的產生，業已構建了若干代載體系統，以減少這種重組的危險(見Salmons和Günzburg的綜述，1993)。
從安全角度和純實踐角度來看，在考慮採用體內基因治療時的另一個考慮因素是逆轉錄病毒載體的定位。很清楚，由載體所攜帶的治療基因不應該在所有組織和細胞中不加選擇地表達，而只能在要求的靶細胞中表達。如果待轉移的基因是用於切除特定腫瘤細胞的毒素基因的話，這一點尤為重要。很顯然，切除其它非靶細胞是很不合在此之前，業已披露了若干會使所攜帶的治療基因定位的逆轉錄病毒載體系統(Salmons和Gunzburg，1993)。這些方法中的大部分涉及將感染行為局限於預定細胞類型，或是用異源啟動子指導轉入特定類型細胞中的連鎖的治療基因或標記基因的表達。所用的異源啟動子應當只能在這種類型的細胞中啟動連鎖基因的表達這種啟動子在所述細胞中是有正常活性的。所述啟動子已早先同標記基因或治療基因一起被插入到所述逆轉錄病毒載體上的gag、pol或env基因位點上。
在所述基因旁側的逆轉錄病毒長末端重複序列(LTR)帶有逆轉錄病毒啟動子，該啟動子通常是非特異性的，它可以啟動在許多不同類型細胞中的表達(Majors，1990)。有人報導過LTR啟動子與異源內部啟動子如在上文中所述的組織專一性啟動子之間的啟動子幹擾。另外，業已知道逆轉錄病毒LTRs具有強增強子，它們可以獨立地或是與逆轉錄病毒啟動子一起幹擾靠近該逆轉錄病毒的整合位點的細胞基因的表達。其機理已被證實為是因動物的致癌性所致(Van Lohuizen和Berns)。以上兩個發現促進了自動失活載體(SIN)的發展，其中，逆轉錄病毒啟動子在靶細胞內是功能性失活的(PCT/WO94/29437)。對所述載體的進一步修飾包括將啟動子基因盒插入LTR片段，以產生雙拷貝載體(PCT/WO89/11539)。不過，在這兩種載體中，插入到載體主體上的或插入到LTR片段上的異源啟動子直接同標記/治療基因連接。
上文提及的早先所披露的帶有缺失的3′LTR的SIN載體(PCT/WO94/29437)還使用了一個強異源啟動子，如巨細胞病毒(CMV)啟動子，由它代替逆轉錄病毒5′LTR啟動子(無U3 5′LTR)啟動所述載體結構在包裝細胞系中的表達。在3′LTR中還有一個異源聚腺苷酸化信號(PCT/WO94/29437)。
本發明的目的是要構建一個新的逆轉錄病毒載體，可將其用作定位基因治療的安全的基因轉移載體，它與包裝結構發生重組的可能性較少。這種新載體在3′LTR上帶有異源啟動子和/或調節因子，在感染之後，該啟動子和/或調節因子被複製並易位至靶細胞的5′LTR，最終控制標記/治療基因的表達，這些基因並不直接同啟動子連接，而是插入載體的主體上。這種載體不能進行自動失活，而能進行啟動子交換，給啟動子轉變(Promoter Conversion)取名為Procon。
由於啟動子轉變不會導致自動失活，因此，逆轉錄病毒載體在靶細胞內具有轉錄活性。不過，兩個LTRs會在靶細胞內構成一個大的異源啟動子/增強子序列。這樣可以減少整合在靶細胞中的載體經過較長時間後發生失活的可能性，這種失活與已報導過常規載體的失活現象(Xu等，1989)相同；還可以減少與內源逆轉錄病毒序列發生重組的可能性，而這種重組會產生潛在的致病性可複製病毒，因而提高了該系統的安全性。
在本發明中，未對逆轉錄病毒載體結構的5′LTR進行修飾，該病毒載體在包裝細胞中的表達由正常的逆轉錄病毒U3啟動子啟動。可以進行正常的逆轉錄病毒聚腺苷酸化，而且在3′LTR中沒有異源聚腺苷酸化信號。這對於體內基因治療方法的改進來說是重要的，因為儘管包裝細胞在產生重組病毒，但是通過正常病毒啟動子進行的正常生理調節，而且還可能涉及聚腺苷酸化的正常的病毒控制在很長時間內都在體內佔據優勢。
預計，對這種新逆轉錄病毒的進一步修飾包括細胞的序列，而不是異源啟動子和/或調節因子。這使得與細胞的序列的位點專一性重組有更高的選擇性，以便將逆轉錄病毒載體定向整合到縮主細胞基因組的特定位點(Saller，1994)。
為了實現上述及其它目的，本發明提供了一種能進行啟動子轉變的逆轉錄病毒載體，它包括結構U3-R-U5的5′LTR片段；一個或幾個選自編碼和非編碼序列的序列；一個或多個選自編碼和非編碼序列的序列以及一個3′LTR片段，它包括完全或部分缺失的U3片段，其中，所述缺失的U3片段被一個多接頭序列所取代，隨後是R和U5片段。
所述多接頭序列帶有至少一個特有的限制位點，並且優選帶有至少一個插入的異源DNA片段。所述異源DNA片段優選是選擇的調節因子和啟動子，其表達優選是靶細胞專一性的，但也可能是沒有調節功能的DNA片段。
所述異源DNA片段優選與一個或幾個細胞序列同源。所述調節因子和啟動子優選可由反式作用分子調節。
通過下面對本發明優選實施方案的說明，可以理解本發明的其它目的、特徵和優點。
所述靶細胞專一性調節因子和啟動子選自下列因子中的一個或幾個乳清酸性蛋白(WAP)，小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、β-乳球蛋白和酪蛋白專一性調節因子和啟動子，胰腺專一性調節因子和啟動子(包括碳酸酐酶11和β-葡糖激酶調節因子和啟動子)，淋巴細胞專一性調節因子和啟動子，(包括免疫球蛋白和MMTV淋巴細胞專一性調節因子和啟動子)，以及MMTV專一性調節因子和啟動子，MMTV專一性調節因子和啟動子能賦予糖皮質激素反應性或指導在乳腺中的表達。所述調節因子和啟動子優選調節所述逆轉錄病毒載體的至少一個編碼序列的表達。所述LTR片段選自下列因子中的至少一個鼠白血病病毒(MLV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、鼠肉瘤病毒(MSV)、猴免疫缺損病毒(SIV)、人免疫缺損病毒(HIV)、人嗜T淋巴細胞病毒(HTLV)、豬免疫缺損病毒(FIV)、豬白血病病毒(FELV)、牛白血病病毒(BLV)和Mason-Pfizer-猴病毒(MPMV)。
所述逆轉錄病毒載體優選是基於BAG載體(Price等，1987)或LXSN載體(Miller和Rosman，1989)。
所述編碼序列優選是選自下列因子中的一個或幾個標記基因、治療基因、抗病毒基因、抗瘤基因和細胞因子基因。
所述標記和治療基因優選選自下列因子中的一個或幾個β-半乳糖苷酶基因、新黴素基因、單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶基因、嘌呤黴素基因、胞嘧啶脫氨酶基因、潮黴素基因、分泌鹼性磷酸酶基因、鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(gpt)基因、醇脫氫酶基因和次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)基因。
本發明另一個實施方案中設計改變或部分缺失至少一段逆轉錄病毒整合所需的逆轉錄病毒序列。
在本發明的另一個實施方案中，提供了一種逆轉錄病毒載體系統，它包括作為第一個部分的一個上述逆轉錄病毒載體，還包括一個包裝細胞系，該細胞系具有編碼待包裝的所述逆轉錄病毒載體所需的蛋白質的至少一種逆轉錄病毒結構或重組逆轉錄病毒結構。
所述包裝細胞系具有編碼這種逆轉錄病毒蛋白的逆轉錄病毒結構或重組逆轉錄病毒結構，這種蛋白不能由所述逆轉錄病毒載體編碼。所述包裝細胞系優選選自包括psi-2、psi-Crypt、psi-AM、GP+E-86、PA317和GP+envAM-12，或選自任何用重組結構超感染的使能表達來源於其它有包膜的病毒的表面蛋白的因子。
本發明的另一種實施方案涉及使用具有缺乏整合酶功能的重組逆轉錄病毒結構的包裝細胞系。
在把本發明的上述逆轉錄病毒載體引入逆轉錄病毒包裝細胞系並感染所述靶細胞之後，提供一種逆轉錄病毒的原病毒，其中，在被感染靶細胞的逆轉錄過程中，所述多接頭和插入所述3′LTR上的多接頭裡的任何序列都被複製，並在所得到的原病毒的3′LTR也在所得原病毒的5′LTR中出現。
本發明還包括本發明的逆轉錄病毒原病毒的mRNA以及根據本發明由逆轉錄病毒載體所產生的任何RNA。
本發明的另一個實施方案提供了用於通過體外和體內方式把同源和/或異源核苷酸序列導入人體或動物體內的非治療方法，包括用本發明的逆轉錄病毒載體轉染本發明逆轉錄病毒載體系統的包裝細胞系，並用由該包裝細胞系所產生的重組逆轉錄病毒感染靶細胞群。所述核苷酸序列選自下列因子中的一個或幾個編碼蛋白質的基因或該基因的一部分、調節序列和啟動子。
所述逆轉錄病毒載體、逆轉錄病毒載體系統和逆轉錄病毒原病毒及其RNA可用來生產用於包括人在內的動物基因治療的藥用組合物。另外，還可將其定向整合到同源細胞序列中。
本發明應用了典型的逆轉錄病毒啟動子轉變原理。
所述逆轉錄病毒基因組由一個具有結構R-U5-gag-pol-env-U3-R的RNA分子組成(圖2)。在逆轉錄過程中，該U5片段被複製並位於所產生的DNA分子的右手端，同時，U3片段也被複製並位於所產生的DNA分子的左手端(圖2)。所得到的結構U3-R-U5被稱為LTR(長末端重複序列)，因此它們是相同的並且是在該DNA結構或原病毒的兩端重複的(Varmus，1988)。原病毒左手端的U3片段具有啟動子(見下文)。該啟動子啟動一種RNA轉錄物的合成，該合成始於左側U3和R片段之間的邊界，終止於右側R和U5片段之間的邊界(圖2)。該RNA被包裝成逆轉錄病毒顆粒，並被轉移到待感染的靶細胞裡。在靶細胞中，該RNA基因組以上述方式再次進行反轉錄。
根據本發明，構建了一種逆轉錄病毒載體，其中，右側的U3片段被改變(圖3)，但保持了正常的左側U3結構(圖3)；利用位於左側U3片段裡的正常逆轉錄病毒啟動子，可將所述載體轉錄成RNA。不過，所產生的RNA將僅帶有改變了的右側U3結構。逆轉錄之後，在感染的靶細胞中所述改變了的U3結構位於逆轉錄病毒結構的兩端(圖3)。
如果改變了的片段帶有多接頭(見下文)而不是U3片段，可以輕易地插入任何啟動子，包括指導組織專一性表達的啟動子，如WAP啟動子(見下文)。這種啟動子局限於用在所述靶細胞中，用於表達由該逆轉錄病毒載體所攜帶的連鎖基因的表達。或者或除此之外，為了基因定向的目的，可用同源重組的方法將與一個或幾個細胞序列同源的DNA片段插入所述多接頭中(見下文)。
根據本發明，「多接頭」是指短的人工合成的DNA片段，該片段上帶有若干獨特的限制位點，使得任何啟動子或DNA片段都容易被插入。「異源的」一詞是指在自然界中正常情況下非密切毗連的DNA序列的任意組合。
基因表達由啟動子調節。缺乏啟動子功能時基因將不能夠表達。實際上，正常的MLV逆轉錄病毒啟動子是非選擇性的，即，它在大多數類型的細胞中都是有活性的(Majors，1990)。不過，若干現有啟動子僅能在極為特殊的細胞類型中表現出活性。理想的候選方案是將這種組織專一性啟動子用於調節逆轉錄病毒載體上的基因的表達是，和將治療基因限制在特定的靶細胞中表達。
在所述包裝細胞系中，所述逆轉錄病毒載體的表達是由U3片段上的正常的非選擇性逆轉錄病毒啟動子調節(圖3)。然而，一旦該載體進入所述靶細胞，就會發生啟動子轉變，而且，治療或標記基因，如b-半乳糖苷酶由選擇導入多接頭中的組織專一性啟動子啟動表達(圖3)。事實上，不僅可將任何組織專一性啟動子包括在該系統內，以便對多種不同的細胞類型進行選擇定向，此外，在發生轉變之後該逆轉錄病毒載體的結構和性質也不再與病毒類似。當然，從安全角度考慮，這具有極為重要的後果，因為普通的或現有的人工逆轉錄病毒載體易於同逆轉錄包裝結構和/或內源逆轉錄病毒發生遺傳重組，產生潛在地致病性的病毒。啟動子轉變(Procon)載體不同於逆轉錄病毒，因為轉變之後它不再帶有U3逆轉錄病毒啟動子，從而減少了遺傳重組的可能性。
所述逆轉錄病毒啟動子結構被攜帶於LTR的U3片段裡。LTRs上攜帶有使其能整合到靶細胞基因組上的信號。這種逆轉錄病毒原病毒的整合也可歸因於病原性變化(Van Lohuizen和Berns，1990)。在本發明的一個實施方案中，Procon載體可以攜帶修飾的LTRs，而不再攜帶整合所需的信號。這又會提高這種載體系統的潛在安全性。
基因定向按照本發明的另一方面，可將所述逆轉錄病毒載體用於定向整合到靶細胞中。與諸如腺病毒的其它病毒相比，將原病毒DNA形式的逆轉錄病毒基因組整合到靶細胞中是對將逆轉錄病毒用作載體的一個重大發展，因為它能讓轉移的基因長期穩定地表達。不過，這種整合的隨機性會對逆轉錄病毒載體的使用造成大的缺陷，因為它增加了細胞腫瘤抑制基因或原癌基因插入失活並從而誘發腫瘤的可能性(Van Lohuizen Berns，1990)。
業已將同源重組成功地用於把轉染或顯微注射的DNA定向整合特定的DNA位點上，並將其普遍用於構建「失效」轉基因小鼠或動物(參見Capecchi，1989的綜述；Bradley等，1992；Morrow和Kucherlapati，1993)。遺憾的是，藉助這種純物理方法的基因轉移效率極低。相反，由逆轉錄病毒介導的基因轉移十分有效，可機乎100％地感染細胞群。逆轉錄病毒基因轉移與同源重組相結合，可以構成一種理想的基因座定向整合系統。
我們已研究了將長的同源DNA片段引入逆轉錄病毒上的不同位點，以促進通過同源重組進行整合的可行性(Saller，1994)。對基因轉變和同源重組都進行了評價。用帶有單拷貝HSV-tk基因的細胞系作為靶細胞，我們能夠以高出以前由他人報導過的頻率15倍的頻率破壞靶序列(Ellis和Bernstein，1989)。重組的DNA片段的克隆證明了靶tK序列和逆轉錄病毒載體的存在(Saller，1994)。
為了進行定向整合，將與細胞的序列同源的DNA片段插入ProCon載體的多接頭上。在感染靶細胞及逆轉錄之後，這些序列將出現在該原病毒的5′末端。已證實末端同源性有利於與同基因細胞序列(Bradley，1991)的同源重組(Bradley，1991)。通過感染攜帶有突變形式的同源序列的靶細胞，可導致重組，並從而修復突變序列。或是僅有同源序列重組到細胞基因組裡，或是整個載體被插入(Saller，1994)。這種載體不僅可用於基因修復，還可用於指導帶有治療基因的逆轉錄病毒載體整合到所述基因組的特定基因座上，已知其不具有活性基因。這將導致上述插入激活或失活的可能性明顯減少，並從而有助於使用逆轉錄病毒載體的安全性。
下面的實施例將對本發明進行進一步說明。不過，這些實施例並非用於限定本發明的範圍，因為要對其做出明顯改進是顯而易見的，而且，對本領域的任何熟練技術人員來說，其它改進和替換也是顯而易見的。
用於實施例本發明的重組DNA方法為標準方法，為本領域熟練技術人員所熟知，並在以下文獻中有詳細記載，例如「分子克隆」(Molecular Cloning)(Sambrook等，1989)和「分子克隆實踐指南」(APractical Guide to MolecularCloning)(Perbal，1984)。
對下列實施例中涉及到的附圖的簡要說明如下圖1逆轉錄病毒載體系統圖2逆轉錄病毒基因組，逆轉錄圖3ProCon原理圖4PCR分析，MLV探針圖5PCR分析，MMTV探針圖6β-半乳糖苷酶在感染的NIH和EF43細胞中的表達圖7β-半乳糖苷酶在感染的來自妊娠的小鼠初生乳腺中的表達圖8在把病毒注射到妊娠的Balb/c小鼠的乳腺及皮膚之後β-半乳糖苷酶的表達圖9β-半乳糖苷酶在感染的乳腺瘤細胞中的表達圖10逆轉錄病毒載體通過同源重組進行的定向整合實施例1用帶有乳腺專一性啟動子的ProCon載體感染之後的乳腺專一性表達。
在被稱為BAG的鼠白血病病毒(MLV)逆轉錄載體上(Price等，1987)，β-半乳糖苷酶基因是由LTR的U3片段上的濫交(即非組織專一性)MLV啟動子啟動(圖3)。根據本發明，構建了一個BAG載體的衍生物，其中，位於3′LTR(圖3)上的MLV啟動子(U3)缺失並被一個多接頭所取代，所述多接頭有利於引入異源啟動子。在被導入包裝細胞系之後，所述缺少U3的BAG載體由5′LTR上的MLV啟動子(U3)啟動表達。在感染其靶細胞之後，由於在其生活周期中所發生的逆轉錄病毒基因組的重組，會使所述多接頭在上述逆轉錄病毒基因組的兩端被複製。因此，可以構建這樣的逆轉錄病毒載體，其中，可由任何插入多接頭中的異源啟動子來操縱BAG的β-半乳糖苷酶基因在靶細胞中的表達(圖3)。
根據上面所提出的原理，已將下述特殊啟動子插入多接頭片段或修飾的BAG載體小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動子的幾個亞片段，包括能賦予糖皮質激素反應性的片段和帶有一個指導乳腺表達的因子的片段。
乳清酸性蛋白(WAP)啟動子。該啟動子控制WAP的表達，使其僅在妊娠並泌乳的齧齒動物的乳腺中產生。
用所構建的MMTV和WAP逆轉錄病毒載體感染各種細胞的感染研究，已證實了插入多接頭的啟動子對β-半乳糖苷酶基因表達的控制。
為了產生逆轉錄病毒載體顆粒，已把攜帶有MMTV和WAP的ProCon載體轉染到包裝細胞系GP+E86裡(Markowitz等，1988)。通過新黴素抗性篩選(該抗性是由載體編碼)，獲得了能產生重組ProCon病毒的細胞的穩定群體及克隆。用含有病毒的該細胞群體的上清液感染小鼠乳腺細胞系EF43(Günzburg等，1988)及小鼠成纖維細胞系(Jainchill等，1969)。感染4天之後裂解靶細胞，並進行定量β-半乳糖苷酶分析，分析結果表明，由帶有WAP的ProCon載體感染的每一種細胞都沒有表達，而在由帶有MMTV的ProCon載體感染的兩種細胞中都能很好地表達(圖6)。這一結果與WAP啟動子的行為一致，該WAP啟動子僅能在孕晚期和泌乳期在體內起作用，而不能以EF43細胞為代表的在大多數單純的體外乳腺細胞培養體系中起作用。為了研究帶有WAP的ProCon載體是否在複雜的由初生乳腺衍生的細胞系培養系統中有活性，對獲自8-10天妊娠期小鼠(圖7)或乳腺瘤(圖9)的初生器官進行培養，並用轉染細胞系的同一穩定轉染群體的上清液感染。通過β-半乳糖苷酶活性證實，帶有WAP啟動子片段的Procon載體和帶有MMTV啟動子片段的Procon載體在該初生細胞(圖7)和乳腺瘤衍生細胞(圖9)中都有活性。
為了研究帶有WAP和MMTV的ProCon載體在體內是否有活性，以及β-半乳糖苷酶的表達是否局限於體內乳腺，將含有ProCon病毒的介質原位注射到妊娠期為8-10天的小鼠的乳腺或皮膚裡。5天後殺死小鼠，製備細胞提取物並進行β-半乳糖苷酶分析。帶有WAP片段的Procon載體和MTV片段的ProCon載體都只能在妊娠的乳腺中表達，而不能在皮膚裡表達(參見圖8中的M和S)。因此，在體內，兩個啟動子的調節因子把表達局限於乳腺，而在體外，WAP啟動子的調節因子保留其嚴格的組織專一性，但MMTV啟動子的調節因子則不然。
這種帶有組織專一性啟動子和調節因子的ProCon載體可用於指導治療基因在預定類型細胞、組織和器官中的表達。可用的治療基因包括具有抗HIV和抗腫瘤作用的蜂毒肽基因，和能引起細胞死亡的基因(包括胸腺嘧啶激酶基因、鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因和胞嘧啶脫氨酶基因，細胞色素P450基因，以及如SDI/WAF-1/CIP-1的與細胞周期調節有關的基因)。
實施例2證實由ProCon載體感染的細胞中的啟動子轉變，該載體原先就在3′LTR中攜帶有MMTV啟動子。
將帶有來自小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)的啟動子片段的ProCon載體轉染到一個包裝細胞系裡，並把所得到的重組載體顆粒用於感染所建立的人膀胱癌細胞系(EJ)。在含有新黴素類似物G418的培養基裡對感染的細胞克隆進行選擇(因為所用載體上帶有由內部SV40啟動子啟動的新黴素抗性基因)。用感染的克隆之一和未轉染的親代EJ細胞製備DNA，並用所製備的DNA進行聚合酶鏈式反應(PCR)。PCR反應是用兩個引物中的一個進行的，該引物專一性識別並結合MMTV序列(圖4和5中的A，B)或LTR的MLVR片段(圖4中的C)，與此同時有一個引物位於標記基因裡(圖4和5)。由於所述標記基因引物僅位於MMTV(或MLVR片段)序列的下遊，如果發生啟動子轉變，由MMTV引物所獲得的正PCR信號與標記基因引物一起指示這一變化。在圖4中，在同來自MLV序列的標記片段雜交之後顯示出採用引物A、B或C的PCR產物，證實了所有3種產物都來源於MLV序列。片段的大小可以證實已發生了啟動子轉變。圖5表示採用引物A和B並與MMTV特異探針雜交的PCR產物，再次證實已發生了啟動子轉變。
實施例3構建用於定向整合的ProCon載體可利用與上述實施例1中相同的BAG載體構建逆轉錄病毒載體，其中，可將與細胞序列同源的DNA序列插入到LTR中。所得到的載體可用於將插入到該載體的同源序列或該載體的全部或部分定向整合到宿主細胞基因組中的同源序列中。
按照以上提出的原理，已將單純皰疹病毒(HSV)的胸腺嘧啶激酶(tk)基因的片段插入到修飾的BAG載體的多接頭部分(tk突變體見圖10，Saller，1994)。
業已建立起一個細胞系，它沒有哺乳動物tk基因的功能性拷貝，而帶有HSV-tk基因的一個拷貝(Saller，1994)。已用帶有tk的BAG載體對該細胞系進行了感染，並篩選到了HSV-tk基因已被破壞的細胞(圖10)。
上述實施例說明了本發明所提供的載體發生啟動子轉變的原理和結果。
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權利要求
1.一種能進行啟動子轉變的逆轉錄病毒載體，該病毒載體包括結構U3-R-U5的一個5′LTR片段；一個或幾個選自編碼和非編碼序列的序列；以及一個包括全部或部分缺失的U3片段的3′LTR片段，其中，所述缺失的U3片段由多接頭序列取代，隨後是R和U5片段。
2.如權利要求1的逆轉錄病毒載體，該逆轉錄病毒載體包括結構U3-R-U5的一個5′LTR片段；一個或幾個選自編碼和非編碼序列的序列；以及一個包括全部或部分缺失的U3片段的3′LTR片段，其中，所述缺失的U3片段由多接頭序列取代，隨後是R和U5片段。
3.如權利要求1的逆轉錄病毒載體，其特徵在於所述多接頭序列帶有至少一個特異性的限制位點。
4.如權利要求3的逆轉錄病毒載體，其特徵在於所述多接頭序列帶有至少一個插入的異源DNA片段。
5.如權利要求4的逆轉錄病毒載體，其特徵在於所述異源DNA片段選自調節因子和啟動子中的一個或幾個。
6.如權利要求5的逆轉錄病毒載體，其特徵在於所述調節因子和啟動子的表達是靶細胞專一性的。
7.如權利要求6的逆轉錄病毒載體，其特徵在於所述靶細胞專一性的調節因子和啟動子選自下列組份中的一個或幾個WAP、MMTV、b-乳球蛋白和酪蛋白專一性調節因子和啟動子，胰腺專一性調節因子和啟動子(包括碳酸酐酶11和b-葡糖激酶調節因子和啟動子)，淋巴細胞專一性調節因子和啟動子(包括免疫球蛋白和MMTV淋巴細胞專一性調節因子和啟動子)，以及能賦予糖皮質激素反應性或指導乳腺表達的MMTV專一性調節因子和啟動子。
8.如權利要求5-7中任一項的逆轉錄病毒載體，其特徵在於所述調節因子和啟動子調節所述逆轉錄病毒的至少一個編碼序列的表達。
9.如權利要求1-8中任一項的逆轉錄病毒載體，其特徵在於所述LTR片段選自下列組份的LTRs中的至少一個MLV、MMTV、MSV、SIV、HIV、HTLV、FIV、FelV、BLV和MPMV的LTRs。
10.如權利要求1-9中任一項的逆轉錄病毒載體，其特徵在於所述逆轉錄病毒載體是BAG載體。
11.如權利要求1-10中任一項的逆轉錄病毒載體，其特徵在於所述編碼序列選自下列組份中的一個或幾個標記基因，治療基因、抗病毒基因、抗腫瘤基因和細胞因子基因。
12.如權利要求11的逆轉錄病毒載體，其特徵在於所述標記或治療基因選自下列組份中的一個或幾個b-半乳糖苷酶基因和新黴素基因，單純皰疹病毒，胸腺嘧啶激酶基因，嘌呤黴素基因，胞嘧啶胞脫氨酶基因，潮黴素基因，分泌鹼性磷酸酶基因，鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(gpt)基因，醇脫氫酶基因和次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)基因。
13.如權利要求1-12中任一項的逆轉錄病毒載體，其特徵在於所述編碼逆轉錄病毒蛋白的編碼序列中的至少一個被改變或至少部分缺失。
14.如權利要求1-13中任一項的逆轉錄病毒載體，其特徵在於涉及逆轉錄病毒整合的逆轉錄病毒序列被改變或至少部分缺失。
15.如權利要求1-14中任一項的逆轉錄病毒載體，其特徵在於所述異源DNA片段與一個或幾個細胞序列或該序列的一部分同源。
16.如權利要求1-15中任一項的逆轉錄病毒載體，其特徵在於所述調節因子可由反式作用分子調節。
17.一種逆轉錄病毒載體系統，該逆轉錄病毒載體系統包括作為第一個部分的一個如權利要求1-16中任一項的逆轉錄病毒載體，和一個包裝細胞系，該包裝細胞系具有至少一個編碼包裝所述逆轉錄病毒載體所需的蛋白質的逆轉錄病毒或重組逆轉錄病毒結構。
18.如權利要求17的逆轉錄病毒載體，其特徵在於所述包裝細胞系具有編碼逆轉錄病毒蛋白的逆轉錄病毒結構或重組逆轉錄病毒結構，該逆轉錄病毒蛋白不能由權利要求1-16中任一項的逆轉錄病毒載體編碼。
19.如權利要求17或18的逆轉錄病毒載體，其特徵在於所述包裝細胞系選自psi-2、psi-Crypt、psi-AM、GP+E-86、PA317和GP+envAM-12。
20.一種在體外和在體內將同源或異源核苷酸序列導入人或動物細胞的治療或非治療方法，該方法包括用如權利要求1-16中任一項的逆轉錄病毒載體轉染如權利要求17-19中任一項的逆轉錄病毒載體系統的包裝細胞系，還包括用由所述包裝細胞系所產生的重組逆轉錄病毒感染靶細胞群體。
21.如權利要求20的治療或非治療方法，其特徵在於所述核苷酸序列選自下列組份中的一個或幾個編碼蛋白質的基因或基因的部分、調節序列或啟動子。
22.通過在如權利要求17-19中任一項的逆轉錄病毒載體系統中複製如權利要求1-16中任一項的逆轉錄病毒載體所產生的一種逆轉錄病毒原病毒，其特徵在於，在感染的靶細胞中的逆轉錄過程中，所述多接頭或任何插入到3′LTR的所述多接頭中的序列被複製，並出現在所產生的原病毒的5′LTR和3′LTR中。
23.將權利要求1-16中任一項的逆轉錄病毒載體用來生產可用於包括人在內的哺乳動物的基因治療的藥用組合物。
24.將權利要求17-19中任一項的逆轉錄病毒系統用來生產可用於包括人在內的哺乳動物的基因治療的藥用組合物。
25.將權利要求22的逆轉錄病毒原病毒用來生產可用於包括人在內的哺乳動物的基因治療的藥用組合物。
26.將權利要求1-16中任一項的逆轉錄病毒載體用於整合至所述同源的細胞序列上的定向整合。
27.將權利要求17-19中任一項的逆轉錄病毒載體用於整合至所述同源的細胞序列上的定向整合。
28.將權利要求22的逆轉錄病毒原病毒用於整合至所述同源的細胞序列上的定向整合。
29.如權利要求22的逆轉錄病毒原病毒的mRNA。
30.如權利要求1-16中任一項的逆轉錄病毒載體的RNA。
31.用權利要求1-16中任一項的逆轉錄病毒載體轉染權利要求17-19中任一項的逆轉錄病毒載體系統的包裝細胞系，並在合適條件下培養該細胞系所得到的重組逆轉錄病毒顆粒。
32.一種藥用組合物，該藥用組合物含有治療有效劑量的如權利要求31的重組逆轉錄病毒顆粒。
全文摘要
本發明涉及能進行啟動子轉變的逆轉錄病毒載體，它包括結構U3-R-U5的一個5′LTR片段；一個或幾個選自編碼和非編碼序列的序列；以及包括全部或部分缺失的U3片段的3′LTR片段，其中，所述缺失的U3片段被一個多接頭序列取代，其後是R和U5片段。所述逆轉錄病毒載體能進行啟動子轉變，並可用作定位基因治療的基因轉移載體。
文檔編號A61K48/00GK1159210SQ95194903
公開日1997年9月10日 申請日期1995年9月1日 優先權日1994年9月2日
發明者沃爾特·H·岡茲伯格, 羅伯特·M·薩勒 申請人:Gsf環境與健康研究中心有限公司