一種用於檢測人視黃醇結合蛋白4的抗體複合物及免疫層析檢測卡和試劑盒的製作方法

2023-06-10 12:52:16 1

專利名稱：一種用於檢測人視黃醇結合蛋白4的抗體複合物及免疫層析檢測卡和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，具體為檢測人視黃醇結合蛋白4的抗體複合物及免疫層析檢測卡。
背景技術：
視黃醇結合蛋白(Retinol Binding Protein, RBP)是ー類在人體內負責從肝臟轉運視黃醇至各組織細胞的運載蛋白，對視黃醇生理功能的發揮起著重要作用。RBP主要在肝臟中合成。肝臟中分泌的RBP-視黃醇聚合物與轉鐵蛋白(Transthyretin, TTR)形成穩定的蛋白複合物在血液系統中循環。RBP-視黃醇-TTR複合體在視黃醇釋放後解體，RBP以游離形式存在於血液系統中，由腎小球濾過，再由近端小管上皮細胞重吸收、降解。因此正常人尿液中幾乎不含有RBP (含量低於300ng/ml)。若腎小管病變，則重吸收功能下降，會導致尿液中的RBP大量上升。因此，在腎小管損傷病人尿液中RBP含量大於300ng/ml，一般可達到正常人的5倍以上，嚴重者其尿液中的RBP含量甚至可以達到10000ng/ml以上。故尿液中RBP增高具有早期診斷意義，被認為是腎小管損傷的ー個良好的早期標誌物，對RBP的檢測已經被廣泛應用於臨床上對腎臟損傷的診斷中。目前，醫院常用的檢測RBP的方法是基於免疫比濁法或酶聯免疫吸附法(ELISA)。但上述方法步驟比較繁瑣，測量時間較長，結果易受操作者技術水平等的影響，不確定性因素較多。而且要求操作者具有一定的操作技能，同時配備酶標儀，因此檢測成本相對較高。為了達到簡便、快速、高效和經濟的檢測尿RBP的要求，我們提出開發視黃醇結合蛋白4檢測試劑盒(膠體金免疫層析法)，意在建立一種腎小管損傷診斷的新技木。另外，通過專利檢索，發現目前沒有通過使用膠體金免疫層析法檢測RBP4來診斷腎小管損傷的相關試劑盒專利。

發明內容
本發明g在提供一種用於檢測人視黃醇蛋白4的抗體複合物。本發明還提供了人視黃醇結合蛋白4的免疫層析檢測卡及試劑盒。一種用於檢測人視黃醇蛋白4的抗體複合物，其製備方法包括以下步驟將人視黃醇蛋白4 (RBP4)單克隆抗體I標記於膠體金顆粒表面將含有膠體金顆粒的溶液PH調節至8. 2 8. 7，加入人視黃醇蛋白4單克隆抗體I，震蕩反應5 15分鐘，用BSA封閉後離心，沉澱用硼酸緩衝液重懸後再次離心純化；棄去上清取下層液體，即得到人視黃醇蛋白4的抗體複合物。膠體金顆粒的粒徑為10 30nm,優選20nm。人視黃醇蛋白4 (RBP4)單克隆抗體I與膠體金顆粒用量比為I 8μ g :lmg,優選為5 μ g :lmg ;膠體金顆粒溶液濃度為0. 5 2mg/mL,優選為lmg/mL。所得到的用於檢測人視黃醇蛋白4的抗體複合物可用於製備檢測視黃醇結合蛋白4的試劑及試劑盒。所得到的用於檢測人視黃醇蛋白4的抗體複合物進ー步用來製備視黃醇結合蛋白4的免疫層析檢測卡其結構包括結合墊、樣品墊、分析膜和吸水紙，分析膜上包括檢測線(T線)和質控線(C線)。結合墊的製備方法為用於檢測人視黃醇蛋白4的抗體複合物與膠體金稀釋液混合(用於檢測人視黃醇蛋白4的抗體複合物與膠體金稀釋液的混合體積比為1:15 30，優選為1:20)後噴在結合墊材料上，結合墊的材料選自玻璃纖維素膜；膠體金稀釋液為O. 03 O. 08mol/L、pH=7. 8 8. 2 的 Tris-HCl 緩衝液，含 O. 5% I. 0%BSA, O. 3% O. 8% 聚こ烯基吡咯烷酮PVP，O. 2% O. 5%聚こ烯醇PEG，I. 0% 3. 0%蔗糖，O. 1% O. 3%吐溫-20 ；聚こ烯醇的分子量為10000 25000。樣品墊的製備方法為樣品墊材料用處理液浸泡並乾燥，樣品墊材料選自玻璃纖維素膜；處理液為pH=7. 2 7. 4,0. 01 O. 02mol/L的磷酸緩衝液，含O. 5% I. 0%BSA,O. 3% O. 8%こ烯基吡咯烷酮，O. 1% O. 3%吐溫-20。分析膜的製備方法為在分析膜上噴點RBP4單克隆抗體2和羊抗鼠IgG抗體，羊抗鼠IgG抗體在上形成質控線(C線)，RBP4單克隆抗體2在下形成檢測線(T線)，烘乾；分析膜的材料為硝酸纖維素膜(NC膜)。將上述樣品墊、結合墊、分析膜和吸水紙依次粘貼在底板上，切成4mm寬的檢測試紙條並裝在塑料外殼中，得到人視黃醇結合蛋白4的免疫層析檢測卡。一種視黃醇結合蛋白4檢測試劑盒，包括上述視人黃醇結合蛋白4的免疫層析檢測卡、一次性塑料滴管和樣品稀釋液，樣品稀釋液為PH7. 2 7. 4,0. 005 O. 02mol/L的磷酸緩衝液，含有3% 6%BSA和O. 3% O. 5%防腐剤。本發明的視黃醇結合蛋白4檢測試劑盒，利用膠體金免疫層析法，是ー種快速、簡便、無創的檢測試劑通過將抗原-抗體免疫學反應與層析技術相結合，並以乾片法試紙的形式，達到對尿液中RBP4含量的定性及定量檢測，是ー種用於臨床輔助診斷和體檢篩查的檢測方法。該免疫層析檢測試劑盒靈敏度好，特異性強。


圖I為人黃醇結合蛋白4的免疫層析檢測卡的結構示意圖其中I一樣品塾，2—結合塾，3—分析膜，31—檢測線(T線),32—質控線(C線)，4一吸水紙,5—底板。
具體實施例方式試劑RBP4單克隆抗體I和RBP4單克隆抗體2 (上海柏納生物技術有限公司);膠體金，顆粒粒徑20nm。實施例I :膠體金-RBP抗體複合物的製備
用O. ImoVLK2CO3將Iml濃度為lmg/mL的膠體金(顆粒粒徑20nm)溶液pH調至8. 5，然後將5μ g RBP4單克隆抗體I加入到膠體金溶液中，室溫震蕩反應10分鐘，然後用10%BSA溶液封閉，低溫離心，用濃度O. 002mol/L、pH=9. O硼酸緩衝液重懸至原體積，再次離心純化，棄去上清，取下層液體4°C保存。
實施例2 :視黃醇結合蛋白4 (RBP4)免疫層析檢測卡的製備2. I樣品墊的製備選用玻璃纖維素膜作為樣品墊材料，將其放入處理液(pH=7. 4、0· OlM磷酸緩衝液PBS,含O. 5% I. 0%BSA, O. 3% 0· 8%こ烯基吡咯烷酮PVP，O. 1% O. 3%吐溫-20)中浸泡10分鐘後取出，37°C烘乾備用。2. 2結合墊的製備選用玻璃纖維素膜作為結合墊材料，將上述實施例I所製備的膠體金-RBP抗體複合物按1:20的體積比重新分散於膠體金稀釋液(O. 05mol/L、pH=8. OTris-HCl緩衝液，含O. 5% I. 0%BSA, O. 3% O. 8%聚こ烯基吡咯烷酮，O. 2% O. 5%聚こ烯醇2萬，I. 0% 3. 0%蔗糖，O. 1% O. 3%吐溫-20，均為重量百分比)中，並噴於結合墊上，37°C烘乾。2. 3硝酸纖維素膜(NC膜)的包被，製備分析膜用點膜儀在NC膜的不同位置噴點RBP4單抗2及羊抗鼠IgG抗體，自下至上依次為質控線(羊抗鼠IgG抗體)、檢測線(RBP4單抗2)，37°C烘乾，如圖I所示。2. 4組裝將吸水紙、分析膜、結合墊、樣品墊依次貼在帶有粘合劑的底板上，如圖I所示；並切成4cm寬的試紙條，裝在塑料外殼中(即裝卡)。實施例3 :樣品稀釋液的製備配製一定濃度的磷酸緩衝液PBS (O. 01mol/L, pH7. 2 7· 4)，添加適量的保護蛋白BSA (終濃度5%)，最後加入防腐劑Proclin 300 (O. 3% O. 5%)。將配好的樣品稀釋液按15mL的量分裝到塑料試劑瓶中即得到RBP4樣品稀釋液。實施例4 :膠體金免疫層析法視黃醇結合蛋白4 (RBP4)檢測試劑盒的製備4. I將實施例2製備的人視黃醇結合蛋白4 (RBP4)免疫層析檢測卡、一次性塑料滴管和乾燥劑一起裝入鋁箔袋中，封ロ機封ロ，得到I人份的檢測試劑。4. 2將20人份檢測試劑、I瓶樣品稀釋液以及I份說明書裝在包裝盒中。實施例5 =RBP標準溶液的檢測5. I將RBP4標準品用PBS作為稀釋液配置成系列標準液250ng/mL、300ng/mL，500ng/mLo5. 2將上述標準液分別準確稀釋60倍，用一次性塑料滴管分別吸取2滴標準液滴加到檢測卡的加樣孔中，10分鐘後觀測結果。結果為陽性則質控線和檢測線均顯紅色；結果為陰性則質控線顯色，檢測線不顯色。實施例6 :性能測試6. I靈敏度對同一批試劑盒用標準溶液進行檢測，實驗結果為250ng/mL時為陰性，300ng/mL時為弱陽性，500ng/mL時為陽性，即靈敏度為300ng/mL。6. 2特異性取同一批試劑盒，對5例陰性質控品進行檢測，陰性質控品分別為尿微量白蛋白(20000ng/ml)、轉鐵蛋白(2 X 106ng/ml)、纖維連接蛋白(300ng/ml)、β 2-微球蛋白(200ng/ml)、溶菌酶(2000ng/ml)，檢測結果100%為陰性。6. 3.重複性6. 3. I批內差異
取同一批號試劑盒，分別檢測300ng/mL和500ng/mL陽性質控品各5次,檢測結果100%為陽性，反應結果應一致，顯色應均一；質控線顯色，檢測線顯色為紅色。6. 3. 2批間差異取3個批號的試劑盒檢測500ng/ml陽性樣本各5次，檢測結果100%為陽性，反應結果應一致，顯色應均一；質控線顯色，檢測線顯色為紅色。6. 4.穩定性 試劑盒在37°C條件放置20d後，靈敏度和重複性結果依然符合6. 1-6. 3。
權利要求
1.一種用於檢測人視黃醇蛋白4的抗體複合物，其特徵在於，製備方法為將人視黃醇蛋白4單克隆抗體I標記於膠體金顆粒表面，包括以下步驟 將含有膠體金顆粒的溶液PH調節至8. 2 8. 7，加入人視黃醇蛋白4單克隆抗體1，震蕩反應5 15分鐘，封閉後離心、沉澱重懸後再次離心純化。
2.權利要求I所述用於檢測人視黃醇蛋白4的抗體複合物，其特徵在於，所述膠體金顆粒的粒徑為10 30nm，含有膠體金顆粒的溶液濃度為O. 5 2mg/mL。
3.權利要求I所述用於檢測人視黃醇蛋白4的抗體複合物，其特徵在幹，人視黃醇蛋白4單克隆抗體I與膠體金顆粒用量比為I 8μ g :lmg。
4.權利要求I所述用於檢測人視黃醇蛋白4的抗體複合物，其特徵在於，用pH=8.5 9. 5、濃度為O. 001 O. 005mol/L的硼酸緩衝液重懸沉澱。
5.人視黃醇結合蛋白4的免疫層析檢測卡，其特徵在於，結構包括結合墊、樣品墊、分析膜和吸水紙，分析膜上包括檢測線和質控線； 所述的結合墊上含有權利要求I 4任一項所述的用於檢測人視黃醇蛋白4的抗體複合物； 所述的檢測線上含有人視黃醇蛋白4單克隆抗體2。
6.權利要求5所述人視黃醇結合蛋白4的免疫層析檢測卡，其特徵在於，所述質控線上含有羊抗鼠IgG抗體。
7.權利要求5所述人視黃醇結合蛋白4的免疫層析檢測卡，其特徵在於，所述結合墊的製備方法為用於檢測人視黃醇蛋白4的抗體複合物與膠體金稀釋液混合按1:15 30的體積比混合後噴在結合墊材料上； 樣品墊的製備方法為樣品墊材料用處理液浸泡並乾燥。
8.權利要求7所述人視黃醇結合蛋白4的免疫層析檢測卡，其特徵在於，樣品墊材料選自玻璃纖維素膜；結合墊材料選自玻璃纖維素膜；處理液為pH=7. 2 7. 5,0. 005 0.02mol/L的磷酸緩衝液，含O. 5% I. 0%BSA，0. 3% O. 8%聚こ烯基吡咯烷酮，O. 1% O. 3%吐溫-20 ； 膠體金稀釋液為O. 03 O. 08mol/L、pH=7. 8 8. 2的Tris-HCl緩衝液，含O. 5% 1.0%BSA, O. 3% O. 8%聚こ烯基吡咯烷酮，O. 2% O. 5%聚こ烯醇，I. 0% 3. 0%蔗糖，O.1% O. 3%吐溫-20，聚こ烯醇的分子量為10000 25000。
9.一種檢測人視黃醇結合蛋白4的試劑盒，其特徵在於，包括權利要求5 8任ー項所述的人視黃醇結合蛋白4的免疫層析檢測卡和樣品稀釋液，所述樣品稀釋液為pH7. 2 7.4,0. 005 O. 02mol/L的磷酸緩衝液，含有3% 6%BSA和O. 3% O. 5%防腐剤。
10.權利要求I 4任一項所述的用於檢測人視黃醇蛋白4的抗體複合物在製備檢測人視黃醇蛋白4的試劑方面的應用。
全文摘要
本發明涉及生物醫藥領域，具體為檢測人視黃醇結合蛋白4的抗體複合物及免疫層析檢測卡，將人視黃醇結合蛋白4單克隆抗體1與膠體金顆粒連接，得到的抗體複合物用來製備人視黃醇結合蛋白4疫層析檢測卡和試劑盒，具有靈敏度好，特異性強等優點。
文檔編號G01N33/558GK102650642SQ20121014159
公開日2012年8月29日 申請日期2012年5月8日 優先權日2012年5月8日
發明者沈鶴柏, 邢國傑 申請人:上海師範大學