免疫調節劑及其應用的製作方法

2023-06-10 14:05:01 2

專利名稱：免疫調節劑及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及人CD2結合蛋白(包括其受體、受體的變體和單抗)與CD11a單克隆抗體或CTLA4可溶性片段及其變體聯合應用，通過免疫抑制作用治療自身免疫疾病或應用於器官移植等臨床病症。
背景技術：
抗原提呈細胞和T細胞在細胞免疫機理方面具有重要作用，有多種蛋白分子可以介導二者發生相互作用，從而引起T細胞的分化和發育，最終介導免疫反應。這種相互作用信號通道的三個例子示於圖1。
一、CD2LFA3途徑在CD2/LFA3途徑中，人CD2分子是一種50KD的膜蛋白，存在於大多數的胸腺細胞和所有的外周淋巴細胞表面，其成熟蛋白由332個胺基酸組成，其前體有一個19個胺基酸組成的信號肽(Genebank protein IDAAA51738.1)。該分子與LFA3專一性相互作用，介導T細胞對靶細胞或抗原呈遞細胞的粘附，從而起始T細胞的功能反應。
LFA3又稱CD58，是抗原提呈細胞是一種跨膜蛋白，其前體蛋白有一個28個胺基酸的信號肽，成熟蛋白由233個胺基酸組成(Genebank protein IDNP001770.1)。LFA3廣泛分布於各種細胞表面，包括紅細胞、內皮細胞、上皮細胞、成纖細胞等。CD2是其配體。
CD2/LFA3相互作用是T細胞—抗原提呈細胞相互作用多種信號通道的一種，二者結合後可以增強T細胞與抗原提呈細胞或靶細胞之間的粘附，促進T細胞對抗原的識別以及CD2所介導的信號的傳導。
抗CD2或者抗LFA3的抗體可以阻止CD2/LFA3的信號傳導，使T細胞的免疫功能受到抑制。
二.B7CD28/CTLA4途徑T-細胞、抗原提呈細胞表面參與產生共刺激作用的分子統稱為共刺激分子。目前公認最重要的共刺激通道為B7-CD27通路(圖1)。B7位於抗原提呈細胞，與T細胞表面的CD28分子結合可以產生共刺激。當T細胞激活後，其細胞表面會出現另外一種可以與B7細胞結合的分子CTLA4(Cytotoxic TLymphocyte associate Antigen-4)。CTLA4與B7的親和力很高，該分子與B7細胞結合後可以誘導B7細胞的調亡。因此目前認為它對T細胞激活有負調節作用，對於維持人體內免疫狀態的平衡起重要作用。
CTLA4(即溶細胞性T細胞相關抗原4)，又稱CD152，是由一種跨膜糖蛋白組成的二聚體，它可以與CD80和CD86結合，其親和力比與CD28明顯高，其功能與CD28相反，對T細胞活化有負調節作用。其受體為B7-1和B7-2。該分子與B7結合後，可以誘導T細胞凋亡，因此目前認為它對T細胞激活負反饋調節，對人體內維持免疫狀態的平衡起重要作用。
CTLA-4是表達在活化T細胞表面的標誌性分子之一。研究表明，該成分是維持體內T細胞穩定性的負調控因子，具有抑制活化T-細胞的增值的功能，與CD28構成了一對十分重要的免疫調節因子。目前，它被作為免疫抑制受體進行了廣泛的研究，在臨床上有可能作為抑制免疫排斥反應的製劑進行應用。
三、CD11aICAM-1途徑CD11/CD18複合物屬於整合素家族，包括淋巴細胞功能相關抗原即CD11a/CD18(該複合體亦稱為LFA-1)，噬細胞分化抗原即CD11b/CD18，Mac-1和糖蛋白即P150/95，CD11c/CD18。它們分別與分布在內皮細胞，血小板和淋巴細胞上的相應配體相結合，介導白細胞的識別、粘附。Mezzane發現不穩定心絞痛患者冠脈竇血中的中性粒細胞和單核細胞上CD11/CD18的表達明顯高於正常對照組，提示白細胞在經過冠脈循環時被激活，且粘附增加。
CD11a與T細胞的發育有關，其功能的抑制可以引起T細胞免疫功能的降低。因此，它與自身免疫疾病相關。研究表明，CD11a的單抗克隆抗體可以抑制T細胞的免疫功能，其作用機理是抑制T-細胞與其他細胞類型的結合，從而下調T細胞的免疫功能。
CD11a又稱整合素aL、LFA-1a鏈、p180等，是細胞整合素中的一員。該蛋白前體有一個26個胺基酸組成的信號肽，成熟蛋白由1144個胺基酸組成。
ICAM-1又稱CD54，是一種位於APC細胞表面的跨膜分子，其前體蛋白有一個27個胺基酸組成的信號肽，成熟蛋白由505個胺基酸組成。該蛋白與CD8 CTL T細胞表面的LFA-1分子的CD11a亞基相互作用，可增強T細胞的功能。
T細胞和抗原提呈細胞之間的上述三種信號傳導途徑在T細胞的免疫功能調節方面具有十分重要的作用。任何一種信號傳導途徑的阻斷都有可能導致免疫功能下調。基於此原理，可以開發出治療免疫紊亂疾病如自身免疫疾病的治療藥物。從基因工程角度來看，開發這類藥物的策略主要有三種。一種是研製信號通道相關蛋白的單克隆抗體，一種是研製信號通道相關蛋白的受體蛋白，一種是利用信號通道相關蛋白的拮抗劑。這三種策略都是利用一種(或多種)可以與信號通道蛋白特異性結合的蛋白來阻斷信號傳導過程。
這種策略的原理圖示於圖2。CD11a的單克隆抗體可以與CD11a特異性結合，從而阻斷了CD11a與ICAM1的結合，使得LFA1-ICAM1信號傳導途徑中斷。CTLA4是B7的受體，其胞外可溶性片段可以與CD28競爭性地與B7結合，由於CTLA4比CD28與B7的結合能力高，因此，在CTLA4濃度達到一定程度時，即可阻斷CD28與B7的結合，從而使B7CD28信號傳導途徑中斷。在LFA3CD2途徑中，如果存在不與APC細胞結合的自由LFA3完整分子或帶有其CD2結合區的不完整分子，則這種分子也可以與CD2結合，從而阻礙了APC細胞上LFA3與T細胞上CD2分子的結合，使得APC與T細胞間的信號傳導途徑被阻斷。
研究發現，採用上述三種途徑之一種或多種，可以有效阻斷APC與T細胞間的信號傳導，使T細胞發育、分化受阻或導致T細胞的凋亡，從而使T細胞的免疫功能不能正常發揮，結果導致免疫功能下降。
到目前為止，已經根據上述原理開發成功多種免疫功能抑制劑，這些免疫抑制劑可以使免疫功能顯著下調，從而使自身免疫疾病獲得顯著的治療。上述原理研製的免疫功能抑制劑還可以應用在器官或細胞移植方面，使免疫排斥顯著降低。
然而，直到目前，國內外還沒有一個療效明確且顯著的化學合成的或其他途徑製造的藥物用於治療自身免疫和免疫排斥。因此，本領域迫切需要開發新的治療自身免疫疾病的抑制劑。

發明內容
本發明的目的就是提供可用於治自身免疫疾病的抑制劑及其製法。
本發明的另一目的是提供一種含所述抑制劑的藥物組合物。
在本發明的第一方面，提供了一種免疫調節劑，它選自下組(a)抗人CD11a單克隆抗體，所述的抗人CD11a單克隆抗體具有SEQ ID NO1或3所示的重鏈序列，和/或SEQ ID NO2或4所示的輕鏈序列；(b)FLA3Ig融合蛋白，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO25中第1-120位所示的FLA3的CD2結合區和SEQ ID NO26中第121-347位所示的人IgG1的Fc片段；(c)CTLA4Ig融合蛋白，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO5中第37-161位所示的CTLA-4R胞外結構域、和SEQ ID NO17所示的人IgG1的Fc片段。
在一優選例中，所述的免疫調節劑是抗人CD11a單克隆抗體，且具有人IgG1恆定區。
在另一優選例中，所述的免疫調節劑是FLA3Ig融合蛋白，且具有SEQ IDNO26所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述的免疫調節劑是CTLA4Ig融合蛋白，且在CTLA-4R胞外結構域和人IgG1的Fc片段之間還具有連接肽，例如SEQ ID NO35所示的連接肽。
在本發明的第二方面，提供了分離編碼本發明上述的免疫調節劑的DNA分子。
在一優選例中，所述的DNA分子具有SEQ ID NO27或28所示的核苷酸序列。
在本發明的第三方面，提供了一種藥物組合物，它含有藥學上可接受的載體和本發明所述的免疫調節劑。
較佳地，所述的藥物組合物，含有一種或多種免疫調節劑，例如(a)、(b)和(c)中的2-3種免疫調節劑。
在另一優選例中，所述的藥物組合物，含有以下二種免疫調節劑(a)抗人CD11a單克隆抗體，所述的抗人CD11a單克隆抗體具有SEQ IDNO1或3所示的重鏈序列，和/或SEQ ID NO2或4所示的輕鏈序列；和(b)FLA3Ig融合蛋白，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO26中第1-120位所示的FLA3的CD2結合區和SEQ ID NO26中第121-347位所示的人IgG1的Fc片段。
在本發明的第四方面，提供了一種本發明所述的免疫調節劑的用途，它用於製備治療自身免疫疾病和抗免疫排斥的藥物。


圖1顯示了APC細胞與T細胞相互作用的幾種信號通道。
圖2顯示了信號傳導途徑的阻斷途徑。
圖3是pMG18表達載體的結構圖譜，其中pA是SV40病毒的「poly A」加尾信號；hCMV pro是人巨細胞病毒的啟動子(含增強子序列)；AmpR是氨苄青黴素抗性基因。
圖4顯示了CTLA4Ig的分子結構。
圖5顯示了表達載體pMSG的結構圖譜。
圖6顯示了重組的人FLA3胞外區-Ig融合蛋白的分子結構。
具體實施例方式
本發明人經過深入而廣泛的研究，構建了一類免疫調節劑，它們可通過免疫抑制作用治療自身免疫疾病或應用於器官移植等臨床病症。具體地，該免疫調節劑包括(a)抗人CD11a單克隆抗體；(b)FLA3Ig融合蛋白；和(c)CTLA4Ig融合蛋白。在此基礎上為此了本發明。
如本文所用，術語「自身免疫疾病」是指臨床上經常遇到的類風溼關節炎、銀屑病、紅斑狼瘡、多發性硬化症等。
本發明的免疫調節劑是多肽類物質。除了提供免疫調節劑之外，本發明還提供了編碼免疫調節劑的DNA分子。本發明的核苷酸編碼序列通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。一種可行的方法是用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
本發明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌；真菌細胞如酵母；CH0、COS7、293細胞的動物細胞等。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔，脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
本發明中涉及的重組細胞培養技術中，可以應用的培養基有許多種。其中，Ham′s101，MEM，RPMI-1640，DMEM等商品化的動物細胞培養基均可使用。在這些培養基中，可以加入適當的激素、生長因子、核酸降解物、微量元素等輔助成分，以提高細胞的活性。如果需要的話，可以添加任何物質，如能量因子等等。培養過程中pH、溶氧等的控制按照一般程序操作。
基本培養基以外的任何添加成分的分量均可通過正交試驗設計或最小二乘法來優化。細胞培養的設備，可以使用滾瓶、搖瓶、動物細胞生物反應器等進行。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
在優選的重組蛋白純化工藝中，由於本發明的重組蛋白的純化有一些共同特點。由於它們都帶有Fc片段，因此，在初級純化時，可以採用protein A填料進行親和層析進行捕捉。用protein A進行的親和層析純化具有得率高、純化效果好等突出優點，但是偶聯的protein A蛋白容易從載體上脫落，並且在使用過程中容易失活，填料汙染後不能用NaOH等進行清洗，很難長期使用。
本發明還提供了一種治療自身免疫疾病和抗免疫排斥的藥物組合物，它含有上述的免疫調節劑以及藥學上可接受的載體。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)腹膜內、靜脈內、或局部給藥。
本發明的藥物組合物可直接用於治療自身免疫疾病和抗免疫排斥。
本發明的藥物組合物含有安全有效量的本發明上述的免疫調節劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的免疫調節劑施用於哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1重組人源(化)抗人CD11a單克隆抗體表達載體的構建1.1從抗體庫中篩選CD11a的抗體基因可變區人源抗體庫的構建過程如下1).從1125名健康成年人抽取外周血，每人5毫升，檸檬酸抗凝後混合。
2).用Trizol從上述混合外周血抽取總RNA，用0ligo-dT16進行反轉錄，獲得cDNA。
3).按文獻Marks et al.By-passing immunizationhuman antibodiesfrom V-gene libraries displayed on phage.J.Mol.Biol.，222，581-597和Hoogenboom and Winter，By-passing immunisationhuman antibodies fromsynthetic repertoires of germline VH gene segments rearranged in vitro.J.Mol.Biol.，227，381-388所述的方法，用各引物之組合進行PCR，分別獲得長度約為330bp的重鏈可變區和31Obp左右的輕鏈可變區擴增產物。PCR引物組合物為每條引物的終濃度為20pmol/L。擴增條件預變性94C 1min，主循環94C 30sec，54C 30sec，72C 30sec，25循環，後延伸72C 3min。PCR產物1.2％瓊脂糖電泳純化後克隆到pCantab 5E載體(Pharmacia產品)。
4).轉化將上述克隆到噬菌體展示載體pCantabe 5E的質粒DNA，對大腸桿菌菌株TG1(Promega公司)進行電擊轉化。電擊細胞製備TG1細胞凍存液100ul接種於10毫升含100ug/ml氨苄青黴素的LB液體培養基中，37度培養過夜。取1ml上述過夜培養物，接種到2L上述同樣培養基中，37度培養8小時至OD600達0.4。5000RPM離心收集菌體後用冰冷的10％甘油溶液洗滌細胞2次後將細胞重懸於10ml 10％甘油中。電擊上述細胞100ul加入到預冷至-20度的100ul電擊杯中，加入上述pCantab 5E載體2微生，充分混勻後電擊。電擊條件電阻2500歐姆，電壓10千伏。上述電擊連續進行多次，直至將所有載體DNA用完。
上述電擊完成後，立即在電擊杯中加入LB液體培養基(不含氨苄青黴素)1毫升，37度培養10小時後加入氨苄青黴素至100ug/L，37度培養6小時後5000rpm收集菌體。將收集的菌體重懸於含7％甘油的LB培養基中，-70℃保存備用。
對製備的抗體庫，按以下步驟篩選抗體1).復甦的抗體庫菌株1毫升加入新鮮LB培養基14毫升，於50毫升三角瓶中37度培養16小時。
2).12000rpm高速離心10分鐘，轉移上清至一個無菌的50毫升離心管中，保存備用。其滴度應在2×1011以上。
3).以純化的CD11a蛋白(購自深圳晶美公司)為抗原，常規方法包被25毫升細胞培養瓶。
4).包被後的細胞瓶中加入不少於3×1010噬菌體顆粒，37度溫育1小時。
5).倒掉瓶中的液體，用10毫升加入了1％Tween-20的PBS洗滌培養瓶10次。
6).在培養瓶中加入1毫升對數期的TG1細胞，37度溫育震蕩培養16小時。
7).重複2～6步，共進行4個重複循環。
8).將上述獲得的細胞稀釋至100000細胞/ml後在加入0.1％氨苄青黴素的1.5％瓊脂平板上進行培養以獲得單克隆。
9).取上述平板上的克隆在96孔深孔板上進行培養，每孔一個克隆，共作960個克隆(10塊96孔板)。
10).將上述深孔板在96孔板離心機上5000RPM離心20分鐘後，將上清轉移到新的無菌深孔板，封口後保藏於4度備用。
11).取96孔板10塊，每孔中加入CD11a(10ug/ml)10微升常規包被後，分別加入上述保存的上清10微升，37度溫育1小時後用含有1％Tween-20的PBS洗滌20次。
12).加入1微升HRP標記的羊抗M13單抗，37度溫育30分鐘後用1％Tween-20的PBS洗滌10次。
13).加入含有0.025％DAB顯色劑的PBS 200微升和1微升1％的H202，37度溫育顯色20分鐘後在讀板機上讀取595納米處的光吸收。
14).根據光吸收讀數確定顯色反應強的孔，這些孔相對應的克隆即為親和力較強的抗體可變區克隆。
15).通過上述過程，篩選出了抗人CD11a的陽性克隆387個陽性，根據讀數確定其中5個親和力最強的克隆，選其中兩個最高的用於後續的研究。這兩個克隆分別命名為pCD11-1，pCD11-2.
16).測序分析，結果如下表1

1.2抗體可變區編碼序列的表達載體的克隆
1).將上述2個克隆的菌株在100ml LB培養基中擴增，用Promega公司的質粒DNA抽提純化試劑盒純化質粒DNA。
2).用XbaI和NheI酶切上述質粒DNA後在1.5％瓊脂糖凝膠電泳上分離酶切片段，取350bp左右的帶進行膠回收，所得片段即為重鏈可變區。
3).用HindIII和Bsi WI酶切上述質粒DNA後在1.5％瓊脂糖凝膠電泳上分離酶切片段，取320bp左右的帶進行膠回收，所得片段即為輕鏈可變區。然後首先將重鏈可變區插入到表達載體pMG18(圖3)的XbaI/NheI位點，再用HindIII和Bsi WI將抗體輕鏈可變區插入到插入了重鏈可變區的pMG18的HindIII/Bsi WI位點，從而構成了人源化抗CD11a抗體基因的表達載體。
1.3CHO細胞的轉染與重組克隆的篩選1).上述構建的帶有抗體基因的表達載體在大腸桿菌DH5a菌株接種於100毫升LB培養基中進行擴增，用Qiagen公司的Ultrapure Plasmid DNAPurification Kit抽提純化質粒DNA。將上述純化的質粒DNA採用Invitrogen公司的脂質體法試劑盒轉染CHO細胞，操作參照廠家的說明書進行。
2).轉化的CHO細胞在選擇培養基上進行連續9周的選擇，最後在96孔板上進行極度稀釋培養，連續進行3次，進行單克隆化。
3).挑出的單克隆細胞系在RPM1641培養基上進行培養，對上清進行Western Blotting實驗，根據染色反應判斷表達強度，挑選出表達強的克隆作為候選細胞株。
4).單克隆抗體的純化上述單抗的純化採用Protein A親和層析柱從細胞培養上清中直接分離純化，並用SDA-PAGE電泳證明，所得產物純度大於90％。
5).以上親和層析的產物再次經過分子篩層析，獲得了純度＞98％的樣品。這些樣品可以用於以下的進一步分析與研究。
結果通過以上的操作，篩選出上述兩種抗人CD11a抗體基因表達強度較高的候選克隆13個和9個(見表2)。
1.4抗CD11a抗體基因在CHO細胞中表達強度的研究將上述篩選得到的高表達候選克隆(見表2)培養於10cm的組織培養皿，採用ELISA法測量抗體的表達量羊抗人IgG(Fc)包被於ELISA板，4℃過夜，經2％BSA於37℃封閉2小時，加入待測的培養上清和標準品(人IgG1)，37℃孵育2小時，加入HRP-羊抗人IgG(κ)進行結合反應，37℃孵育1小時，加入TMB於37℃作用10分鐘，最後用H2SO4終止反應，測A450值。測得的上述候選克隆的表達量(ug/ml)如下表2所示
表2

從上表中可以看出，8C9和4D8的表達水平具有很高的表達水平。與國外已經發表的資料(Kunkel，PNAS，82488，1995)(18.2ug/ml)相比，表達水平提高了17倍和20.7倍。
選取8C9和4D8作為進一步研究對象，細胞株記作CD11-1和CD11-2，分別對應pCD11-1和pCD11-2兩種載體分子結構。
實施例2重組人CTLA4-Ig的細胞株構建和表達2.1.CTLA-4R編碼序列的基本資料根據已經發表的文獻[GenBank Accession Number L15006]，CTLA-4R的胺基酸序列(223胺基酸)如SEQ ID NO5所示，其中第37-171位為胞外區結構域，該片段具有完全的與B7結合的能力，可以作為CD28拮抗劑。本發明中記作CTLAs。
CTLA-4R基因的cDNA序列(5′→3′，672b)如SEQ ID NO6所示，其中第119-483位為胞外結構域CTLAs的編碼序列。
為了在CHO細胞中獲得高表達，根據上述CTLAs片段的胺基酸序列，利用DNA/蛋白質分析軟體DNAstar和GCG對適合CHO細胞表達的編碼序列進行了設計。
2.2.人工設計的CTLAs基因的合成人工設計的CTLAs基因DNA序列如SEQ ID NO7所示，其中前9個鹼基為添加的3個保護鹼基、一個NheI酶切位點和一個加入的起始密碼。
接著，通過以下程序合成人工設計的全長CTLAs基因運用GCG軟體將上述序列及其互補序列分解成長約85b的片段，共計25個多核苷酸片段，其中正鏈的的第一個片段為5′-CAGgctagcATGgccatgcacgtggccca gcccgccgtggtgctggcctcctcccgcg-3′(SEQ ID NO8)其前三位鹼基是保護鹼基，第4～9個鹼基是插入表達載體時的酶切位點(NheI)，第一個ATG是加入的起始密碼子。該片段也是合成全長融合基因時的上遊引物，本研究中記作CTLAs-M。設計原則是互補的相鄰品片段之間有18～20個鹼基的互補區。參照文獻Chrisostomos Prodromou and Laurenee H，Pearl(1992)的方法進行基因的合成。設計的多核苷酸片段委託上海生工生物工程有限公司代為合成並進行PAGE純化。
合成好的片段按照2微克/微升的濃度溶於滅菌的三蒸水中，按照以下方法進行PCR反應體系的組成是成分數量(ul)1OX PCR反應緩衝液 1O25mM Mg2SO410Pfu DNA聚合酶(5單位/微升) 2多核苷酸片段(2微克/微升)各1微升，共計25微升滅菌三蒸水 至100微升反應條件如下預變性94度2分鐘主循環94度1分鐘，55度1分鐘，72度3分鐘。
循環數20後延伸72度5分鐘PCR過程在PROGENE Genium熱循環儀上進行。
按照上述條件進行PCR。完畢後將產物在0.8％瓊脂糖凝膠電泳上進行鑑定，發現產物中有唯一一條分子量350～400bp右的帶，用Promega公司的膠回收試劑盒回收該片段，操作按照廠家的說明書進行。共得DNA約2.5微克。
上述DNA片段按照常規方法克隆到pUC18載體上，轉化大腸桿菌DH5a細胞後在IPTG/X-gal平板上進行篩選，取18個白色菌斑接種於含有氨苄青黴素的液體LB培養基進行擴增，用質粒抽提純化試劑盒(Promega)抽提質粒DNA並進行酶切鑑定後選出了15個大小正確的克隆並進行DNA序列測定。根據測序結果，確認了1個序列完全正確的克隆，即CTLAs-M。
2.3.天然CTLAs基因的PCR擴增、克隆和測序(1).引物的設計根據前述CTLAs基因的DNA序列，用DNAstar軟體進行引物設計，結果如下上遊引物CTLAs-N5′-CAGcgtagcATGgcaatgcacgtggcccagcc-3′(SEQ IDNO9)，其中，CAG為保護鹼基，下劃線部分為表達載體pMSG(Pharmacia公司)克隆時的切點(Nhe I)。該片段也是構建天然CTLAs/Fc全長基因時的上遊引物，記作CTLAs-N.
下遊引物5′-gtcagaatctgggcacggttc-3′(SEQ ID NO10)。
上述引物委託上海生工公司進行合成並進行PAGE純化後用於PCR。
(2).模板DNA的製備用GIBCO公司的Trizol試劑從人MT細胞中抽提總RNA，操作過程按照廠家的說明進行。抽提的總RNA在1％瓊脂糖電泳上確認完整性後用INVITROGENE公司的反轉錄試劑盒按照廠家說明進行反轉錄，獲得cDNA。反應完畢，經Promega公司的反應體系DNA抽提純化試劑盒純化後作為PCR的模板。
(3).PCR擴增利用上述引物和模板DNA進行PCR，其反應體系如下成分 數量(ul)10X PCR反應緩衝液 1025mM Mg2SO410Pfu DNA聚合酶(5單位/微升) 2引物(2微克/微升) 各3微升，共計6微升模板DNA(1.6微克/微升) 1.2滅菌三蒸水至100微升PCR過程在PROGENE GENIUS熱循環儀上進行，循環條件如下預變性94度2分鐘。
主循環94度1分鐘，59度1分鐘，72度2分鐘，共20循環。
後延伸72度5分鐘。
(4)PCR產物的鑑定和膠回收按照上述條件進行PCR。完畢後將產物在0.8％瓊脂糖凝膠電泳上進行鑑定，發現產物中有一條分子量在375bp左右的單一帶，與預期的375bp大小一致。用Promega公司的膠回收試劑盒回收該片段，操作按照廠家的說明書進行。共得DNA約3.2微克。
(5).天然CTLAs基因的克隆、鑑定與測序上述DNA片段按照常規方法克隆到pUC18載體上，轉化大腸桿菌DH5a細胞後在IPTG/X-gal平板上進行篩選，取5個白色菌斑接種於含有氨苄青黴素的液體LB培養基進行擴增，用質粒抽提純化試劑盒(Promega)抽提質粒DNA並進行酶切鑑定後選出了5個大小正確的克隆並進行DNA序列測定。根據測序結果，確認了1個序列完全正確的克隆，即CTLAs-N。
2.4.接頭序列的設計與合成當將兩個基因或基因片段重組成一個編碼區構成融合蛋白的編碼序列時，兩個目標片段之間往往需要加入一個連接序列，該連接序列的選擇有很強的技術性。我們根據多年的經驗，設計該片段時遵循的原則是1)。要使用其編碼的多肽不能具有形成二級結構的能力；2)。其編碼的多肽不能由糖基化信號；3)。不能有過多的疏水胺基酸。據此，設計的胺基酸序列是(Ala3Ser2)5。其編碼的DNA序列是5′-ACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCA-3』(SEQ ID NO11)根據以上序列，考慮到通過PCR將CTLAs編碼區與Fc片段拼接時的需要，該片段的首尾各加上一個分別與CTLAs編碼區3』-端和Fc編碼區5』-端互補的序列，各約20個鹼基長度。因此，人工合成CTLAs的Linker-M全序列為5』-taaccatttccatccataattaaACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAacatgcccaccgtgcccagcac-3』(SEQ ID NO12)天然CTLAs的Linker-N全序列為5』-cttattttattcccatcaattgaACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAacatgcccaccgtgcccagcac-3』(SEQ ID NO13)上述兩種Linker均由上海生工公司帶為合成並進行純化。
2.5.人IgG1 Fc片段編碼序列的獲得天然全長IgG1編碼區(1416bp，471胺基酸+終止密碼子，Genbank accessionnumberBC024289)的序列如SEQ ID NO14所示，其中，第1-426位為VDJ區；第427-1416位為人IgG1恆區，包括CH1+絞鏈區+CH2+CH3；第718-1416位為人IgG1恆定區中絞鏈區+CH2+CH3區的編碼區。
通過以下程序反轉錄獲得人IgG1編碼序列，並克隆到載體pGEM-T上，所得載體記做pIGG-1。具體操作過程100毫升人外周血，用淋巴細胞分離液(Sigma產品)分離獲得白細胞，用Qiagen的mRNA抽提純化試劑盒抽提mRNA，在1.2％瓊脂糖凝膠電泳上鑑定其完整性後用GIBCO公司的RT-PCR試劑盒進行反轉錄和PCR，引物為正向引物(加酶切點)atggaactggggctccgctg(SEQ ID NO15)反向引物(加酶切點)tcatttacccggagacag(SEQ ID NO16)(因為利用了A/T克隆，此兩引物不需要加入酶切點)PCR條件預變性94C 2分鐘；主循環94C 1分鐘，56C 45秒，72C 90秒，30循環；後延伸72C 4分鐘。
擴增完畢，在1％瓊脂糖凝膠電泳上鑑定分離擴增的DNA，用Qiagen公司的DNA膠回收試劑盒回收14Kb的片段後克隆到pGEM-T載體(Promega公司)上，測序驗證序列後，獲得一個完全正確的克隆，記作pIGG-1。
用於可溶性片段融合的人IgG1 Fc(絞鏈區+CH2+CH3)片段的胺基酸序列如SEQ ID NO17所示，共232個胺基酸。
人工設計的適合CHO細胞表達的人IgG1 Fc編碼序列如SEQ ID NO18所示。
人IgG1 Fc天然編碼序列如SEQ ID NO19所示，共699bp。為了獲得IgG1 Fc片段的編碼序列，設計和合成如下引物3′-端引物Fc-35′-gcactcgagttttacccggagacagggagag-3′(SEQ ID NO20)，其中，gca為保護鹼基，下劃線部分為向上述表達載體克隆時的切點(XhoI)。該引物也是獲得全長CTLAs/Fc融合基因的下遊引物。
5′-端引物Fc-55′-gagcccaaatcttgtgacaaaac-3′(SEQ ID NO21)以上述引物和含有人IgG1全序列的質粒pIGG-1為模板進行PCR，獲得了長度為708鹼基的產物。電泳鑑定、克隆和測序方法同上。結果獲得pIGG1Fc。
2.6.全長CTLAs-Fc融合基因的獲得(1)全長CTLAs-N/Linker/Fc融合基因的獲得本實施例中設計的接頭序列(linker)其胺基酸序列為(Ala3Ser2)5(SEQ ID NO35)；其DNA序列之一為5』-ACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCA-3』(SEQ ID NO36)該序列委託上海生工公司合成後，用PCR方法與前述pIGG1Fc中的Fc片段拼接後，形成Linker-N/Fc片段。
以前述的Linker-N/Fc和CTLAs-N的DNA為模板，以CTLAs-N和IgG1Fc-3′(SEQ ID NO20)為引物進行PCR，反應條件為反應體系如下成分數量(ul)10X PCR反應緩衝液 1025mM Mg2SO410Pfu DNA聚合酶(5單位/微升) 2引物(2微克/微升)各1.5微升，共計2微升Linker-N/Fc DNA(1.8微克/微升) 1CTLAs-N(1.5ug/ul) 1.2滅菌三蒸水 至100微升
PCR過程在PROGENE GENIUS熱循環儀上進行，循環條件如下預變性94度2分鐘。
主循環94度1分鐘，60度1分鐘，72度3分鐘，共20循環。
後延伸72度5分鐘。
按照上述條件進行PCR。完畢後將產物在0.8％瓊脂糖凝膠電泳上進行鑑定，發現產物中有一條分子量在1500bp左右的單一帶，與預期的1540bp大小一致。用Promega公司的膠回收試劑盒回收該片段，操作按照廠家的說明書進行。共得DNA約3微克。
上述DNA片段按照常規方法克隆到商品化的pUC18載體上，轉化大腸桿菌DH5a細胞後在IPTG/X-gal平板上進行篩選，取7個白色菌斑接種於含有氨苄青黴素的液體LB培養基進行擴增，用質粒抽提純化試劑盒(Promega)抽提質粒DNA並進行酶切鑑定後選出了3個大小正確的克隆並進行DNA序列測定。根據測序結果，確認了1個序列完全正確的克隆，記作CTLAs-N/Linker-N/Fc。
(2)全長CTLAs-M/Linker/Fc融合基因的獲得本實施例中設計的接頭序列(linker)其胺基酸序列為(Ala3Ser2)5(SEQ ID NO35)；其DNA序列之一為5』-cttattttattcccatcaattgaACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAacatgcccaccgtgcccagcac-3』(SEQ IDNO37)該序列委託上海生工公司合成後，用PCR方法與前述pIGG1Fc中的Fc片段拼接後，形成Linker-M/Fc片段。
以前述的Linker-M/Fc和CTLAs-M(SEQ ID NO7)的DNA為模板，CTLAs-M和IgG1Fc-3′SEQ ID NO20)為引物進行PCR，反應體系為成分 數量(ul)10X PCR反應緩衝液 1025mM Mg2SO410Pfu DNA聚合酶(5單位/微升) 2引物(2微克/微升) 各1.5微升，共計2微升Linker-M/Fc DNA(1.4微克/微升) 1CTLAs-M(1.2ug/ul) 1.1滅菌三蒸水 至100微升PCR過程在PROGENE GENIUS熱循環儀上進行，循環條件如下
預變性94度2分鐘。
主循環94度1分鐘，60度1分鐘，72度4分鐘，共25循環。
後延伸72度5分鐘。
按照上述條件進行PCR。完畢後將產物在0.8％瓊脂糖凝膠電泳上進行鑑定，發現產物中有一條分子量在1500bp左右的單一帶，與預期的1540bp大小一致。用Promega公司的膠回收試劑盒回收該片段，操作按照廠家的說明書進行。共得DNA約2.7微克。
上述DNA片段按照常規方法克隆到pUC18載體上，轉化大腸桿菌DH5a細胞後在IPTG/X-gal平板上進行篩選，取9個白色菌斑接種於含有氨苄青黴素的液體LB培養基進行擴增，用質粒抽提純化試劑盒(Promega)抽提質粒DNA並進行酶切鑑定後選出了6個大小正確的克隆並進行DNA序列測定。根據測序結果，確認了1個序列完全正確的克隆，記作CTLAs-M/Linker-N/Fc。
(3)結果通過以上操作，獲得了天然CTLAs基因與Linker和Fc片段的融合基因CTLAs-N/Linker/Fc和人工設計的CTLAs基因與Linker和Fc片段的融合基因CTLAs-M/Linker/Fc。這兩種融合蛋白的區別在於前者的CTLAs編碼區是天然的，而後者的相應區域是人工設計的。圖4顯示了全長融合蛋白表達產物的分子結構。
2.7.全長CTLAs-Fc融合基因的獲得(1)製備全長CTLAs-Fc融合基因為了檢測接頭片段對提高該融合蛋白親和力的作用，在以下操作中獲得了Fc片段與CTLAs-N和CTLAs-M的直接融合片段，此種結構中沒有Linker片段。如果對這兩種融合基因在CHO細胞中的表達產物和前述CTLAs-N/Linker/Fc和CTLAs-M/Linker/Fc的表達產物的親和力進行比較，就可以確認Linker片段對親和力的影響。這兩種結構的構建過程如下根據Fc和CTLA-M、CTLAs-N的編碼DNA序列，設計如下兩種引物Primer M5′taaccatttccatccataattaatctgaggttgtctggaacccag-3′(SEQ ID NO22)Primer N5′-cttattttattcccatcaattgaacatgcccaccgtgcccagcac-3′(SEQ ID NO23)以前述的CTLAs-N和帶有全長IgG1基因的質粒DNA為模板，CTLAs-N、IgG1Fc-3′和Primer N為引物進行PCR，在瓊脂糖凝膠電泳上獲得分子量約為1049bp的單一條帶後進行膠回收。獲得的DNA按照常規方法克隆到pUC18載體上後轉化大腸桿菌並進行藍白斑篩選，通過酶切鑑定和測序確認了一個序列完全正確的克隆，記作CTLAs-N/Fc。
重複上述程序，不同點在於用Primer M替換Primer N，用CTLAs-M替換CTLAs-N。結果獲得了CTLAs-M與Fc的融合基因，記作CTLAs-M/Fc。
(2)基因的克隆與序列測定首先通過下列操作對上述擴增的天然CTLA、人工設計的CTLA片段和pUC18進行酶切，反應體系為成分數量(ul)10x反應緩衝液M 10微升NheI(10U/ul)(Phamarcia) 1微升XhoI(10U/ul)(Phamarcia) 1.5微升CTLA DNA或質粒DNA(0.5～1微克/微升) 5微克滅菌三蒸水 至100微升上述體系在37度反應過夜，在0.8％瓊脂糖電泳上進行分離鑑定，用Promega公司的膠回收試劑盒回收大小正確的片段，天然CTLA得到約3微克DNA，人工設計的CTLA約4微克，pUC18得到約3.3微克DNA。
取上述pUC18 DNA和CTLA DNA按照下述程序進行連接反應體系成分數量(ul)10x連接反應緩衝液 2微升天然CTLAs-N DNA(1.7ug/ul) 2～3微升或人工CTLAs-M DNA(1.2ug/ul) 3～4微升pUC18 DNA(1.0ug/ul) 1微升T4 DNA ligase(10U/ul) 1微升滅菌三蒸水 至20微升上述體系在16度反應過夜後，按照常規方法將上述連接好的重組DNA轉化大腸桿菌DH5a菌株，並在IPTG/X-Gal平板培養基上進行藍白斑篩選。取人工設計的CTLAs-M的白斑28個、天然CTLAs-N的白色克隆6個接種於含有氨苄青黴素的液體LB培養基，37度培養過夜後利用Promega公司的質粒抽提純化試劑盒抽取質粒進行酶切鑑定，發現其中人工CTLAs-M的克隆中有16個克隆具有正確大小，天然CTLAs的克隆中有4個大小與預期相符。這些克隆作為測序的候選克隆。
從上述人工設計CTLAs-M的16個克隆中選10個，從天然CTLAs-N克隆中選取2個進行DNA測序，測序工作委託上海基康公司進行。測序結果表明，獲得了序列正確的CTLAs-M/Fc和CTLAs-N/Fc克隆。
2.8.CTLA基因的表達載體克隆(1).融合基因DNA和載體DNA的準備前述工作已經構建了CTLAs-N/Linker/Fc、CTLAs-M/Linker/Fc、CTLAs-M/Fc、CTLAs-N/Fc四種融合蛋白基因。將上述確認的正確克隆接種於含有氨苄青黴素的20毫升液體LB培養基，37度培養過夜，用Promega公司的Midi質粒DNA抽提純化試劑盒抽提質粒DNA，各得質粒DNA約30微克。
按照下述條件進行酶切並進行膠回收，獲得各融合基因的DNA片段和準備好的pMSG載體(Pharmacia公司)(圖5)。
反應體系成分 數量(ul)10x反應緩衝液M10微升NheI(10U/ul)(Phamarcia) 1微升XhoI(10U/ul)(Phamarcia) 1.5微升含有融合基因的pUC18質粒DNA(0.65微克微克/微升)1微克或pMSG質粒DNA(0.7微克/微升)滅菌三蒸水至100微升上述體系在37度反應過夜，在0.8％瓊脂糖電泳上進行分離鑑定，用Promega公司的膠回收試劑盒回收大小約為1500b的片段，CTLAs-N/Linker/Fc、CTLAs-M/Linker/Fc、CTLAs-M/Fc、CTLAs-N/Fc各得到約1.2微克、2.7微克、1.6微克、1.8微克DNA，pMSG得到約3.4微克。
(2).將融合基因片段重組到pMSG表達載體通過下述反應將CTLAs-N/Linker/Fc、CTLAs-M/Linker/Fc、CTLAs-M/Fc、CTLAs-N/Fc基因連接到pMSG載體上並進行轉化和藍白斑篩選反應體系成分 數量(ul)10x連接反應緩衝液 2微升融合基因DNA(約0.9ug/ul)2微升pUC18 DNA(1.0ug/ul)1微升T4 DNA ligase(10U/ul) 1微升滅菌三蒸水 至20微升上述反應體系在16度反應過夜(10小時以上)。
(3).細菌的轉化、克隆的鑑定與測序上述體系在16度反應過夜後，按照常規方法將上述連接好的重組DNA轉化大腸桿菌DH5a菌株，並在IPTG/X-Gal平板培養基上進行藍白斑篩選。各取白斑12個接種於LB液體培養基37度培養後抽取質粒進行酶切鑑定，每種融合基因至少獲得4個具有正確大小的插入片段的克隆，作為候選克隆。
將上述候選克隆中的兩個進行DNA測序，測序工作委託上海基康公司進行。根據測序結果，分別確認CTLAs-N/Linker/Fc、CTLAs-M/Linker/Fc、CTLAs-M/Fc、CTLAs-N/Fc分別有3個、2個、1個和1個克隆的序列與設計的完全一致。
上述研究中獲得的正確克隆分別稱之為pMSG[CTLAs-N/Linker/Fc]、pMSG[CTLAs-M/Linker/Fc]、pMSG[CTLAs-M/Fc]、pMSG[CTLAs-N/Fc]。(N代表天然的，M代表突變的)。
實施例3重組人CD2結合蛋白的細胞株構建3.1.FLA3胞外區編碼基因的分析與設計FLA3(也稱為CD58)的天然DNA序列(GenBank Accession NumberNM_001779)如SEQ ID NO24所示，其中第10-762位為全長蛋白質編碼區，第10-369位為CD2結合區域的編碼區。對應的胺基酸序列SEQ ID NO25所示，全長為250個胺基酸，第1-120位為CD2結合區域。
據此，可以設計引物，利用PCR方法將該區擴增出來，並與人IgG1 Fc片段構成融合蛋白FLA3Ig。其胺基酸序列如SEQ ID NO26所示，其中第1-120位為CD2結合區域，第121-347為IgG1 Fc片段。
將天然的CD2結合區和IgG1的Fc編碼區重組，所形成的融合基因的DNA編碼序列如SEQ ID NO27所示，其中第1-360位CD2結合區的編碼序列。
如同前述，為了獲得在CHO細胞中的高表達，按照哺乳動物細胞對密碼子的偏愛性，設計了適合CHO細胞表達的FLA3-Ig融合蛋白基因，如SEQ IDNO28所示，其中第1-360位CD2結合區的編碼序列。
上述構建的融合基因的表達產物為FLA3-Ig，其成熟蛋白的結構如圖6所示。
3.2FLA3胞外區基因的獲得根據前述的FLA3胞外區的cDNA序列和人工設計的序列，分別用PCR方法進行相應區段DNA的擴增和全長合成，分別得到該區的天然編碼片段和人工設計的編碼片段。操作如下天然編碼片段重組表達載體的構建
FLA3大然編碼片段的獲得根據其cDNA的序列，合成如下引物正向引物5′-ATGGTTGCTGGGAGCGACGC-3′(SEQ ID NO29)反向引物5′-tttacccggagacagggagag-3′(SEQ ID NO30)合成的引物按照1.0OD溶於100微升無菌水的比例進行溶解，稀釋10倍後使用。PCR條件為模板DNA(100ng/ul)1ul，10mM dNTPs 1.5ul，2ul 10X PCR，1.5ul 25mM MgCl2，引物各1ul，加水至20ul的終體積。循環條件預變性94C 2分鐘，主循環為94C30秒，56C30秒，72C 1分鐘，30循環後進行3分鐘後延伸。
PCR完畢，在1.2％瓊脂糖凝膠電泳上分析PCR產物，發現在350～400bp靠近350bp處有一條惟一的帶。此帶大小與理論大小相符，為目標帶。用膠回收試劑盒對該帶進行DNA回收，常規方法克隆到T-載體(購自Promega公司)上，挑選陽性克隆後進行測序驗證。在5個測序的克隆中有兩個序列與預期的完全一致，取其中pFLA3-N保存備用。
3.3全長FLA3Ig融合蛋白基因的合成上遊正向引物5′-gctagcATGGTTGCTGGGAGCGACGC-3′(SEQ IDNO31)(含酶切位點NheI)拼接正向引物5′-GAAGTTCTTTCTTTATGTCGACAAAACTCACACATGCCCA-3′(SEQ IDNO32)拼接反向引物5′-TGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGACATAAAGAAAGAACTTC-3′(SEQ IDNO33)下遊反向引物5′-TTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCctcgag-3′(SEQ IDNO34)(含酶切位點XhoI)以上述引物和pFLA3-N和pIGG-1為模板，用上述4種引物進行重迭PCR，擴增合成全長FLA3-N/Ig基因。獲得全長基因後克隆到pGEM-T載體(Promega公司產品)上，測序驗證後取一個序列完全正確的克隆，保存備用。該克隆記作pFLA3Ig-N。
3.4.FLA3Ig人工基因的全合成根據設計的人工基因序列，設計12個片段，每個長度約85bp。設計引物時在全序列的兩側加上酶切位點。委託上海生工公司合成後用PCR方法獲得該基因片段的1041bp的全長擴增產物。然後，用對其進行鑑定、克隆和測序，最終找到1個克隆具有完全正確的序列，保存備用。該克隆記作pFLA3Ig-M。
3.5.重組人CD2結合蛋白的細胞株構建與實施例2中構建CTLA4Ig表達載體的一樣，將上述FLA3Ig-N和FLA3Ig-M的結構基因插入到pMSG表達載體(圖5)上，經篩選獲得陽性克隆後進行DNA測序以驗證所得重組子的正確性。
實施例4重組CHO細胞的獲得1).質粒DNA的提取與純化取實施例1-3中製備的帶有重組質粒的大腸桿菌菌株，分別接種於500ml加入了氨苄青黴素的2xYT液體培養基，37度260rpm震蕩培養16小時後用Qiagen公司的Ultrapure Plasmid Purification Kit抽提質粒DNA，抽提過程按照廠家提供的說明書進行。
2).CHO細胞的轉染與篩選採用脂質體法對CHO細胞進行轉染，轉染試劑盒購自Invitrogene公司，轉染時分別取上述純化的質粒DNA 100微克作為樣品對CHO細胞進行轉染，轉染操作程序按照廠家的說明書進行。
轉染後的CHO細胞經連續3個月的氨甲喋呤(MTX)篩選，其濃度從0.05uM到10uM，每兩周增加一次濃度，每次MTX的用量約為前一次的2倍，具體視細胞生長情況而定。細胞培養按照常規進行，培養基為15％胎牛血清(Gibco)+RPM1640/DEME。於37度5％CO2培養箱中培養。然後按照常規極度稀釋法進行單克隆化。然後，用ELISA方法分別檢測各克隆目標重組蛋白的表達量，並據此每種融合基因挑選若干個表達量最高的克隆，確認其中一個表達量高而穩定的克隆用於進一步的研究。
結果1.CTLA4Ig融合蛋白總共得到pMSG[CTLAs-N/Linker-N/Fc]克隆110個、pMSG[CTLAs-M/Linker-N/Fc]克隆87個、pMSG[CTLAs-M/Fc]克隆93個、pMSG[CTLAs-N/Fc]克隆112個。分別得到高表達克隆5個，1個，2個，2個。
2.抗CD11a單抗得到1850個克隆，其中CD11-1 960個，CD11-2 890個。前者得到2個高表達克隆，後者得到5個高表達克隆。
3.FLA3Ig總共得到428個高表達克隆，其中FLA3Ig-N 4個，FLA3Ig-M 2個。
3)融合基因表達水平的研究用ELISA方法對上述部分克隆的CTLAs-Fc融合基因在CHO細胞中的表達強度進行了研究，具體數據如下表3

以上數據說明，CTLAs-M的表達強度在有Linker和沒有Linker的融合結構中均有明顯增強的表達。這說明，基因的人工設計明顯提高了其表達水平，提高的幅度高達14.6倍。這說明人工設計的CTLAs-M基因在CHO細胞中有明顯提高了的表達，對該蛋白質的規模生產具有重要的經濟價值。
實施例5重組蛋白的純化5.1抗人CD11a單抗的純化一種抗人CD11a單抗的純化工藝流程可以是蛋白A柱→反相柱→分子篩。在該工藝中，由於重組單抗是分泌型表達的，因此培養上清經過簡單離心，除去細胞殘片後即可直接進行親和層析。用protein A親和層析時，可以使用如下方法中的一種將protein A填料按照每100毫升上清1毫升的比例加入填料後，在4度慢速攪拌24小時。然後在100mM pH8.2的Tris-H2SO4緩衝液中漂洗4次後，用含250mM氯化鈉的同樣緩衝液洗脫後進行硫酸銨分步沉澱，起始濃度為35％飽和度，終止濃度63％飽和度。4度處理12小時後高速離心，取沉澱，重新溶於上述不含氯化鈉的緩衝液中，並於同樣緩衝液透析過夜後濃縮10倍，待用。
上述樣品可經SDS-PAGE或HPLC檢定純度，ACD法或Follin酚法定量蛋白質含量。經上述純化的重組蛋白，其純度可達90％以上，並具有顯著生物活性。
第二種方法是把protein A裝成柱子，用手動的或自動的上樣設備上樣後，經過100mM Tris-HCl pH8.5的緩衝液洗滌四體積後，用含100～400mM氯化鈉的洗脫液洗脫，即可獲得經protein A捕捉的單克隆抗體。洗脫峰在233～260mMNaCl處被洗脫，所得樣品可再經反向層析和分子篩進一步純化，可得到純度達93％以上的重組蛋白。這種方法操作可自動化，並連接在線監測設備，可隨時了解操作狀況。
單克隆抗體也可以不經過protein A親和層析，直接使用硫酸銨分步沉澱法進行純化。其得率可達到12％，純度可達90％以上。
5.2重組人CTLA4Ig融合蛋白的純化一種重組人CTLA4Ig融合蛋白的純化工藝流程可以是蛋白A柱→分子篩→離子交換柱→疏水層析。
與CD11a單克隆抗體一樣，CTLA4Ig也具有同樣的Fc片段，因此也可用protein A進行親和層析。親和層析的條件與CD11a基本一致，只是在洗脫時需降低NaCl的用量，梯度洗脫時的用量降到190～210mM，批量洗脫時可用210mM。
在CTLA4Ig純化工藝中，親和層析獲得的重組蛋白需要經過G75分子篩去除部分大分子和小分子雜質，更換緩衝液至pH7.5的100mM磷酸緩衝液，然後上到Q-Sepharose柱上，4體積洗滌後用含250mM NH4SO4的50mM Tris-HCl溶液洗脫。洗脫液可直接上Octyle-O柱進行疏水層析，50mM Tris pH7.5洗脫後即可保存備用。
該方法獲得的樣品純度可達95％以上，總得率在75％以上，是一種比較理想的純化方法。該方法容易放大，適宜工業規模生產。
5.3重組人FLA3Ig融合蛋白的純化一種重組人FLA3Ig融合蛋白的純化工藝流程可以是蛋白A柱→離子交換柱→疏水層析→分子篩。
FLA3Ig融合蛋白的純化與上述CTLA4Ig的純化過程一樣都包含了protein A親和層析，且上樣和洗脫條件一致。洗脫物經過QA-柱進行再次純化，洗脫劑為含250mM NH2SO4的Tris-HCl緩衝液，洗脫液直接上疏水層析柱，洗脫液為50mM Tris-HCl緩衝液。洗脫液經過Sephadex G200 SF進一步分離後，其純度可達98％，總得率為11.7％左右。
該方法具有操作簡便，容易放大的特點，容易進行工業規模的生產。
實施例6免疫功能下調的實驗驗證6.1.抗人CD11a單克隆抗體生理活性和親和力研究(1)生理活性混合淋巴細胞培養試驗對實施例1獲得的細胞株所產生的單克隆抗體，進行了生物學活性檢測。具體方法和結果如下常規分離人外周血淋巴細胞，調整細胞密度為2×106cells/ml，將兩人PBMC(同種異體雙向MLR(mixed lymphocyte responses))等體積混合後以2×105cells/孔接種「U」型96孔培養板，加入不同體積的純化融合蛋白，設置等體積相應空載體轉染上清或培養基作對照，每組3復孔，37℃，5％CO2培養5d，終止培養前16h加入3H-TdR(終濃度5μCi/ml)，收集細胞於0.45μm微孔濾膜上，烘乾，液體閃爍計數儀測DPM值。統計學處理結果以x±s表示，MicrosoftExcel統計程序進行均數差異顯著性分析。
在MLR反應體系中，分別加入1ul、5ul和10ul Protein A純化抗CD11a單克隆抗體表達載體或空載體轉染CHO細胞上清，結果表明，即使加入1ul ProteinA純化表達得單克隆抗體能顯著抑制人外周血MLR，抑制率為66％～75％；而加入同樣體積的空載體轉染的CHO細胞上清，則無此作用。經單因素方差分析，其差異達到極顯著水平，結果見下表4。同樣，我們也曾用未純化的轉染細胞的上清直接進行MLR實驗，未能觀察到顯著的抑制作用，這可能與未純化細胞轉染上清中異源蛋白的刺激作用與微量單抗蛋白的抑制作用相互抵消有關。
表4純化CD11a單克隆抗體對人MLR中淋巴細胞增殖的影響(DPM，n＝3)試驗分組(ul/well) 0 1 5 10純化的單抗CD11-15629±563 2987±198*2237±240*1054±224*Δ純化的單抗CD11-25576±487 3017±206 2144±197 803±217陰性對照5579±367 5367±313 5627±309 5324±306MLR實驗表明該純化融合蛋白具有抑制免疫應答反應的活性。以上結果表明，實施例1成功克隆並在CHO細胞中表達了有生物學活性的抗CD11a單克隆抗體。
上述結果還表明，CD11-2具有比CD11-1更強的抑制作用。
(2)親和力鑑定親和力測定採用Scatchard分析法(Munson et al，1980，Anal.Bio Chem.，107220)進行。
結果表明，CD11-1和CD11-2兩種單抗的親和力分別達到3.2×10-9和8×10-6。上述結果表明，CD11-1和CD11-2兩株單克隆抗體的親和力已經分別達到1nM和0.1nM的水平，CD11-1已經達到國外已經發表的水平，而CD11-2則比國外已經發表的最好結果提高了一個數量級。
6.2重組人CTLA4Ig融合蛋白的生物活性研究(1)CTLAs抑制淋巴細胞增殖能力的研究將上述pMSG[CTLAs-N/Linker/Fc]、pMSG[CTLAs-M/Linker/Fc]、pMSG[CTLAs-M/Fc]、pMSG[CTLAs-N/Fc]的表達細胞株培養後用Protein A-Sepharose進行親和層析，獲得純度達90％以上的融合蛋白。
常規分離人外周血淋巴細胞，調整細胞密度為2×106cells/ml，將兩人PBMC(同種異體雙向MLR)等體積混合後以2×105cells/孔接種「U」型96孔培養板，加入不同量的純化融合蛋白，設置等體積相應空載體轉染上清或培養基作對照，每組3復孔，37℃，5％CO2培養5d，終止培養前16h加入3H-TdR(終濃度5μCi/ml)，收集細胞於0.45μm微孔濾膜上，烘乾，液體閃爍計數儀測DPM值。結果以x±s表示，Microsoft Excel統計程序進行均數差異顯著性分析。
在MLR反應體系中，分別加入1微克、5微克和10微克Protein A純化純化的CTLAs-N/Linker/Fc、CTLAs-M/Linker/Fc、CTLAs-M/Fc、CTLAs-N/Fc或空載體轉染CHO細胞上清，結果表明，即使加入1微克Protein A純化的融合蛋白，也能顯著抑制人外周血MLR，抑制率為60％～70％；而加入同樣體積的空載體轉染CHO細胞上清，則無此作用，經單因素方差分析，結果有統計學意義(見表5)。同樣，也曾用未純化的轉染細胞的上清直接進行MLR實驗，未能觀察到顯著的抑制作用，這可能與未純化細胞轉染上清中異源蛋白的刺激作用與微量融合蛋白的抑制作用相互抵消有關。
表5純化CTLA-4/Ig對人MLR中淋巴細胞增殖的影響(DPM，n＝3) *P＜0.01vs control；ΔP＜0.01 vs 0從以上數據可以看出，加入Linker的融合蛋白比沒有Linker的融合蛋白對人外周血MLR的抑制作用提高了大約1.5倍。這說明，Linker的加入可以明顯提高融合蛋白對淋巴細胞的抑制能力。
6.3重組人FLA3Ig融合蛋白的生物活性研究(1)Jurkat細胞結合試驗Jurkat細胞表面有CD2，以培養的此種細胞，用含有10％胎牛血清的RPMI洗滌三次後製備成5×106細胞/ml的懸液，在一個6孔細胞板每個孔中加入1ml細胞懸液。在3個孔中分別加入10微克純化的FLA3Ig，3個孔中分別介入TNFRIg(陰性對照)。0C溫育4小時後，用RPMI培養基輕輕洗滌2次後，加入HRP標記的羊抗人IgG單克隆抗體，RPMI洗滌4次後加入DAB顯色劑和H2O2，37度溫育10分鐘。在40X和100X相差顯微鏡下觀察細胞顏色反應和細胞相互結合的情況。
結果發現，陰性對照無顯色反應，而FLA3Ig孔中的細胞呈棕色顯色反應。顯微鏡觀察表明，Jurkat細胞有明顯的凝集現象。這種現象是由於FLA3Ig是一個二價分子，部分分子的兩個臂分別結合了一個細胞，從而導致了細胞的凝集。此種反應與凝集素凝集血紅細胞的情況十分相似。
(2)FACS測定在Eppendorf管中加入1×105Jurkat細胞，1000RPM離心收集細胞，重懸浮於100ul濃度為10ug/ml的LFA3Ig溶液中，緩衝液成分為含0.5％BSA的PBS，pH7.2.混合充分後冰浴30分鐘，用上述緩衝液洗滌2次後與100ul 1∶50稀釋的FITC標記的羊抗人IgG單克隆抗體冰浴30分鐘後用PBS洗滌兩次，再重懸於300ul PBS中。上述試驗以TNFRIg為陰性對照。上述重懸的細胞在FACS儀器上進行分析。
結果如圖7所示。陰性對照TNFRIg進行FACS時未出現螢光。從圖7中可以看出，FLA3Ig具有明顯的與Jurkat細胞結合的能力。
(3)MLR反應從兩個無親緣關係的供者各抽取20毫升新鮮血液，Ficoll梯度分離白細胞。其中之一種細胞用2000RADs進行r射線處理。上述兩種細胞均調至3×106細胞/ml。
將兩人PBMC(同種異體雙向MLR)等體積混合後以2×105cells/孔接種「U」型96孔培養板，加入不同量的純化融合蛋白，設置等體積相應空載體轉染上清或培養基作對照，每組3復孔，37℃，5％CO2培養5d，終止培養前16h加入3H-TdR(終濃度5uCi/ml)，收集細胞於0.45um微孔濾膜上，烘乾，液體閃爍計數儀測DPM值。結果以x±s表示，Microsoft Excel統計程序進行均數差異顯著性分析。
在MLR反應體系中，分別加入1微克、5微克和10微克Protein A純化的FLA3Ig-N，FLA3Ig-M或空載體轉染CHO細胞上清(陰性對照)，結果表明，即使加入1微克Protein A純化的融合蛋白，也能顯著抑制人外周血MLR，抑制率為60％～70％；而加入同樣體積的空載體轉染CHO細胞上清，則無此作用，經單因素方差分析，結果有統計學意義(見表6)。同樣，也曾用未純化的轉染細胞的上清直接進行MLR實驗，未能觀察到顯著的抑制作用，這可能與未純化細胞轉染上清中異源蛋白的刺激作用與微量融合蛋白的抑制作用相互抵消有關。
表6純化FLA3Ig對人MLR中淋巴細胞增殖的影響(DPM，n＝3) *P＜0.01vs control；ΔP＜0.01vs 0從上述數據可以看出，FLA3Ig-M的相對活性明顯比FLA3Ig-N高。考慮到二者蛋白質的胺基酸序列完全相同，顯然這種差別是由於表達量不同引起的。這也說明，FLA3Ig-M的DNA編碼序列比FLA3Ig-N的DNA序列更適合CHO細胞中表達。
實施例7臨床應用的動物模型驗證對上述三類6種其中抗體2種(CD11-1和CD11-2)，FLA3Ig 2種(FLA3Ig-N和FLA3Ig-M)，CTLA4/Fc 2種(CTLAs-M/Fc和CTLAs-M/Fc)物質的功能進行了動物模型試驗，主要研究結果如下7.1.對類風溼關節炎模型的治療作用(1)單藥的治療功能上述6種物質各自單獨使用，進行了如下研究。
100.mu.gII型膠原(CII)加入完全弗氏佐劑，皮內注射B10.RIII小鼠，14天後再重複一次，這時小鼠體內出現膠原誘導的類風溼關節炎(CIA)症狀，28天後92％小鼠顯示嚴重的CIA症狀。對小鼠腹膜注射本發明的抗CD11a單克隆抗體，觀測其在小鼠體內對CIA的症狀的影響作用。12周後進行檢測。實驗組小鼠每周3次，每次注射10.mu.g前述製備的6種物質，從第1天到35天；給對照組小鼠注射PBS作為陰性對照。
觀察發現，對照組小鼠均發生關節紅腫、關節僵硬等症狀，在給藥組則只有輕微的腫脹，但未發生關節僵硬等嚴重症狀。這表明6種物質與對照組相比，均能夠顯著降低類風溼的嚴重程度。因此，本發明的單抗有可能開發成為治療類風溼關節炎或其他自身免疫疾病的藥物。
(2).組合用藥的治療功能從前述3類6種藥物中各選1種(CD11-1，FLA3Ig-N和CTLAs-N/Fc)，兩兩組合，進行了上述同樣的模型進行抑制類風溼關節炎的研究，結果如下表7所示。
表7

從上述結果可以看出，當兩種藥物聯合應用時，比單獨應用治療類風溼關節炎的效果要好。
7.2抗免疫排斥試驗—小鼠器官移植試驗(1).單藥的抗排斥試驗上述抗體用於小鼠心臟抑制試驗時，可以明顯提高受試動物的存活率和平均存活天數。下表8顯示了該試驗的結果。供試藥物為抗人CD11a單克隆抗體、FLA3Ig和CTLA4Ig。
正常昆明種小白鼠，雌雄各半，每組12隻。其中6隻為受體，6隻為供體進行心臟移植。
表8

0＝陰性對照空白上清；A＝CD11-1，B＝CTLAs-N/Fc，C＝FLA3Ig，D＝CD11-1+FLA3Ig-N，E＝CD11-1+CTLAs-N/Fc，F＝FLA3Ig-N+CTLAs-N/Fc.
從上述實驗中可以看出，鼠源和人源化的抗人CD11a單克隆抗體、FLA3Ig和CTLA4Ig都能顯著提高器官移植受體的30日存活率和平均存活天數。顯示這些免疫功能下調的藥物具有一定的克服免疫抑制效應的功能，有可能用於抗免疫排斥的藥物開發。
(2)組合用藥的抗排斥試驗上表中的組合藥物試驗中，也顯示了三種藥物具有明顯的抗免疫排斥的作用，其中CD11的效果明顯優於其他藥物。組合藥物的情況下，同樣顯示了含有CD11-1組份時效果明顯提高，且常常表現藥物間明顯的加性效應。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110馬，菁120免疫調節劑及其應用13002742416037170PatentIn version 3.12101211121212PRT213人工序列220
221MISC_FEATURE222(1)..(121)223抗CD11抗體重鏈4001Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His20 25 30Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Ile Tyr Phe Tyr Gly Thr Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 1202102211108212PRT213人工序列220
221MISC_FEATURE222(1)..(108)223抗CD11抗體輕鏈4002Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Thr Ile Ser Lys Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Leu85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 1052103211120212PRT213人工序列220
221MISC_FEATURE222(1)..(120)223抗CD11抗體重鏈4003Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Ile Ser Cys Ala Ser Ser Gly Tyr Ser Thr Thr Gly His20 25 30Trp Ser Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Gly Ile Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Thr Cys Ala85 90 95Arg Gly Ile Tyr Phe Tyr Gly Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Glu100 105 110Gly Tyr Leu Val Thr Val Ser Ser115 1202104211109212PRT213人工序列220
221MISC_FEATURE222(1)..(109)223抗CD11抗體輕鏈4004Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Met Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Thr Ile Ser Lys Tyr20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Pro Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80Gln Asp Phe Ala Thr Tyr Thr Cys Gln Gln His Asn Glu Thr Pro Pro85 90 95Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 1052105211223212PRT213智人(Homo sapiens)4005Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala1 5 10 15Ala Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro20 25 30Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala35 40 45Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly50 55 60Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln65 70 75 80Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Thr Gly Asn Glu Leu Thr85 90 95Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val100 105 110Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile115 120 125Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly130 135 140Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser145 150 155160Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe165 170 175Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys180 185 190Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu195 200 205Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn210 215 2202106211672212DNA213智人(Homo sapiens)220
221misc_feature222(109)..(483)223胞外結構域編碼序列
400
atggcttgcc ttggatttca gcggcacaag gctcagctga acctggctgc caggacctgg 60ccctgcactc tcctgttttt tcttctcttc atccctgtct tctgcaaagc aatgcacgtg 120gcccagcctg ctgtggtact ggccagcagc cgaggcatcg ccagctttgt gtgtgagtat 180gcatctccag gcaaagccac tgaggtccgg gtgacagtgc ttcggcaggc tgacagccag 240gtgactgaag tctgtgcggc aacctacatg acggggaatg agttgacctt cctagatgat 300tccatctgca cgggcacctc cagtggaaat caagtgaacc tcactatcca aggactgagg 360gccatggaca cgggactcta catctgcaag gtggagctca tgtacccacc gccatactac 420ctgggcatag gcaacggaac ccagatttat gtaattgatc cagaaccgtg cccagattct 480gacttcctcc tctggatcct tgcagcagtt agttcggggt tgttttttta tagctttctc 540ctcacagctg tttctttgag caaaatgcta aagaaaagaa gccctcttac aacaggggtc 600tatgtgaaaa tgcccccaac agagccagaa tgtgaaaagc aatttcagcc ttattttatt 660cccatcaatt ga 6722107211387212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(387)223人工設計CTLA DNA序列4007caggctagca tggccatgca cgtggcccag cccgccgtgg tgctggcctc ctcccgcggc 60atcgcctcct tcgtgtgcga gtacgcctcc cccggcaagg ccaccgaggt gcgcgtgacc 120gtgctgcgcc aggccgactc ccaggtgacc gaggtgtgcg ccgccaccta catgaccggc 180aacgagctga ccttcctgga cgactccatc tgcaccggca cctcctccgg caaccaggtg 240aacctgacca tccagggcct gcgcgccatg gacaccggcc tgtacatctg caaggtggag 300ctgatgtacc ccccccccta ctacctgggc atcggcaacg gcacccagat ctacgtgatc 360gaccccgagc cctgccccga ctccgac 387210821158212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(58)223引物4008caggctagca tggccatgca cgtggcccag cccgccgtgg tgctggcctc ctcccgcg58210921132212DNA213人工序列
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221misc_feature222(1)..(32)223引物4009caggctagca tggcaatgca cgtggcccag cc322101021121212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(21)223引物40010gtcagaatct gggcacggtt c212101121175212DNA213人工序列220
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221misc_feature222(1)..(19)223引物40015atggaactgg ggctccgct 19
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221MISC_FEATURE222(1)..(232)223人IgG1 Fc(絞鏈區+CH2+CH3)片段的胺基酸序列40017Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala1 5 10 15Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro20 25 30Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val35 40 45Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val50 55 60Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln65 70 75 80Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln85 90 95Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala100 105 110Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro115 120 125Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr130 135 140Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser145 150 155 160Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr165 170 175Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr180 185 190Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe195 200 205Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys210 215 220Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys225 230
21018211696212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(696)223適合CHO細胞表達的人IgG1 Fc編碼序列40018gagcccaagt cctgcgacaa gacccacacc tgccccccct gccccgcccc cgagctgctg 60ggcggcccct ccgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatctcccgc 120acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgtcccacg aggaccccga ggtgaagttc 180aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagccccg cgaggagcag 240tacaactcca cctaccgcgt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 300ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ccgcccccat cgagaagacc 360atctccaagg ccaagggcca gccccgcgag ccccaggtgt acaccctgcc cccctcccgc 420gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgcctgg tgaagggctt ctacccctcc 480gacatcgccg tggagtggga gtccaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 540cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctgtactcca agctgaccgt ggacaagtcc 600cgctggcagc agggcaacgt gttctcctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 660tacacccaga agtccctgtc cctgtccccc ggcaag69621019211699212DNA213智人(Homo sapiens)40019gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 6992102021131212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(31)223引物
40020gcactcgagt tttacccgga gacagggaga g 312102121123212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(23)223引物40021gagcccaaat cttgtgacaa aac 232102221145212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(45)223引物40022taaccatttc catccataat taatctgagg ttgtctggaa cccag 452102321145212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(45)223引物40023cttattttat tcccatcaat tgaacatgcc caccgtgccc agcac 4521024211900212DNA213智人(Homo sapiens)40024cgacgagcca tggttgctgg gagcgacgcg gggcgggccc tgggggtcct cagcgtggtc 60tgcctgctgc actgctttgg tttcatcagc tgtttttccc aacaaatata tggtgttgtg 120tatgggaatg taactttcca tgtaccaagc aatgtgcctt taaaagaggt cctatggaaa 180aaacaaaagg ataaagttgc agaactggaa aattctgaat tcagagcttt ctcatctttt 240aaaaataggg tttatttaga cactgtgtca ggtagcctca ctatctacaa cttaacatca 300tcagatgaag atgagtatga aatggaatcg ccaaatatta ctgataccat gaagttcttt 360
ctttatgtgc ttgagtctct tccatctccc acactaactt gtgcattgac taatggaagc 420attgaagtcc aatgcatgat accagagcat tacaacagcc atcgaggact tataatgtac 480tcatgggatt gtcctatgga gcaatgtaaa cgtaactcaa ccagtatata ttttaagatg 540gaaaatgatc ttccacaaaa aatacagtgt actcttagca atccattatt taatacaaca 600tcatcaatca ttttgacaac ctgtatccca agcagcggtc attcaagaca cagatatgca 660cttataccca taccattagc agtaattaca acatgtattg tgctgtatat gaatggtatt 720ctgaaatgtg acagaaaacc agacagaacc aactccaatt gattggtaac agaagatgaa 780gacaacagca taactaaatt attttaaaaa ctaaaaagcc atctgatttc tcatttgagt 840attacaattt ttgaacaact gttggaaatg taacttgaag cagctgcttt aagaagaaat 90021025211250212PRT213智人(Homo sapiens)40025Met Val Ala Gly Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ser Val1 5 10 15Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe Ile Ser Cys Phe Ser Gln Gln20 25 30Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn35 40 45Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys Asp Lys Val Ala50 55 60Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser Phe Lys Asn Arg65 70 75 80Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr85 90 95Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro Asn Ile Thr Asp100 105 110Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr115 120 125Leu Thr Cys Ala Leu Thr Asn Gly Ser Ile Glu Val Gln Cys Met Ile130 135 140Pro Glu His Tyr Asn Ser His Arg Gly Leu Ile Met Tyr Ser Trp Asp145 150 155 160Cys Pro Met Glu Gln Cys Lys Arg Asn Ser Thr Ser Ile Tyr Phe Lys165 170 175Met Glu Asn Asp Leu Pro Gln Lys Ile Gln Cys Thr Leu Ser Asn Pro180 185 190Leu Phe Asn Thr Thr Ser Ser Ile Ile Leu Thr Thr Cys Ile Pro Ser195 200 205Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala Leu Ile Pro Ile Pro Leu Ala210 215 220Val Ile Thr Thr Cys Ile Val Leu Tyr Met Asn Gly Ile Leu Lys Cys225 230 235 240Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn245 25021026211347212PRT213人工序列
220
221MISC_FEATURE222(1)..(347)223融合蛋白FLA3Ig40026Met Val Ala Gly Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ser Val1 5 10 15Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe Ile Ser Cys Phe Ser Gln Gln20 25 30Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn35 40 45Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys Asp Lys Val Ala50 55 60Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser Phe Lys Asn Arg65 70 75 80Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr85 90 95Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro Asn Ile Thr Asp100 105 110Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro115 120 125Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro130 135 140Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr145 150 155 160Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn165 170 175Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg180 185 190Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val195 200 205Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser210 215 220Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys225 230 235 240Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp245 250 255Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe260 265 270Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu275 280 285Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe290 295 300Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly305 310 315 320Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr325 330 335Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys340 345210272111041212DNA
213人工序列220
221misc_feature222(1)..(1041)223融合蛋白FLA3Ig的編碼序列40027atggttgctg ggagcgacgc ggggcgggcc ctgggggtcc tcagcgtggt ctgcctgctg 60cactgctttg gtttcatcag ctgtttttcc caacaaatat atggtgttgt gtatgggaat 120gtaactttcc atgtaccaag caatgtgcct ttaaaagagg tcctatggaa aaaacaaaag 180gataaagttg cagaactgga aaattctgaa ttcagagctt tctcatcttt taaaaatagg 240gtttatttag acactgtgtc aggtagcctc actatctaca acttaacatc atcagatgaa 300gatgagtatg aaatggaatc gccaaatatt actgatacca tgaagttctt tctttatgtc 360gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 420ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 480tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 540ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 600cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 660tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 720gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 780aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 840tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 900gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 960aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1020ctctccctgt ctccgggtaa a1041210282111041212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(1041)223密碼子優化的FLA3-Ig融合蛋白基因40028atggtggccg gctccgacgc cggccgcgcc ctgggcgtgc tgtccgtggt gtgcctgctg 60cactgcttcg gcttcatctc ctgcttctcc cagcagatct acggcgtggt gtacggcaac 120gtgaccttcc acgtgccctc caacgtgccc ctgaaggagg tgctgtggaa gaagcagaag 180gacaaggtgg ccgagctgga gaactccgag ttccgcgcct tctcctcctt caagaaccgc 240gtgtacctgg acaccgtgtc cggctccctg accatctaca acctgacctc ctccgacgag 300gacgagtacg agatggagtc ccccaacatc accgacacca tgaagttctt cctgtacgtg 360gacaagaccc acacctgccc cccctgcccc gcccccgagc tgctgggcgg cccctccgtg 420ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatct cccgcacccc cgaggtgacc 480tgcgtggtgg tggacgtgtc ccacgaggac cccgaggtga agttcaactg gtacgtggac 540ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag ccccgcgagg agcagtacaa ctccacctac 600cgcgtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 660tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcccgcc cccatcgaga agaccatctc caaggccaag 720ggccagcccc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcccccct cccgcgacga gctgaccaag 780aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaag ggcttctacc cctccgacat cgccgtggag 840
tgggagtcca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccccgt gctggactcc 900gacggctcct tcttcctgta ctccaagctg accgtggaca agtcccgctg gcagcagggc 960aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1020ctgtccctgt cccccggcaa g10412102921120212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(20)223引物40029atggttgctg ggagcgacgc 202103021121212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(21)223引物40030tttacccgga gacagggaga g212103121126212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(26)223引物40031gctagcatgg ttgctgggag cgacgc 262103221140212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(40)223引物40032
gaagttcttt ctttatgtcg acaaaactca cacatgccca402103321140212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(40)223引物40033tgggcatgtg tgagttttgt cgacataaag aaagaacttc402103421129212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(29)223引物40034tttacccgga gacagggaga ggcctcgag292103521125212PRT213人工序列220
221MISC_FEATURE222(1)..(25)223接頭序列40035Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ala1 5 10 15Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser20 252103621175212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(75)223接頭序列的編碼序列40036
accacaacct cgtcaaccac aacctcgtca accacaacct cgtcaaccac aacctcgtca 60accacaacct cgtca 7521037211120212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(120)223接頭肽的編碼序列及兩側序列40037cttattttat tcccatcaat tgaaccacaa cctcgtcaac cacaacctcg tcaaccacaa 60cctcgtcaac cacaacctcg tcaaccacaa cctcgtcaac atgcccaccg tgcccagcac 120
權利要求
1.一種免疫調節劑，其特徵在於，它選自下組(a)抗人CD11a單克隆抗體，所述的抗人CD11a單克隆抗體具有SEQ ID NO1或3所示的重鏈序列，和/或SEQ ID NO2或4所示的輕鏈序列；(b)FLA3Ig融合蛋白，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO25中第1-120位所示的FLA3的CD2結合區和SEQ ID NO26中第121-347位所示的人IgG1的Fc片段；(c)CTLA4Ig融合蛋白，其特徵在於，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO5中第37-161位所示的CTLA-4R胞外結構域、和SEQ ID NO17所示的人IgG1的Fc片段。
2.如權利要求1所述的免疫調節劑，其特徵在於，所述的抗人CD11a單克隆抗體具有人IgG1恆定區。
3.如權利要求1所述的免疫調節劑，其特徵在於，所述的FLA3Ig融合蛋白具有SEQ ID NO26所示的胺基酸序列。
4.如權利要求1所述的免疫調節劑，其特徵在於，所述的CTLA4Ig融合蛋白在CTLA-4R胞外結構域和人IgG1的Fc片段之間還具有SEQ ID NO35所示的連接肽。
5.一種分離編碼權利要求1所述的免疫調節劑的DNA分子。
6.如權利要求5所述的DNA分子，其特徵在於，具有SEQ ID NO27或28所示的核苷酸序列。
7.一種藥物組合物，其特徵在於，它含有藥學上可接受的載體和權利要求1所述的免疫調節劑。
8.如權利要求7所述的藥物組合物，其特徵在於，含有免疫調節劑(a)、(b)和(c)中的2-3種免疫調節劑。
9.如權利要求8所述的藥物組合物，其特徵在於，含有以下二種免疫調節劑(a)抗人CD11a單克隆抗體，所述的抗人CD11a單克隆抗體具有SEQ ID NO1或3所示的重鏈序列，和/或SEQ ID NO2或4所示的輕鏈序列；和(b)FLA3Ig融合蛋白，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO26中第1-120位所示的FLA3的CD2結合區和SEQ ID NO26中第121-347位所示的人IgG1的Fc片段。
10.如權利要求1所述的免疫調節劑的用途，其特徵在於，用於製備治療自身免疫疾病和抗免疫排斥的藥物。
全文摘要
本發明公開了一類免疫調節劑，這些免疫調節劑可通過免疫抑制作用治療自身免疫疾病或應用於器官移植等臨床病症。
文檔編號A61K39/395GK1520884SQ0311539
公開日2004年8月18日 申請日期2003年2月14日 優先權日2003年2月14日
發明者馬菁, 菁 馬 申請人:馬菁, 菁 馬