抗體片段修飾的微梁製備方法和基於抗體片段修飾的微梁免疫傳感檢測系統的製作方法

2023-06-10 21:05:11

專利名稱：抗體片段修飾的微梁製備方法和基於抗體片段修飾的微梁免疫傳感檢測系統的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗體片段修飾的微懸臂梁(以下也簡稱為微梁)，及其製備方法。本發明還公開了基於所述抗體片段修飾的微梁的免疫傳感檢測系統和檢測方法，所述系統和方法可應用於食品安全、環境汙染、生物醫學、科學研究和生產製造等領域的監控和檢測。
背景技術：
免疫傳感技術的原理是基於檢測抗原抗體的特異性配對反應，即針對需要檢測的某種靶標分子(抗原)，通過生物免疫(把抗原注入小動物體內產生的)方法,產生出相應的探針分子(抗體)，提取、純化出這種探針分子，再利用抗原抗體的特異性結合去檢測樣品中的靶分子。已有的免疫傳感技術如酶聯免疫吸附試驗(ELISA，原理是利用抗原與抗體的特異性反應與酶標的催化放大來進行)和免疫螢光法(IF，原理是用螢光片段標記抗 原或抗體)，均需要標記物來示蹤抗原抗體的反應結果，就是說僅有抗體，並不能建立相應的檢測方法，還需要有酶標物或螢光標記物或蛋白複合物。而一些難製備的靶標分子的標記物價格昂貴，或幾乎不可能製備或購買。同時酶聯免疫試劑盒和蛋白晶片的檢測從原理操作上都要求每一步反應完後進行清洗，標記過程繁瑣耗時，是事後的檢測，不能實時，原位、在線的檢測。基於表面應力檢測的微懸臂梁免疫傳感技術是近年出現的一種新的免疫生化傳感方法[1]，其原理是把探針(抗原或抗體)分子用直接或間接的方式固定(修飾)到微梁一側的鍍金層上，當被檢測樣品液中的靶分子與微梁金表面上的探針分子發生免疫生化反應時，會使微梁表面應力改變，從而導致微梁彎曲變形，通過光學或電學方法檢測這種變形的過程，可得到免疫生化反應的實時信息。基於免疫特異性識別建立的微梁免疫傳感技術與傳統的需要標記物的免疫傳感方法相比，它無需使用任何酶標、螢光物質和放射性作為反應示蹤劑，消除了標記過程的影響，靈敏度高(比酶聯免疫試驗高數倍[2_4])，還可以通過監測微梁變形來實時、定量的監測抗原抗體的反應過程，得到更豐富的免疫生化反應的信息。經過這些年的發展，微梁傳感被作為一種新興技術，在生物工程和環境汙染監測技術等方面與傳統的方法進行對比研究，如RNA轉錄因子、酶、汞排放及揮發性化合物等，優於常規的酶聯免疫方法。但即使如此，微懸臂梁免疫傳感技術的檢測靈敏度還不足以在成本方面獲得相對於常規酶聯免疫法的巨大優勢，即如果微懸臂梁免疫傳感技術的靈敏度或檢測極限只比酶聯免疫法高數倍，而微懸臂梁免疫傳感技術的設備成本與酶聯免疫相對較高，使得微懸臂梁免疫傳感技術難以商業化。目前，國內外文獻報導的方法主要是利用具有雙功能基團的疏基化試劑的疏基(-SH)抓住微梁表面的金表面，和另一功能團抓住抗體，實現抗體在微梁鍍金層上的固定。例如先將巰基化試劑11-羧酸硫醇結合到微梁的金表面，活化其上的羧基，使之與抗體上的氨基結合來固定抗體(圖2)。或用一種巰基化試劑鹽酸硫醇亞胺，通過與抗體反應，使抗體連接一個帶巰基的分子基團，再通過這個巰基將抗體聯結到微梁的金表面上(中國專利CN101407548)(見圖3)。這些方法固定抗體，存在如下共同的問題，(I)Y字形抗體(見圖I)的Fe段或Fab段的頂端部，會等概率的被固定在金表面上(見圖2、3)，沒有方向性[5]。而當Fab段的頂端被固定在金表面上時，結合位點被遮擋，限制了抗體的抗原結合位點與抗原的充分結合，從而降低了微梁傳感靈敏度；(2)抗體與微梁之間存在不同數目C原子的單鏈分子，降低了抗原抗體反應產生的應力傳遞到梁上的效率。由此可見，中國專利CN101407548中公開的方法的靈敏度與酶聯免疫法相比僅提高數倍，還無法達到商業化或用於極微量被分析物的檢測。因此，在本領域中存在著改進微梁表面與抗體的結合和設計從而進一步提高微梁免疫傳感靈敏度和效率的需求。

發明內容
綜上所述，在已有的微梁免疫傳感技術報導中，最突出的問題就是檢測靈敏度。影響微梁免疫傳感器靈敏度的因素主要有三個方面①抗體的靈敏度(或抗體與抗原結合的親和性)、②微梁上抗體的固定方法和③微梁的設計與信號讀出。由於抗體的靈敏度和微梁的規格與信號讀出方式在微梁免疫傳感器系統成型之後就無法改變，唯一可變的是微梁表面抗體的固定方法。一種合適的微梁表面抗體的修飾方法，能使固定在微梁表面的抗體與樣品溶液中的抗原充分結合，並能高效地將抗原抗體結合所產生的應力變化傳遞到微梁表面。抗體在微梁表面固定的方向性、密度、活性以及抗體與微梁表面之間的聯接分子的長度與剛性都有可能影響最終檢測的靈敏度。鑑於現有技術中存在的問題，本發明用於解決上述問題的技術方案是通過I)減少抗體分子結合位點以外的抗體分子質量和體積，2)取消使用連接微梁鍍金表面與抗體分子的過渡分子層(巰基化試劑)，3)提供一種製備鍍金表面上定向固定有抗體片段的微梁的方法，達到提高微梁免疫檢測方法的靈敏度目的。抗體Ig分子的結構示意圖如圖1，包括兩個相同的抗原結合片段(Fab)和一個可結晶片段(Fe), Fab和Fe通過中間的鉸鏈區連接,構成Y字形結構。Fab的頂端為與抗原分子的結合位點。在免疫球蛋白抗體分子的「Y」字形四肽鏈結構(圖I)中，由兩條完全相同的重鏈和兩條完全相同的輕鏈以二硫鍵連接而成。對於Fe段修飾在微梁的鍍金表面上時(抗體修飾的定向性好)，抗體對稱(Fab段)的兩個上端部抗原結合位點與抗原結合後產生的應力，通過抗體Y字型的腿部(Fe段)傳遞到鍍金微梁表面。抗體(IgG)的分子量約150kDa，如果被檢測的抗原分子分子量為數百Da，抗體抗原質量比近1000。參與抗原分子結合的位點由重鏈和輕鏈的高變區(VH和VL)構成，其與抗原分子的質量比約150，而抗體分子上不參加與抗原分子結合的Fe段，其與抗原分子的質量比近400。因此我們設想，如果能夠減少結合位點以外的抗體分子質量和體積，保持抗體的結合位點朝向固定表面的外法線方向，就能夠提高應力的傳遞效率和抗體在微梁表面的有效修飾密度，從而提高微梁免疫傳感的靈敏度。為此，在第一個方面，本發明提供了一種製備微懸臂梁的方法，包括以下步驟I)提供抗體和帶有鍍金層的微懸臂梁；2) 二硫鍵還原步驟使用二硫鍵還原劑處理所述抗體，使得所述抗體鉸鏈區的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個對稱的帶有巰基的半抗體片段；
3)固定步驟將步驟2)獲得的半抗體片段與鍍有金層的微懸臂梁結合，得到鍍金表面上固定有所述半抗體片段的微懸臂梁。在第二個方面，本發明還提供了一種製備微懸臂梁的方法，包括以下步驟I)提供抗體和帶有鍍金層的微懸臂梁；2)酶解步驟用蛋白酶將所述抗體裂解成F(ab』)2片段和多個小分子片段，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其組合；3) 二硫鍵還原步驟使用二硫鍵還原劑處理所述F(ab』)2片段，使得所述抗體鉸鏈區的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個對稱的帶有巰基的Fab』片段；4)固定步驟將步驟3)獲得的Fab』片段與鍍有金層的微懸臂梁結合，得到鍍金表面上固定有所述Fab』片段的微懸臂梁。 在第三個方面，本發明還提供了一種製備微懸臂梁的方法，包括以下步驟I)提供抗體和帶有鍍金層的微懸臂梁；2) 二硫鍵還原步驟使用二硫鍵還原劑處理所抗體，使得所述抗體鉸鏈區的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個對稱的帶有巰基的半抗體片段；3)酶解步驟用蛋白酶將所述半抗體片段裂解成Fab』片段和多個小分子片段，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其組合；4)固定步驟將步驟3)獲得的Fab』片段與鍍有金層的微懸臂梁結合，得到鍍金層上固定有所述Fab』片段的微懸臂梁。在第四個方面，本發明提供了一種應力傳感元件，其包括基於應力的微懸臂梁，所述微懸臂梁的鍍金層上固定有抗體的半抗體片段或Fab』片段。所述微懸臂梁優選通過本發明的方法製備而成。在第五個方面，本發明提供了一種基於應力的微懸臂梁免疫傳感檢測系統，其包括本發明的應力傳感元件。在第六個方面，本發明提供了一種使用微懸臂梁傳感檢測系統免疫傳感檢測待測樣品的方法，包括以下步驟I)提供對靶抗原特異的抗體和微懸臂梁傳感檢測系統，所述微懸臂梁傳感檢測系統包括反應池和帶有鍍金層的基於應力的微懸臂梁；2)使用二硫鍵還原劑處理所述抗體，使得所述抗體鉸鏈區的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個對稱的帶有巰基的半抗體片段；3)將步驟2)獲得的半抗體片段與鍍有金層的微懸臂梁結合，得到鍍金層上固定有所述半抗體片段的微懸臂梁；4)將步驟3)獲得的固定有所述半抗體片段的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感檢測系統的反應池中；5)將待測樣品加入至步驟4)獲得的微懸臂梁傳感檢測系統中，檢測待測樣品中是否存在所述靶抗原。在第七個方面，本發明還提供了一種使用微懸臂梁傳感檢測系統免疫傳感檢測待測樣品的方法，包括以下步驟I)提供對靶抗原特異的抗體和微懸臂梁傳感檢測系統，所述微懸臂梁傳感檢測系統包括反應池和帶有鍍金層的基於應力的微懸臂梁；
2)用蛋白酶將所述抗體裂解成F(ab』)2片段和多個小分子片段，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其組合；3)使用二硫鍵還原劑處理所述F (ab』)2片段，使得所述抗體鉸鏈區的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個對稱的帶有巰基的Fab』片段；4)將步驟3)獲得的Fab』片段與鍍有金層的微懸臂梁結合，得到鍍金層上固定有所述Fab』片段的微懸臂梁；5)將步驟4)獲得的固定有所述Fab』片段的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感檢測系統的反應池中；6)將待測樣品加入至步驟5)獲得的微懸臂梁傳感檢測系統中，檢測待測樣品中是否存在所述靶抗原。在第八個方面，本發明還提供了一種使用微懸臂梁傳感檢測系統免疫傳感檢測待測樣品的方法，包括以下步驟I)提供對靶抗原特異的抗體和微懸臂梁傳感檢測系統，所述微懸臂梁傳感檢測系統包括反應池和帶有鍍金層的基於應力的微懸臂梁；2)使用二硫鍵還原劑處理所述抗體，使得所述抗體鉸鏈區的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個對稱的帶有巰基的半抗體片段；3)用蛋白酶將所述半抗體片段裂解成Fab』片段和多個小分子片段，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其組合；4)將步驟3)獲得的Fab』片段與鍍有金層的微懸臂梁結合，得到鍍金層上固定有所述Fab』片段的微懸臂梁；5)將步驟4)獲得的固定有所述Fab』片段的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感檢測系統的反應池中；6)將待測樣品加入至步驟5)獲得的微懸臂梁傳感檢測系統中，檢測待測樣品中是否存在所述靶抗原。本發明的有益效果鑑於微梁免疫傳感檢測技術中抗體固定的重要性及巰基化試劑參與抗體固定的複雜性，本發明用二硫鍵還原劑將抗體拆分成帶有巰基的對稱的半抗體片段，或在拆分之前或之後通過蛋白酶消化從而獲得Fab』片段，然後將獲得的半抗體片段或Fab』片段通過自帶的雙巰基固定到微梁的金表面上。結果表明，本發明的方法與現有的微梁免疫方法相比較具有以下優點I)半抗體片段或Fab』片段通過自帶的雙巰基，直接固定到微梁鍍金表面，一步完成，操作簡單；2)半抗體片段或Fab』片段與微梁表面之間沒有附加的其它的分子，有利於應力傳遞；3)減少了抗體抗原結合位點以外的抗體分子質量和體積；4)減小了抗體的抗原結合位點到梁表面距離，提高應力的傳遞效率；5)半抗體片段或Fab』片段與微梁表面之間的雙巰基固定的較單巰基分子鏈聯結的剛性要大，更有益於抗原抗體反應的作用力傳遞到梁上；6)通過自身雙巰基一步完成固定，固定的抗原結合位點密度高,穩定性好；
7)鍍金表面上固定的抗體的方向性好，易於與抗原結合。


圖I為典型的抗體分子結構示意圖。圖2為羧酸硫醇類化合物和雙功能交聯劑法固定抗體示意圖。圖3為鹽酸硫醇亞胺法固定抗體示意圖。圖4為基於自身巰基(-SH)定向固定半抗體片段示意圖。圖5胃蛋白酶水解抗體形成抗體F (ab 』)2片段示意圖。圖6為通過自身巰基(-SH)定向固定抗體Fab』片段示意圖。·
圖7為先用巰基乙胺將抗體拆分成半抗體，再用胃蛋白酶水解半抗體形成抗體Fab』片段,最後通過自身巰基(-SH)定向固定抗體Fab』片段示意圖。圖8為抗人參皂苷GS-Re巰基化抗體修飾微梁，檢測不同濃度抗原時微梁尖端的時間位移曲線。圖9為抗人參皂苷GS-Re半抗體片段修飾微梁，檢測不同濃度抗原時微梁尖端的時間位移曲線。
具體實施例方式定義抗體抗體(antibody)指機體的免疫系統在抗原刺激下，由B淋巴細胞或記憶細胞增殖分化成的漿細胞所產生的、可與相應抗原發生特異性結合的免疫球蛋白。典型的抗體分子具有4條多肽鏈的對稱結構，包括2條較長、相對分子量較大的相同的重鏈(H鏈)；2條較短、相對分子量較小的相同的輕鏈(L鏈)。鏈間由二硫鍵和非共價鍵聯結形成一個由4條多肽鏈構成的單體分子。輕鏈有K和λ兩種,重鏈有μ、δ、Y、ε和α五種。整個抗體分子可分為恆定區和可變區兩部分。在給定的物種中，不同抗體分子的恆定區都具有相同的或幾乎相同的胺基酸序列。可變區位於"Y"的兩臂末端。在可變區內有一小部分胺基酸殘基變化特別強烈，這些胺基酸的殘基組成和排列順序更易發生變異區域稱高變區。高變區位於分子表面，最多由17個胺基酸殘基構成，少則只有2 3個。高變區胺基酸序列決定了該抗體結合抗原的特異性。一個抗體分子上的兩個抗原結合部位是相同的，位於兩臂末端稱抗原結合片段(antigen-binding fragment, Fab)。" Y"的柄部稱結晶片段(crystalline fragment, Fe),糖結合在 Fe 上。從結構上來說，在本發明中，提及抗體時均指全抗體，即包括4條鏈和Fe段的抗體結構(見圖I)。此外，從功能上來說，本發明中的「抗體」或「抗體片段」是指對靶抗原特異的抗體或抗體片段，即與抗原具有特異結合能力的抗體或抗體片段，如未特別說明，本發明中的抗體一般指單克隆抗體，抗體片段包括半抗體片段、F(ab』 )2片段、Fab』片段和Fab
坐寸ο半抗體片段如圖4中所示，通過二硫鍵還原劑將全抗體拆分成各自帶有巰基的對稱的片段，每個半抗體片段包含一條完整的輕鏈和一條完整重鏈以及Fe片段。F(ab』 )2 :如圖5中所示，Ig(immunoglobulin,免疫球蛋白)被胃蛋白酶水解在鉸鏈區重鏈間二硫鍵近C處切斷，形成一個雙價抗原結合片段簡稱F (ab』)2片段和一些小片段pFc'。由於F(ab』)2片段保留了結合相應抗原的生物學活性，又避免了 Fe片段的抗原性可能引起的副作用，因而被廣泛用作生物製品。如白喉抗黴素和破傷風抗黴素，經胃蛋白酶水解後，因去掉了 Fe片段的抗原性而減少了超敏反應的發生。pFc'片段最終被降解，無生物學活性。Fab (fragment of antigen binding):木瓜蛋白酶使Ig在鉸鏈區重鏈間二硫鍵近N端處切斷，形成兩個相同的單價抗原結合片段簡稱Fab段(如圖I中所示)，一個可結晶的片段簡稱 Fe (fragment crystallizable)段。Fab』 是帶巰基的單價抗原結合片段(如圖6中所示，F(ab』 )2被二硫鍵還原劑拆分的各自帶有巰基的片段)。抗原結合位點如圖I中所示，抗體分子與抗原相結合的部位，由Ig輕、重鏈的CDR1、CDR2 和 CDR3 組成。 抗原是一類能誘導免疫系統發生免疫應答，並能與免疫應答的產物(抗體或效應細胞)發生特異性結合的物質。抗原具有免疫原性和反應原性兩種性質。根據抗原性質分為兩類完全抗原和不完全抗原。完全抗原(complete antigen)是一類既有免疫原性，又有免疫反應性的物質。如大多數蛋白質、細菌、病毒、細菌外毒素等都是完全抗原。不完全抗原，即半抗原(hapten)是只具有免疫反應性，而無免疫原性的物質，故又稱不完全抗原。二硫鍵還原劑二硫鍵又稱S-S鍵，是2個SH基被氧化而形成的-S-S-形式的硫原子間的鍵。在巰基乙胺(2-MEA)、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇等的硫化合物存在下能與之發生作用，還原成巰基(-SH)。這些硫化物就是本發明中所說的二硫鍵還原劑。在微量的二硫鍵還原劑存在的情況下抗體的重鏈間的二硫鍵被還原而其它的二硫鍵不被破壞。微懸臂梁(微梁)典型的微懸臂梁由氮化矽製成，如商品化的三角形微懸臂梁(Veeco Instruments)(尺寸長200um,腿寬20um,厚O. 6um)，單側鍍有60nm的金；抗體通常通過巰基化試劑的巰基(-SH)與金的共價結合以及巰基化試劑的另外一端(含有-COOH或-NH2等活性基團)與抗體結合來固定到微梁表面。基於表面應力檢測的微懸臂梁免疫傳感系統微懸臂梁免疫傳感系統主要由雷射器、分光鏡、微懸臂梁、光電位置敏感器(PSD)、溫度控制系統、蠕動泵、以及數據分析處理裝置組成。典型的微懸臂梁免疫檢測方法的步驟如下將微懸臂梁固定到反應池中，以蠕動泵控制流動緩衝液通過反應池，待反應池中氣泡排淨後以O. lmL/min的速度流動緩衝液通過反應池。反應池的溫度控制在37 ±0.01 °C，室溫控制在27 ±0.01 °C。雷射器發出一束雷射經分光鏡後照射在微懸臂梁的尖端，經微懸臂梁反射後再經分光鏡反射後照在PSD的靶面上。當微懸臂梁的位移信號穩定後，加入緩衝液稀釋的樣品溶液，PSD實時記錄微懸臂梁的尖端位移。本發明的優選實施方案在本發明中，抗體類型可以包括IgM、IgG、IgA、IgD、IgE。此外，抗體可以通過本領域中已知的任何方法製備，包括但不限於免疫法、雜交瘤法、化學合成法、基因工程法等。所述抗體還可以是基因工程修飾的雜合抗體，諸如人源化抗體，駱駝源化抗體等針對某種哺乳動物改造的抗體，例如人-鼠雜合抗體等。本發明中提到的待測樣品可以是生物樣品，例如來自於哺乳動物尤其是人的樣品，包括組織樣品(如病理組織切片、活檢、毛髮、拭子等)、細胞樣品(如細胞塗片、血液塗片等)、體液樣品(如血液、尿液、腦脊液、唾液等)、排洩物(例如嘔吐物、汗液、糞便等)。所述待測樣品還可以是環境樣品，諸如土壤樣品、水樣、浮塵等；其他生產領域中獲得的樣品，諸如汙水樣品、食品樣品等。本發明中所提及的抗原包括但不限於完全抗原和半抗原，其可以是本領域中所知曉的在本發明中所提到的待測樣品中可能存在的需要檢測的任何類型的抗原。本發明中提到的二硫鍵還原劑可以是巰基乙胺(2-MEA)、2_巰基乙醇、二硫蘇糖醇等。使用二硫鍵還原劑還原二硫鍵從而拆分抗體的方法和條件是本領域中公知的，例如，可以根據靶抗原的類型、大小和性質等，遵照本領域中的已知方法或市售的相關試劑盒的說明書來選擇具體的二硫鍵還原劑和濃度、抗體濃度，兩者的用量和質量比，溫育條件和溫育時間等。在本發明的優選實施方案中，在用二硫鍵還原劑處理抗體或抗體片段之後，可以進行透析去除未反應的二硫鍵還原劑，以免影響帶巰基的抗體片段與微梁鍍金層的結合和固定。在本發明中，在酶解步驟中使用的蛋白酶可以根據要被水解的抗體的種類或其他 因素任意地選擇，只要其水解產物中包括帶有巰基的抗原抗體結合片段從而可以直接固定在微梁金表面上，所述抗原抗體結合片段包括不限於單價或二價的抗原抗體結合片段，諸如F(ab』)2、Fab』等。可選的蛋白酶諸如胃蛋白酶，木瓜蛋白酶等，也可以使用兩者的組合。在本發明中，採用蛋白酶水解抗體Ig的方法和反應條件是本領域公知的，本領域普通技術人員可以根據要水解的抗體的種類來確定合適的蛋白酶和相應的水解條件。例如，當選擇胃蛋白酶時，胃蛋白酶可以發揮其活性的環境，一般是指pH 2 5和在25 60°C下的環境。胃蛋白酶的最適pH和最適溫度根據其來源而定,一般為pH 2左右和37°C左右(可以根據市售產品的要求來確定)。在本發明中可以使用的胃蛋白酶的來源不受限制，只要其可以將抗體分子裂解為F(ab』)2片段或將半抗體片段裂解為Fab』片段。在本發明中，抗體或抗體片段與胃蛋白酶的質量比不受限制，只要足以將抗體或抗體片段充分地水解為Fab』片段。兩者的質量比可以根據常規方法來選擇，也可以同時參考所選擇胃蛋白酶的活性、所選擇的抗體類型等因素，一般可以在10 : I 200 : I的範圍內選擇。另外，還可以選擇木瓜蛋白酶。在合適的條件下木瓜蛋白酶也可以將抗體水解為F(ab』)2片段，例如，在文獻Μ中在偏酸性(pH5. 5)的環境中在37°C下18小時木瓜蛋白酶可以將小鼠IgG1水解成F(ab』)2片段。在本發明中，抗體或抗體片段與木瓜蛋白酶的質量比不受限制，只要足以將抗體或抗體片段充分地水解為Fab』片段。兩者的質量比可以根據常規方法來選擇，也可以同時參考所選擇木瓜蛋白酶的活性、所選擇的抗體類型等因素，一般可以在10 I 200 I的範圍內選擇。當使用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合物時，由於兩者的活性環境均為酸性，因此根據具體的應用適當地調整兩者的質量比，從而可以根據需要調整所需的水解活性和水解時間。在本發明中，酶解步驟可以在拆分抗體之前或之後進行。當在拆分抗體之前用蛋白酶水解時，即用蛋白酶水解抗體時，得到一個帶有兩個Fab』片段的F(ab』)2片段和多個小分子片段。當在拆分抗體之後用蛋白酶水解時，即用蛋白酶水解半抗體片段時，得到了一個Fab』片段和多個小分子片段。兩種處理方式最終均可以得到帶有雙巰基的Fab』片段。在本發明中，抗體或抗體片段與微梁的鍍金層的結合可以使用本領域公知的方法和條件，例如在適於兩者結合的條件下溫育一段時間來結合(參見下面的實施例或市售產品的說明書)。在本發明中使用的微梁可以根據本領域中的公知方法自行製備，也可以購買市售商品，對此在本發明中並無任何限制。下面結合具體實施例對本發明做進一步說明，但需要說明的是下面的實施例不限制本發明的範圍。實施例實施例I固定半抗體片段的微梁實驗I利用巰基乙胺將抗體拆分成帶巰基的半抗體片段I.準確稱取人參皂苷GS-Re單克隆抗體(購自美國USBiological公司)7. Omg溶於I. OmL PBS (含O. 15M NaCl和5. OmM EDTA, pH 6. 5)中得到濃度為7. Og/L的抗體溶液；2.稱取Img巰基乙胺(購自美國Sigma公司)溶於I. OmL水中得到濃度為I. Og/L的抗體拆分試劑；3.將I. OmL上述步驟I的抗體溶液和291. 2 μ L上述步驟2的抗體拆分試劑混合，室溫下反應I. 5小時。4.用 2OmM 的 PBS 緩衝液(含 O. 15Μ NaCl 和 5· OmM EDTA, pH 6. 5)對上述步驟3的反應液透析48小時，期間每3小時更換一次透析液，得到帶巰基的半抗體片段。用甘油等體積稀釋後-20°C保存。實驗2半抗體片段與微梁金表面的結合將洗淨並用氮氣吹乾的鍍有金層的微梁(購自美國Veeco公司)放入酶標板小孔中，加入150 μ L濃度為5. Omg/mL的實驗I步驟I獲得的抗人參皂苷GS-Re單克隆抗體片段，37°C溫育I小時，即得到固定有半抗體片段的微梁。實驗3直接競爭ELISA方法評價半抗體片段與微梁金表面的結合情況具體步驟如下I.清洗用鑷子小心取出上述固定了半抗體片段的微梁，用洗滌液(每IL洗滌液中含有 8. Og NaCUO. 2g KH2PO4,2. 96g Na2HPO4 · 12H20、I. OmL Tween-20，其餘為水)衝洗數
次，氮氣吹乾；2.封閉將氮氣吹乾後的微梁分別放入酶標板中，加入100 μ L質量百分含量為5%的BSA溶液(用PBS溶解)封閉，37°C溫育30分鐘；3.清洗用鑷子小心取出微梁，用洗滌液衝洗數次，氮氣吹乾；4.競爭將氮氣吹乾後的微梁分別放入酶標板的兩個小孔中(做好標記，抑制孔與非抑制孔)，抑制孔加入50 μ L經樣品稀釋液(含有終濃度為O. Imo 1/L ρΗ7. 5的PBS、
O.I %體積百分含量的吐溫-20和O. I %質量百分含量的明膠)稀釋的濃度為100mg/L的人參皂苷GS-Re溶液(購自美國Sigma公司)，非抑制孔加入50 μ L樣品稀釋液作為對照；然後再分別加入濃度為I. Omg/L的人參皂苷GS-Re過氧化物酶聯結物(購自美國Sigma公司)，37°C溫育30分鐘；5.清洗用鑷子小心取出上述抑制孔與非抑制孔中的微梁，用洗滌液衝洗數次，
氮氣吹乾。6.顯色將氮氣吹乾後的兩根微梁分別放入酶標板的兩個小孔中，每孔加入100 μ L顯色溶液(TMB底物使用液與底物緩衝液按I : 9的體積比混勻，每IOmL上述混合液中加入4. Omg過氧化脲)，室溫顯色；7.終止15分鐘後，每孔加入50 μ L終止液(2. OM的硫酸溶液)終止反應，取出微梁，450nm波長處分別讀取OD值。實驗設三次重複，結果表明，抑制孔和非抑制孔的450nm波長下的吸光度值分別為O. 121和O. 727，說明抗人參皂苷GS-Re半抗體片段能有效結合微梁的金表面上並具有活性。實驗4微梁傳感器效果監測
I.清洗無水乙醇、丙酮和PBS分別流經微梁傳感系統，流速O. 5mL/min ；2.固定微梁將步驟2中固定有抗人參皂苷GS-Re抗體片段的微梁固定到微梁傳感系統的反應池中，流動PBS通過反應池子。排除反應池中的氣泡後以O. lmL/min流動PBS。3.調節光路調節雷射器與PSD(光電位置敏感器)的位置使雷射器發出的雷射照在微梁的尖端反射後被PSD接收。4.樣品測定當PSD接收的微梁偏轉信號穩定後，加入2mL PBS稀釋的人參皂苷GS-Re標準樣品。通過PSD實時記錄微梁尖端位移信息。圖9為抗人參皂苷GS-Re半抗體片段修飾微梁，檢測不同濃度抗原時微梁尖端的時間位移曲線。檢測了三個濃度I. 0ng/mL、0. lng/mL、0. 02ng/mL的樣品得到的微梁尖端位移幅值分別為77、58和32nm。不同濃度的人參皂苷GS-Re標準樣品可以產生不同程度的微梁位移，說明抗人參皂苷GS-Re半抗體片段能有效結合到微梁的金表面上並能對人參皂苷GS-Re進行定量檢測。並且具有很高的檢測靈敏度(圖8為利用鹽酸硫醇亞胺做為巰基化試劑來巰基化抗體後將抗體固定到微梁上(中國專利CN101407548)對人參皂苷進行檢測的結果)。結論用本發明的半抗體片段修飾的微梁和完整抗體修飾的微梁進行實驗測試對比，檢測不同濃度的人參皂苷GS-Re抗原時，微梁尖端的時間位移響應曲線(圖9和圖8)顯示，在微梁位移響應為20納米左右時，半抗體片段修飾和巰基化抗體修飾的檢測人參皂苷GS-Re抗原濃度分別為O. 02ng/mL和O. 5ng/mL,靈敏度提高了約20倍。實施例2抗體Fab』片段修飾的微梁實驗I抗體F(ab』)2片段的製備I.用O. lmol/L檸檬酸緩衝液(ρΗ3· 5)溶解人參皂苷GS-Re單克隆抗體(IgG)(購自美國 USBiological 公司)至 10mg/ml ；2.用O. lmol/L朽1檬酸緩衝液(ρΗ3· 5)溶解胃蛋白酶(pepsin)(購自美國Sigma公司)至lmg/ml ；3.將IgG:胃蛋白酶按質量比100 I混合，放在37°C水浴箱中2小時，然後加入3mol/L Tris使pH在7左右以終止反應。4.用 2OmM 的 PBS 緩衝液(含 O. 15M NaCl 和 5· OmM EDTA, pH 6. 5)對上述步驟3的反應混合液透析48小時，期間每3小時更換一次透析液，得到抗體F(ab』)2片段。
實驗2抗體片段Fab』的製備I.用去離子水溶解巰基乙胺(2-MEA)(購自美國Sigma公司)至lmg/ml ；2.將步驟I中製備的F(ab』 )2 :2_MEA按質量比20 I進行混合，放在37°C水浴箱中2小時；3.用 20mM 的 PBS 緩衝液(含 O. 15M NaCl 和 5. OmM EDTA, pH 6. 5)對上述步驟 2的反應混合液透析48小時，期間每3小時更換一次透析液，得到抗體Fab』片段。用甘油等體積稀釋後保存在-20°C環境下。實驗3將Fab』抗體片段修飾到微梁金表面上將洗淨並用氮氣吹乾的鍍有金膜的微梁(購自美國Veeco公司)放入酶標板小孔中，加入150 μ L濃度為5. Omg/mL的上述步驟2製得的Fab』抗體片段溶液，放在37°C水浴箱中2小時，即得到固定有抗體Fab』片段的微梁。·實驗4ELISA直接競爭法效果檢測I.清洗用鑷子小心取出上述固定了抗體Fab』片段的微懸臂梁，用洗滌液(每IL洗滌液中含有 8. Og NaCUO. 2g KH2PO4,2. 96gNa2HP04 · 12H20U. OmL Tween-20，其餘為水)衝洗數次，氮氣吹乾；2.封閉將氮氣吹乾後的微懸臂梁分別放入酶標板中，加入ΙΟΟμ L質量百分含量為5%的BSA溶液(用PBS溶解)封閉，37°C溫育30分鐘；3.清洗用鑷子小心取出微懸臂梁，用洗滌液衝洗數次，氮氣吹乾；4.競爭將氮氣吹乾後的微懸臂梁分別放入酶標板的兩個小孔中(做好標記，抑制孔與非抑制孔)，抑制孔加入50 μ L經樣品稀釋液(含有終濃度為O. lmol/L pH7. 5的PBS,O. 1%體積百分含量的吐溫-20和O. 1%質量百分含量的明膠)稀釋的濃度為IOOmg/L的人參皂苷GS-Re溶液(購自美國Sigma公司)，非抑制孔加入50 μ L樣品稀釋液作為對照；然後再分別加入濃度為I. Omg/L的人參皂苷GS-Re過氧化物酶聯結物(購自美國Sigma公司)，37°C溫育30分鐘;5.清洗用鑷子小心取出上述抑制孔與非抑制孔中的微懸臂梁，用洗滌液衝洗數次，氮氣吹乾；6.顯色將氮氣吹乾後的兩根微懸臂梁分別放入酶標板的兩個小孔中，每孔加入100 μ L顯色溶液(TMB底物使用液與底物緩衝液按I : 9的體積比混勻，每IOmL上述混合液中加入4. Omg過氧化脲)，室溫顯色；7.終止15分鐘後，每孔加入50 μ L終止液(2. OM的硫酸溶液)終止反應，取出微懸臂梁，450nm波長處分別讀取OD值。實驗設三次重複，結果表明，抑制孔和非抑制孔的450nm波長下的吸光度值分別為0. 178和0. 853，說明抗人參皂苷GS-Re抗體Fab』片段能有效結合微懸臂梁的金表面上。實驗5微梁傳感器效果檢測I.清洗無水乙醇、丙酮和PBS分別流經微梁傳感系統，流速0. 5mL/min ；2.固定微梁將實驗3中修飾有抗人參皂苷GS-Re抗體片段Fab』的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感系統的反應池中，流動PBS通過反應池子。排除反應池中的氣泡後以
0.lmL/min 流動 PBS。3.調節光路調節雷射器與PSD(光電位置敏感器)的位置使的雷射器發出的雷射照在微梁的尖端並被PSD接收。4.樣品測定當PSD接收的微梁偏轉信號穩定後，加入2mL PBS稀釋的人參皂苷GS-Re標準樣品。通過PSD實時記錄微梁尖端位移信息。檢測了三個濃度I. 0ng/mL、0. lng/mL、0. 01ng/mL的樣品得到的微梁尖端位移幅值分別為79、61和21nm ;不同濃度的人參皂苷GS-Re標準樣品可以產生不同程度的微懸臂梁位移，說明抗人參皂苷GS-Re抗體Fab』片段能有效結合到微懸臂梁的金表面上並能對人參皂苷GS-Re進行檢測。結論 用本發明的抗體Fab 』片段修飾的微梁和完整抗體修飾的微梁進行實驗測試對比，檢測不同濃度的人參皂苷GS-Re抗原時，在微梁位移響應為20納米左右時，抗體Fab』片段修飾和巰基化抗體修飾檢測人參皂苷GS-Re抗原濃度分別為O. 01ng/mL和O. 5ng/mL,靈敏度提高了近40倍。實施例3抗體Fab』片段修飾的微梁實驗I利用巰基乙胺將抗體拆分成帶巰基的半抗體片段I.準確稱取人參皂苷GS-Re單克隆抗體(購自美國USBiological公司)7. Omg溶於I. OmL PBS (含O. 15M NaCl和5. OmM EDTA，pH 6. 5)中得到濃度為7. Og/L的抗體溶液；2.稱取Img巰基乙胺(購自美國Sigma公司)溶於I. OmL水中得到濃度為I. Og/L的抗體拆分試劑；3.將I. OmL上述步驟I的抗體溶液和291. 2 μ L上述步驟2的抗體拆分試劑混合，室溫下反應I. 5小時。4.用 20mM 的 PBS 緩衝液(含 O. 15M NaCl 和 5. OmM EDTA, pH 6. 5)對上述步驟 3的反應液透析48小時，期間每3小時更換一次透析液，得到帶巰基的半抗體片段。用甘油等體積稀釋後-20°C保存。實驗2抗體Fab』片段的製備I.用O. lmol/L朽1檬酸緩衝液(ρΗ3· 5)溶解胃蛋白酶(pepsin)(購自美國Sigma公司)至lmg/ml ；2.將步驟I中製備的半抗體片段與胃蛋白酶按質量比100 I混合反應，放在37°C水浴箱中2小時，然後加入3mol/L Tris使pH在7左右以終止反應。3.用 20mM 的 PBS 緩衝液(含 O. 15M NaCl 和 5. OmM EDTA, pH 6. 5)對上述步驟 2的反應混合液透析48小時，期間每3小時更換一次透析液，得到抗體Fab』片段。用甘油等體積稀釋後保存在-20°C環境下。實驗3將抗體Fab』片段修飾到微梁金表面上將洗淨並用氮氣吹乾的鍍有金膜的微梁(購自美國Veeco公司)放入酶標板小孔中，加入150 μ L濃度為5. Omg/mL的上述步驟2製得的抗體Fab』片段溶液，放在37°C水浴箱中2小時，即得到固定有抗體Fab』片段的微梁。實驗4ELISA直接競爭法效果檢測I.清洗用鑷子小心取出上述固定了抗體Fab』片段的微懸臂梁，用洗滌液(每IL洗滌液中含有 8. Og NaCUO. 2g KH2PO4,2. 96g Na2HPO4 · 12H20、I. OmL Tween-20，其餘為水)衝洗數次，氮氣吹乾；
2.封閉將氮氣吹乾後的微懸臂梁分別放入酶標板中，加入ΙΟΟμ L質量百分含量為5%的BSA溶液(用PBS溶解)封閉，37°C溫育30分鐘；
3.清洗用鑷子小心取出微懸臂梁，用洗滌液衝洗數次，氮氣吹乾；4.競爭將氮氣吹乾後的微懸臂梁分別放入酶標板的兩個小孔中(做好標記，抑制孔與非抑制孔)，抑制孔加入50 μ L經樣品稀釋液(含有終濃度為O. lmol/L pH 7. 5的PBS,O. I %體積百分含量的吐溫-20和O. 1%質量百分含量的明膠)稀釋的濃度為100mg/L的人參皂苷GS-Re溶液(購自美國Sigma公司)，非抑制孔加入50 μ L樣品稀釋液作為對照；然後再分別加入濃度為I. 0mg/L的人參皂苷GS-Re過氧化物酶聯結物(購自美國Sigma公司)，37°C溫育30分鐘;5.清洗用鑷子小心取出上述抑制孔與非抑制孔中的微懸臂梁，用洗滌液衝洗數次，氮氣吹乾；6.顯色將氮氣吹乾後的兩根微懸臂梁分別放入酶標板的兩個小孔中，每孔加入100 μ L顯色溶液(TMB底物使用液與底物緩衝液按I : 9的體積比混勻，每IOmL上述混合液中加入4. Omg過氧化脲)，室溫顯色；7.終止15分鐘後，每孔加入50 μ L終止液(2. OM的硫酸溶液)終止反應，取出微懸臂梁，450nm波長處分別讀取OD值。實驗設三次重複，結果表明，抑制孔和非抑制孔的450nm波長下的吸光度值分別為0. 152和0. 763，說明抗人參皂苷GS-Re抗體Fab』片段能有效結合微懸臂梁的金表面上。實驗5微梁傳感器效果檢測I.清洗無水乙醇、丙酮和PBS分別流經微梁傳感系統，流速0. 5mL/min ；2.固定微梁將實驗3中修飾有抗人參皂苷GS-Re抗體Fab』片段的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感系統的反應池中，流動PBS通過反應池子。排除反應池中的氣泡後以
0.lmL/min 流動 PBS。3.調節光路調節雷射器與PSD(光電位置敏感器)的位置使的雷射器發出的雷射照在微梁的尖端並被PSD接收。4.樣品測定當PSD接收的微梁偏轉信號穩定後，加入2mL PBS稀釋的人參皂苷GS-Re標準樣品。通過PSD實時記錄微梁尖端位移信息。檢測三個濃度I. 0ng/mL、0. lng/mL、0. 015ng/mL的樣品得到的微梁尖端位移幅值分別為68、42和22nm ;不同濃度的人參皂苷GS-Re標準樣品可以產生不同程度的微懸臂梁位移，說明抗人參皂苷GS-Re抗體Fab』片段能有效結合到微懸臂梁的金表面上並能對人參皂苷GS-Re進行檢測。結論通過先拆分後酶解的方法製備的本發明的抗體Fab』片段修飾的微梁和完整抗體修飾的微梁進行實驗測試對比，檢測不同濃度的人參皂苷GS-Re抗原時，在微梁位移響應為20納米左右時，抗體Fab』片段修飾和巰基化抗體修飾檢測人參皂苷GS-Re抗原濃度分別為0. 015ng/mL和0. 5ng/mL,靈敏度提高了近33倍。通過上述非限制性的實施例，可以看出，本發明的方法和通過本發明的方法製備的微懸臂梁在免疫傳感檢測技術中與現有技術的微梁法相比可以提高20-40倍，相當於常規酶聯免疫法的200-400倍，實現了本發明的目的，即在食品安全、環境汙染、生物醫學、科學研究和生產製造等領域中監控和檢測極微量被分析物的可能性和實用性，完全可以實現實際的商業化應用。參考文獻[l]Koutilya R. Buchapudi, Xin Huang, Xin Yang，HaiFeng Ji and ThomasThundat, Microcantilever biosensors for chemicals and bioorganisms. Analyst,2011，136，1539-1556[2]Weiming Tan，Yuan Huang，Tiegui Nan，Changguo Xue,Zhaohu Li，QingchuanZhang, and Baomin Wang, Development of Protein A Functionalized MicrocantileverImmunosensors for the Analyses ofSmaII Molecules at part per trillion Levels.Analysis Chemistry,2010，82(2)，615-620[3] Hongwei Zhao ；Changguo Xue ；Tiegui Nan ；Guiyu Tan ；Zhaohu Li; Qing X. Li ；Qingchuan Zhang ；Baomin Wang, Detection of Copper Ions UsingMicrocantilever Immunosensors and Enzyme-linked Immunosorbent Assay, AnalyticaChimica Acta，2010，676，81-86，[4]Changguo Xue, Hongwei Zhao, Yanyun Chen, Baomin Wang, QingchuanZhang, Xiaoping Wu, Development of sulfhydrylated antibody functionalizedmicrocantilever immunosensor for taxol， Sensors and Actuators B，2011，156，863-866[5] A. Kausai te-Minkst imi ene，A. Ramanav i c i ene，J. Kirlyte , andA. Ramanavicius. Comparative Study of Random and Oriented AntibodyImmobilization Techniques on the Binding Capacity of Immunosensor. AnalysisChemistry,2010，82，6401-6408[6] [J]仇凱等，木瓜蛋白酶製備抗人肝癌抗F(ab』)2&Fab片段。第四軍醫大學學報，1995 ；16(6) :414-416。
權利要求
1.一種製備微懸臂梁的方法，包括以下步驟 1)提供抗體和帶有鍍金層的微懸臂梁； 2)二硫鍵還原步驟使用二硫鍵還原劑處理所述抗體，使得所述抗體鉸鏈區的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個對稱的帶有巰基的半抗體片段； 3)固定步驟將步驟2)獲得的半抗體片段與鍍有金層的微懸臂梁結合，得到鍍金表面上固定有所述半抗體片段的微懸臂梁。
2.一種製備微懸臂梁的方法，包括以下步驟 1)提供抗體和帶有鍍金層的微懸臂梁； 2)酶解步驟用蛋白酶將所述抗體裂解成F(ab』)2片段和多個小分子片段，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其組合； 3)二硫鍵還原步驟使用二硫鍵還原劑處理所述F(ab』 )2片段，使得所述抗體鉸鏈區的~■硫鍵還原成疏基，從而得到兩個對稱的帶有疏基的Fab』片段； 4)固定步驟將步驟3)獲得的Fab』片段與鍍有金層的微懸臂梁結合，得到鍍金表面上固定有所述Fab』片段的微懸臂梁。
3.一種製備微懸臂梁的方法，包括以下步驟 1)提供抗體和帶有鍍金層的微懸臂梁； 2)二硫鍵還原步驟使用二硫鍵還原劑處理所抗體，使得所述抗體鉸鏈區的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個對稱的帶有巰基的半抗體片段； 3)酶解步驟用蛋白酶將所述半抗體片段裂解成Fab』片段和多個小分子片段，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其組合； 4)固定步驟將步驟3)獲得的Fab』片段與鍍有金層的微懸臂梁結合，得到鍍金層上固定有所述Fab』片段的微懸臂梁。
4.一種應力傳感元件，其包括基於應力的微懸臂梁，所述微懸臂梁的鍍金層上固定有抗體的半抗體片段或Fab』片段。
5.一種基於應力的微懸臂梁免疫傳感檢測系統，其包括權利要求4的應力傳感元件。
6.一種使用微懸臂梁傳感檢測系統免疫傳感檢測待測樣品的方法，包括以下步驟 1)提供對靶抗原特異的抗體和微懸臂梁傳感檢測系統，所述微懸臂梁傳感檢測系統包括反應池和帶有鍍金層的基於應力的微懸臂梁； 2)使用二硫鍵還原劑處理所述抗體，使得所述抗體鉸鏈區的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個對稱的帶有巰基的半抗體片段； 3)將步驟2)獲得的半抗體片段與鍍有金層的微懸臂梁結合，得到鍍金層上固定有所述半抗體片段的微懸臂梁； 4)將步驟3)獲得的固定有所述半抗體片段的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感檢測系統的反應池中； 5)將待測樣品加入至步驟4)獲得的微懸臂梁傳感檢測系統中，檢測待測樣品中是否存在所述靶抗原。
7.一種使用微懸臂梁傳感檢測系統免疫傳感檢測待測樣品的方法，包括以下步驟 I)提供對靶抗原特異的抗體和微懸臂梁傳感檢測系統，所述微懸臂梁傳感檢測系統包括反應池和帶有鍍金層的基於應力的微懸臂梁；2)用蛋白酶將所述抗體裂解成F(ab』)2片段和多個小分子片段，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其組合； 3)使用二硫鍵還原劑處理所述F(ab』)2片段，使得所述抗體鉸鏈區的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個對稱的帶有巰基的Fab』片段； 4)將步驟3)獲得的Fab』片段與鍍有金層的微懸臂梁結合，得到鍍金層上固定有所述Fab』片段的微懸臂梁； 5)將步驟4)獲得的固定有所述Fab』片段的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感檢測系統的反應池中； 6)將待測樣品加入至步驟5)獲得的微懸臂梁傳感檢測系統中，檢測待測樣品中是否存在所述靶抗原。
8.一種使用微懸臂梁傳感檢測系統免疫傳感檢測待測樣品的方法，包括以下步驟 1)提供對靶抗原特異的抗體和微懸臂梁傳感檢測系統，所述微懸臂梁傳感檢測系統包括反應池和帶有鍍金層的基於應力的微懸臂梁； 2)使用二硫鍵還原劑處理所述抗體，使得所述抗體鉸鏈區的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個對稱的帶有巰基的半抗體片段； 3)用蛋白酶將所述半抗體片段裂解成Fab』片段和多個小分子片段，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其組合； 4)將步驟3)獲得的Fab』片段與鍍有金層的微懸臂梁結合，得到鍍金層上固定有所述Fab』片段的微懸臂梁； 5)將步驟4)獲得的固定有所述Fab』片段的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感檢測系統的反應池中； 6)將待測樣品加入至步驟5)獲得的微懸臂梁傳感檢測系統中，檢測待測樣品中是否存在所述靶抗原。
9.根據權利要求1-8中任一項所述的方法、應力傳感元件或免疫傳感檢測系統，其特徵在於所述二硫鍵還原劑選自巰基乙胺、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇中的一種或多種。
10.根據權利要求1-9中任一項所述的方法、應力傳感元件或免疫傳感檢測系統，其特徵在於所述抗體為IgM、IgG、IgA、IgD、IgE中的任一種。
全文摘要
本發明提供了一種抗體片段修飾的微懸臂梁，其鍍金表面上定向固定有半抗體片段或抗體的Fab』片段，提高了基於表面應力效應的微懸臂梁免疫檢測方法的靈敏度。本發明還公開了所述微懸臂梁的製備方法、基於所述抗體片段修飾的微懸臂梁的免疫傳感檢測系統和檢測方法。
文檔編號G01L1/04GK102951598SQ20111023888
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月19日 優先權日2011年8月19日
發明者張青川, 吳尚犬, 鄔林, 伍小平 申請人:中國科學技術大學