多室生物反應器的製作方法

2023-06-10 16:46:06 2

專利名稱：：多室生物反應器的製作方法
技術領域：
：本發明通常涉及一種用於培養和維持生物系統的裝置及方法。本發明特別涉及一種裝置和方法，其具有允許灌注液在擴散交換下流向組織細胞而沒有細胞遷移的通路結構。另外，本發明涉及一種裝置和方法，其能夠培養和維持諸如原生動物等活微生物有機體。本發明還涉及一種裝置和方法，其用於諸如生物膜等細胞集合的動態分析。本發明特別涉及一種裝置和方法，其用於測量生物膜對在生物膜不同深度的諸如化學應激物等物質的一個或多個動態流的響應。本發明的一些實施方式包含了用於培養和維持諸如細胞或細胞集合等的生物系統且監測此生物系統代謝活性狀態和對環境變化響應的裝置和方法，其中各細胞代謝活性可以由特徵時間來表徵。該裝置和方法特別包含多室生物反應器及使用其的方法。本發明的一些其他實施方式包含了用於培養和維持諸如細胞或細胞集合等生物系統且監測此生物系統代謝活性狀態和對環境變化響應的裝置和方法，其中各細胞代謝活性可以由特徵時間來表徵。該裝置和方法特別包含排置有用公共饋送線的數個室的生物反應器及使用其的方法。本發明的某些另外的實例包含了用於培養和維持諸如細胞或細胞集合等的生物系統且監測此生物系統代謝活性狀態和對環境變化響應的裝置和方法，其中各細胞代謝活性可以由特徵時間來表徵。該裝置和方法特別包含毛細管灌注的生物反應器及使用其的方法。本發明的一些進一步的實施方式包含了用於培養和維持諸如細胞或細胞集合等的生物系統且監測此生物系統代謝活性狀態和對環境變化響應的裝置和方法，其中各細胞代謝活性可以由特徵時間來表徵。該裝置和方法特別包含有物質注射能力的生物反應器及使用其的方法。發明
背景技術：
：生物反應器是能用於培養活細胞的一種設備。生物反應器特別是能提供適當物理和化學環境，及快速傳送底物和產物以使細胞生物反應理想地快速有效地發生的容器。最簡單的生物反應器是培養皿在常規的利用孔板、培養皿和燒瓶的細胞培養中，典型地培養基容量為細胞容量的200至1000倍。當結合使用培養基緩衝時，這個比率允許細胞在不改變介質的情況下生長至少24小時。然而，這個比率的另一個結果是細胞產生的任何細胞外因子及其另外提供的旁分泌細胞至細胞交流的相應稀釋減弱，而這在組織中是可能的，因為細胞外容量可能僅是細胞內容量的10％。生物反應器的發展多定向在功能性組織或生物化學品和藥品的生成。例如，最近20年在皮膚、胰腺、軟骨、肝臟、角膜和膀胱生成上的研究具有特殊重要性1。僅在美國，就有超過80,000人在等待器官移植，因此發展改進生物反應器技術的需要是不言而喻的。人們也逐漸認識到，在了解細胞運動和趨化信號發出以及其它複雜細胞過程上的進步往往被可用於在過程中觀察和在不同點幹預的實驗技術所束縛。許多這些過程能夠在適當裝備的生物反應器中得到很好地檢測。生物反應器有廣泛的種類，包括攪拌容器、泡罩塔式反應器、填充床反應器2、氣升式反應器、及包括板、旋轉臺、螺旋纏繞及中空的纖維的膜反應器3。中空纖維反應器特別重要，因為(取決於其結構)它們可以允許每立方米模塊容量的膜面積多達30,000平方米4-6。然而，假設哺乳動物的細胞對於剪切力非常敏感7-9(其主要由攪動和通氣引起)，在細胞生長的反應器中儘可能減小該力是很重要的9-10。膜已用於生物反應器中以增加細胞存活。例如，眾所周知在一些反應器模型中產生的液氣相界面對哺乳動物細胞顯著有害。這個潛在的致命界面能通過使用疏水膜來消除9。生物反應器也可以按它們操作模式分類分批式、流加式和連續式培養(也稱為灌注式培養)。在第一或分批模式中，不添加培養基，也不移除介質；在流加模式的情況下，連續進料但不移除任何東西直到反應結束且反應器放空。這些系統用於過程控制效果微弱，與灌注式體系相比其生產率低，在這第三種模式中培養基持續流入且介質持續流出。除了高的生產率外，在這類反應器11中還有較好的細胞生理學控制，且在哺乳動物細胞培養情況下也已顯示出比靜態方法明顯更有優勢12，13。當培養大的三維組織時一個局限性是缺少用於營養物和代謝物傳送的適當的維管聯結。大量的研究已經分析了人造維管網14-18，並且對構造功能性微制支架(microfabricatedscaffolds)已有大量嘗試3，16，19-21。已生產這些網絡的技術包括等離子蝕刻、光刻蝕、軟刻蝕、微接觸印刷、使用微通道的微流成型、層流成型和模版成型22-25。在等離子蝕刻技術中，我們可以認為高深寬比微加工技術(HighAspectRatioMicromachining，HARMS)是一個強有力的工具，因為其允許蝕刻實際上無限深的通道而不會增加已經由刻蝕得到的寬度22。它也可以在PDMS中用綜合拓撲學和幾何學構造三維微通道系統15。另外，需要認識到臨床可移植組織的培養要求最終生物降解和組織支架的機械性能16。這些性能直接涉及到選擇構成組織的材料的結晶度、分子量、玻璃化轉變溫度和單體疏水性9。已經使用了諸如膠原質等自然衍生的原料26，以及合成的和半合成的材料。聚羥基乙酸(PGA)具有高多孔性且可以使裝置構成容易，因此PGA纖維網孔被考慮用於移植細胞。然而，它們不能抵抗重大的壓縮力。解決這個問題可選擇的辦法是用乳酸和羥基乙酸的聚合物，可以調整其比率以控制材料的結晶性從而控制降解速率和機械性能。已經由這些聚合物構製成纖維基管27。用由現有的微制細胞灌注生物反應器(microfabricatedcell-perfusionbioreactor)系統提供的性能比較活組織維管性能是重要的。在組織中，動脈漸漸分成較小維管，最後到達細動脈然後是毛細管。細動脈很重要，因為它們包含前毛細血管括約肌，其可控制各毛細血管床的灌注，還提供大多個外周阻力從而提供與動脈供應關聯的壓降。結果，穿過毛細血管內皮膜的壓差保持足夠低以允許營養物和代謝物擴散傳送過膜，以及組織維持和控制感染所需的免疫細胞的放行。如果毛細管中的壓力與細動脈中壓力一樣高，毛細管壁厚度會太大以至不能允許這些重要的遷移現象。雖然壓力較低，在許多方面靜脈回流系統就象上動脈系統的鏡面。活的維管系統的另一特徵是上述的分流過程允許所有細胞在50-200微米的毛細管中，取決於特定的組織。結果，動脈供給和靜脈回流系統是如此設置，以使每個灌注了大量細胞的毛細管與較大的供給和回流系統相連接，其有自相似性以確保相同灌注和通過毛細管壓力。這個設置過程是很難用微製造技術(microfabrication)來複製的。例如，鮑仁斯坦(Borenstein)等人22所描述的建立兩維空間維管系統的過程，其建立一個多尺度灌注系統用於維持內皮細胞，但是沒有提供穿過最小毛細管的選擇性限定擴散傳送以灌注位於灌注網絡外側的細胞。更重要的是，他們所展示的網絡有很大的裝置區域，其被大的器皿覆蓋，且限定於毛細血管的生物反應器的區域實際上很小。因此，對於微制遷移生物反應器(microfabricatedmigrationbioreactor)有要求，模仿體外正常組織微環境與瘤、感染組織及創傷組織的微環境一樣好，同時提供化學激素(chemokine)和生長因子梯度、剪切力、細胞灌注及物理屏障對細胞遷移滲透性的獨立控制，因此當細胞遷移、內滲、外滲和血管生成時，允許對正常、免疫、及癌細胞進行詳細的光學和電化學觀測。血管生成、瘤轉移及白細胞浸潤入組織是複雜的過程，不僅通過對單一化學激素的細胞響應來調節，也能由外部因素，例如多重競爭化學激素和生長因子信號，自分泌反饋環、細胞-細胞相互作用及諸如脈管剪應力等機械力來調節。目前評價穿過細胞屏障的遷移的方法包括博伊德(Boyden)小室和侵襲(transwell)小室，其提供穿過過濾器遷移的綜合螢光分析以進行遷移測定28-34，平行板流動室35-38，其中可以被評價在剪應力下在內皮細胞上的粘著和旋轉35，39-44，以及體外活體鏡檢法，其觀測活的動物中的細胞遷移45-48。這些方法每個都有局限性，包括無法維持和控制趨化梯度(全部體系)，無法實時或在生理剪應力下觀測遷移(博伊德小室和侵襲小室)，無法觀測下面深的細胞基質(平行板流動室)中外滲或血管生成，以及無法控制實驗的所有方面，例如限定細胞密度和控制微流控技術(microfluidics)用於獨立控制剪切和組織灌注(全部體系，特別是活體鏡檢法)。發展移動/轉移模型體系獨立控制內皮切應力、化學激素梯度、組織灌注及通過不同埠加不同細胞類型的能力，再結合藝術成像技術和傳感器性能，將代表超過現有可用系統的巨大前進。當然，對於這種性能需要是非常急迫的。血管生成是一個動態過程，受細胞微環境的影響並與遷移有聯繫。已經證明VEGF和血管生成素/酪氨酸激酶(Ang/Tie2)功能對於瘤血管生成51-53是必需的。然而，來自這兩個受體體系的信號如何被整合以調節血管生成並沒有確定，部分由於缺乏好的模型體系。下一步應研究在內皮細胞遷移、血管芽生和成熟、及瘤穿過內皮遷移中VEGF和血管緊張素信號的協調和整合。隨著血管生成、多重環境輸入影響了瘤轉移和白細胞浸潤。瘤細胞中一化學激素受體的激活影響瘤細胞中其他配體和受體的感應，同樣內皮細胞和白細胞也一樣，但是這個機制很少被了解54。需要了解在瘤細胞移動通過複合基質時化學激素受體內化變化和/或與接合體分子例如AP-2或β阻止因子(beta-arresting)關聯受體的變化如何影響化學激素受體活性。外部因素例如細胞-細胞粘著力、細胞-基質交互作用、及脈管剪應力在移動通過組織期間如何影響細胞骨架重組也是很少被了解的。肌動蛋白結合蛋白(cortactin)過度表達增加了乳癌細胞向骨骼的轉移55，然而該機制仍不清楚。同樣地，人類WASp蛋白的缺乏會導致伴性的免疫紊亂，其由信令、增生或趨化性缺陷產生56。需要研究在包括可控制剪切、細胞-細胞相互作用及化學激素梯度的複雜多細胞環境中肌動蛋白結合蛋白和WASp蛋白在乳癌和HL60細胞的趨化中的作用。作為最後的例子，基質金屬蛋白酶(MMPS)是可以在多種類型癌中找到的細胞外表達的酶，且被認為在腫瘤發生、生長、侵襲和轉移中很重要。最近發現發生在缺乏MMP-3的老鼠(MMP-3缺乏老鼠)中的皮膚瘤發育和生長快於正常、野生型老鼠的皮膚瘤。這個差異與在MMP-3缺乏老鼠的瘤和周圍組織中免疫細胞數量減少相關聯。這個研究的合理進展是確定失去MMP如何影響免疫細胞的能力，即單核細胞和中性白細胞從外周血液循環侵潤到腫瘤位置。控制實驗環境的能力，包括多重限定細胞密度，對於闡明在MMP-3誘導細胞趨化中腫瘤-宿主相互作用的相對重要性是很關鍵的。儘管這些年取得了進步，但是，現在可用的生物反應器不能提供更多生理性的環境，其包括多細胞型態的體外三維區域、刺激物及測量能力，並且允許對趨化反應的分子研究。因此，很需要開發體外模仿瘤和組織的微環境，同時提供化學激素和生長因子梯度、剪切力、細胞灌注及物理屏障對細胞遷移滲透性的獨立控制，因此當細胞遷移、內滲、外滲和血管生成時，允許對正常和癌細胞進行詳細的光學和電化學觀測的生物反應器。因此，現有技術中存在這種迄今未解決的需求表明了上述缺陷和不足。發明概述一方面，本發明涉及用於在液體介質中培養活細胞的生物反應器。在一個實施例中，所述生物反應器有一個具有第一表面和相對第二表面的第一基片，其間界定了用於接收細胞和液體介質的一室。所述生物反應器進一步具有一個將所述室分成第一亞室和第二亞室的屏障，其中所述屏障有多孔性以允許所述第一亞室和所述第二亞室液體傳送，並且允許至少一個預定類型的細胞在所述第一亞室和所述第二亞室之間透過。如所成形的，所述第一亞室適於接收第一類型材料且所述第二亞室適於接受第二類型材料，其中每個所述第一類型材料和所述第二類型材料包含選自細胞、化學製劑及液體中的至少一種。所述細胞可以是任何類型的活細胞，包括但不限於細菌、原生動物、或兩者、正常細胞、瘤細胞、或它們的組合。所述的生物反應器還包括一生物相容塗層施於室壁，其中所述的生物相容塗層包含可以抑制細胞粘著於所述生物相容塗層、增強細胞粘著於所述生物相容塗層、或起螢光標記或細胞狀態指示劑作用的材料。在所述第一基片中形成至少一個輸入口和一個輸入轉移通道，其中所述輸入轉移通道可與所述輸入口及所述第一亞室和所述第二亞室之一進行液體傳送，以允許所述細胞、液體或化學製劑向相應亞室的輸送。在所述第一基片中形成至少一個輸出口和一個輸出轉移通道，其中所述輸出轉移通道可與所述輸出口及所述第一亞室和所述第二亞室之一進行液體傳送，以允許所述細胞、液體或化學製劑從相應亞室中的移出。另外，在所述第一基片中形成至少一個輔助口和一個輔助通道，其中所述輔助通道可與所述輔助口及所述輸入轉移通道和所述輸出轉移通道中之一進行液體傳送，以衝洗相應轉移通道。此外，在所述第一基片中形成至少一個訪問口和訪問通道，其中所述訪問通道可與所述訪問口及所述第一亞室和所述第二亞室之一進行液體傳送，以允許所述細胞、液體、化學製劑、塗料或傳感材料向相應亞室的輸送和移出。所述生物反應器進一步包括一第二基片，其中所述第二基片位於鄰近所述第一基片的所述第一表面處，並界定多個連接通道，每個所述連接通道的形成以使所述輸入口、所述輸出口、所述輔助口和所述訪問口中相應的一個進行液體傳送為宜。所述生物反應器另外還有多個連接口，每個所述連接口形成有一通道，並且其相對於所述第二基片的位置設定以使所述連接口的每個通道與在所述第二基片中形成的所述連接通道中相應的一個可進行液體傳送為宜。在一個實施例中，所述第一基片由來自玻璃、聚脂薄膜、聚二甲基矽氧烷(PDMS)、矽、聚合物、半導體、或它們的任何組合所構成。所述屏障包括多孔材料，其中所述屏障是微製造(microfabricated)的，以形成允許在所述第一亞室和所述第二亞室之間液體傳送的結構。所述生物反應器另外包括一第三基片和位於所述第三基片中的裝置，其中所述第三基片位於鄰近所述第一基片的所述第二表面處，所說的裝置適於電化學測量對所述第一亞室和所述第二亞室的至少一個中的所述液體介質的細胞響應。所述第三基片可以由半導體材料形成，例如矽。在一個實施例中，用於電化學測量的所述裝置包括參考電極、反電極、多個邊緣連接器墊板和多個導電端子，其中第一導電端子將所述參考電極電連接至相應的邊緣連接器墊板，且第二導電端子將所述反電極電連接至相應的邊緣連接器墊板。用於電化學測量的所述裝置進一步包括多個單獨可尋址工作電極，每一個均通過相應導電端子被電連接至相應的邊緣連接器墊板，其中所述液體介質包括至少一種或多種分析物，且其中所述多個單獨可尋址工作電極適用於能在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，傳感在所述室中多個位置上液體介質中單一分析物的濃度或在所述室中多個位置上液體介質中多種分析物的濃度。另外，多個單獨可尋址工作電極進一步適用於能在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，測量對與在所述室的多個位置上液體介質的細胞響應有關的代謝變量。所述生物反應器進一步還包括第四基片和位於所述第四基片中的裝置，其中所述第四基片位於所述第一基片的所述第二表面上面，所說的裝置適於光學測量對在所述第一亞室和所述第二亞室的至少一個中液體介質的細胞響應。所述第四基片至少是半透明的。所述第四基片可以由半導體材料形成，例如矽。在一個實施例中，用於光學測量的裝置包括多個光學傳感器、多個邊緣連接器墊板和多個端子，各將一光學傳感器光學連接至一相應邊緣連接器墊板，其中多個光學傳感器包含選自發光二級管和光電二極體對、光纖耦合器和光學探測頭的一組中的至少一個元件，其中所述液體介質包括至少一種或多種分析物，且其中多個光學傳感器適於能在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性的特徵反應時間的時間間隔內，傳感在所述室中多個位置上液體介質中單一分析物的濃度或在所述室中多個位置上液體介質中多種分析物的濃度。另外，多個光學傳感器進一步適於能在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性的特徵反應時間的時間間隔內，在所述室的多個位置上測量對液體介質的細胞響應關聯的代謝變量。另一方面，本發明涉及一種用於在液體介質中培養活細胞的生物反應器。在一個實施例中，所述生物反應器有一個基片具有第一表面和相對第二表面，其間界定了用於接收細胞和液體介質的室，其中所述室形成有一中心和一邊界，一第一屏障圍繞所述中心及部分所述室以形成一中央室，且一第二屏障位於所述第一屏障和所述邊界之間以形成了一個中間室和一個外室，其中所述第一屏障有第一多孔性，以允許所述中央室和所述中間室進行液體傳送及允許至少一第一預定類型的細胞在所述中央室和所述中間室間透過，且所述第二屏障有第二多孔性，以允許所述外室和所述中間室進行液體傳送及允許至少一第二預定類型的細胞在所述外室和所述中間室間透過。如所成形的，所述中央室適於接收第一類型材料，所述中間室適於接收第二類型材料，且所述外室適於接收第三類型材料，其中各所述第一類型材料、所述第二類型材料和所述第三類型材料包含選自細胞、化學製劑及液體一組中的至少一種。所述第一預定類型細胞包括瘤細胞，其通常被接收於所述中央室對應於一腫瘤空間。所述第二預定類型細胞包括正常組織細胞，其通常被接收於所述中間室對應於一組織空間，其中所述外室是相應於一脈管空間適於接收內皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞(neutophilcells)、任何它們的組合、或其他免疫細胞類型。所述生物反應器進一步包括一生物相容塗層施於所述邊界的所述室壁上，其中所述的生物相容塗層包含可以抑制細胞粘著於所述生物相容塗層、增強細胞粘著於所述生物相容塗層、或起螢光標記或細胞狀態指示劑作用的材料。在所述基片中形成至少一個附加輸入口或輸出口和一個輸入或輸出轉移通道，其中所述輸入或輸出轉移通道可與相應輸入口或輸出口及外部室進行液體傳送，以允許所述細胞、液體或化學製劑向所述外室的輸送。另外，在所述基片中形成至少一個輸入口或輸出口和輸入或輸出轉移通道，其中所述輸入或輸出轉移通道可與所述輸入口或輸出口及所述中心室可以液體傳送，用於允許所述細胞、液體或化學製劑向所述中心室輸送。另外，在所述基片中形成至少一個輸入口或輸出口和輸入口或輸出口轉移通道，其中所述輸入口或輸出口轉移通道可與所述輸入口或輸出口及所述中央室進行液體傳送，以允許所述細胞、液體、化學製劑、塗料或傳感材料向相應所述中央室的輸送。此外，在所述基片中形成至少一個另外輸入口或輸出口和輸入或輸出轉移通道，其中所述輸入或輸出轉移通道可與所述輸入口或輸出口及所述中間室進行液體傳送，以允許所述細胞、液體或化學製劑向所述中間室輸送。在一個實施例中，所述基片由玻璃、聚脂薄膜、聚二甲基矽氧烷(PDMS)、矽、聚合物、半導體、或它們的任何組合所構成。所述第一屏障包括多孔材料，其中所述第一屏障是微製造的以形成一第一結構允許液體在所述中央室和所述中間室之間的傳送。所述第二屏障包括多孔材料，其中所述第二屏障是微製造的以形成一第二結構允許液體在所述外室和所述中間室之間傳送，且所述第二結構與所述第一結構不同。在這個實施例中，所述第一屏障基本上為圓形，所述第二屏障基本上為圓形，且所述邊界基本上為圓形。可選擇地，各所述第一屏障、所述第二屏障、和所述邊界可以形成其他幾何形狀。所述生物反應器進一步包括適於電化學測量對在所述外室、所述中間室和所述中央室的至少一個中液體介質的細胞響應的裝置，其中用於電化學測量的所述裝置包括參考電極、反電極和多個單獨可尋址工作電極，其中所述液體介質包括至少一種或多種分析物。所述多個單獨可尋址工作電極包括第一組單獨可尋址工作電極，其適於能在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，傳感在所述外室多個位置上液體介質的單一分析物濃度或在所述外室多個位置上液體介質的多種分析物的濃度。所述第一組單獨可尋址工作電極進一步適於能在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，測量對在所述外室的多個位置上液體介質的細胞響應關聯的代謝變量。所述多個單獨可尋址工作電極進一步包括第二組單獨可尋址工作電極，其適於能在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，傳感在所述中央室的多個位置上液體介質的單一分析物的濃度或在所述中央室的多個位置上液體介質的多種分析物的濃度。所述第二組單獨可尋址工作電極進一步適於能在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，測量對在所述中央室的多個位置上液體介質的細胞響應關聯的代謝變量。所述多個單獨可尋址工作電極另外包括第三組單獨可尋址工作電極，其適於能在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，傳感在所述中間室多個位置上液體介質的單一分析物濃度或在所述中間室多個位置上液體介質的多種分析物的濃度。所述第三組單獨可尋址工作電極進一步適於能在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，測量對在所述中間室的多個位置上液體介質的細胞響應關聯的代謝變量。在另一方面，本發明涉及一種用於在液體介質中培養活細胞的生物反應器。在一個實施例中，所述生物反應器包括一基片以及用於區分室的裝置，所說的基片具有第一表面和相對第二表面，其間界定了用於接收細胞和液體介質帶有邊界的一室，所說的裝置將所述室區分為多個室，其中各多個亞室與多個亞室中至少另一個進行流體傳送。所述的區分裝置包括一屏障用於將所述室區分為第一亞室和第二亞室，且其中所述屏障有多孔性以允許所述第一亞室和所述第二亞室可進行流體傳送並允許至少一個預定類型的細胞可以透入所述第一亞室和所述第二亞室之間。可選擇地，所述的區分裝置包括第一屏障和第二屏障用於將所述室區分為第一亞室、第二亞室和第三亞室，且其中所述第一屏障有第一多孔性以允許所述第一亞室和中間亞室進行流體傳送及至少第一預定類型細胞可滲入所述第一亞室和所述第二亞室之間，且所述第二屏障有第二多孔性以允許所述第二亞室和所述第三亞室進行流體傳送及至少第二預定類型細胞可滲入所述第二亞室和所述第三亞室之間，其中所述第一多孔性和所述第二多孔性可以相同或不同。進一步可選擇地，所述區分裝置包括n多個屏障，n為大於0的整數，以將所述室區分為n+1個亞室，其中n屏障中的每個有相應的多孔性，其可以與其它屏障的多孔性相同或不同。從以下優選實施例的描述，結合如下附圖，將體現出本發明的這些及其它方面，然而其變化和改進可能仍未脫離本發明公開新穎性內容的精神和範圍。圖1A顯示了依照本發明一個實施例的生物反應器的俯視示意圖。圖1B顯示了依照本發明另一個實施例的生物反應器的透視圖。圖2是顯示了依照本發明另外一個實施例的生物反應器的俯視示意圖。發明詳述現在詳細描述本發明的不同實施例。關於附圖，除非在文中清楚指示其它，附圖中相同的部分始終用相同的數字標記標示。在這裡和如下全部權利要求描述中的所使用的，「一」和「所述的」的意思包括多個，除非在文中清楚的指示其它含義。而且在這裡和如下全部權利要求描述中所使用的「在……中」包括「在……中」和「在……上」，除非在文中清楚的指示其它含義。另外，在本說明書中所使用的一些術語在以下明確定義。定義在本
發明內容中，本說明書中所使用的術語一般在現有技術中，以及每個術語使用在特定內容處，是有通常含義。例如，依照本發明可以使用在分子生物學、微生物學和重組基因技術的常規技術。這些技術和相關術語的含義在文獻中被充分解釋。參見，例如Sambrook，FitschManiatis.MolecularCloningALaboratoryManual，SecondEdition(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork(此處查閱″SAMBROOKETAL.，1989″)；DNACLONINGAPRACTICALAPPROACH，VOLUMESIANDII(D.N.Glovered.1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gaited.1984)；NucleicAcidHybridization(B.D.HamesS.J.Higgins，eds.1984)；AnimalCellCulture(R.I.Freshney，ed.1986)；ImmobilizedCellsandEnzymes(IRLPress，1986)；B.E.Perbal，APracticalGuidetoMolecularCloning(1984)；F.M.Ausubeletal.(eds.)，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWileySons，Inc.(1994)。也可見，PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplications，Innisetal.，eds.，AcademicPress，Inc.，NewYork(1990)；Saikietal.，Science1998，239487；andPCRTechnologyPrinciplesandApplicationsforDNAAmplification，H.Erlich，Ed.，StocktonPress。用於描述本發明的某些術語將在以下或說明書其它位置論述，以給專業人員在描述本發明設備和方法及如何製造和使用它們時提供附加指導。為方便起見，某些術語被突出了，例如使用斜體字和/或引號標記。突出的使用對術語的範圍和含義沒有影響；術語的範圍和含義在相同語境中相同，無論其是否被突出。應意識到同一東西可能用多於一個的方式敘述。因此，可選擇的語言和同義詞可以用於任何一個或多個在此論述的術語，無論術語是否在此詳細闡述或論述都沒有被賦予任何特定意義。某些術語提供了同義詞。一個或多個同義詞的敘述不排除使用其它同義詞。在這個說明書中無論何處使用例子包括在此論述的任何術語的例子，僅是例證性的，且決不是限制本發明或任何示例術語的範圍和含義。同樣地，本發明不受在此說明書中給出的各種實施例的限制。這裡所用的「大約」或「近似地」一般意味在給出值或範圍的20％以內，優選在10％以內，且更優選在5％以內。這裡給出的數字數量是近似的，如果沒有特別說明，其意味術語「大約」或「近似地」能夠被推斷出。術語「分子」意味任何包含一個或多個原子的、清楚或可識別的物質結構單元，且包括例如多肽和多聚核苷酸。這裡所用的「細胞」意味著任何細胞，以及病毒或任何其他具有微觀尺寸的質粒，例如與生物細胞尺寸類似的大小，且包括任何原核生物或真核生物的細胞，如細菌、真菌、植物和動物細胞。細胞典型為球形，但也可以是細長的、扁平的、可變形的和不對稱的，例如非球形。一個細胞的尺寸或直徑典型的範圍在大約0.1至120微米，且典型為從大約1至50微米。細胞可以是活的或死的。如這裡所用的，細胞一般為活的除非另外說明。如這裡所用的，細胞可以是帶電的或非帶電的。例如，帶電顆粒可以被用於促進流動或探測，或者作為指示劑。活的或死的生物細胞可以帶電，例如通過使用表面活性劑，如SDS(十二烷基硫酸鈉)。細胞或多個細胞也可以包含細胞系。細胞系的例子包括肝臟細胞，巨噬細胞，成神經細胞瘤細胞，內皮細胞，腸細胞，雜交瘤、CHO、纖維原細胞細胞系、紅血球、電應激細胞(electricallyexcitablecells)，例如心臟細胞，肌細胞(AT1細胞)，共培養生長細胞，NG108-15細胞(廣泛用於成神經細胞瘤X神經膠質瘤雜交細胞系，ATCC#HB-12317)，初生神經元，由動物新生仔心室或心房分離出的初生心臟肌細胞，AT-1心房瘤心臟細胞，肝臟細胞也稱為肝細胞，分泌細胞(去極化且它分泌東西)胰腺β細胞分泌胰島素，HELA細胞(HelenLane)，HEK293人上皮腎細胞，紅細胞(初生紅血球)，淋巴細胞等等。每個細胞系可以包括一種或多種相同或不同的細胞。例如，肝臟細胞包含人肝細胞癌(″HEPG2″)細胞、CCL-13細胞和H4IIE細胞中的至少一種，巨噬細胞包括外周血單核細胞(″PBMC″)、和皮膚纖維細胞中的至少一種，成神經細胞瘤細胞包含U937細胞，內皮細胞包含人臍靜脈內皮細胞(″Huv-ec-c″)，且腸細胞包含CCL-6細胞。「培養」意味在可控制的人工環境中活細胞的生長。它可是微生物培養，如細菌，或動物或植物細胞之一的培養，如組織培養。依照本發明所述的生物反應器可用於這兩種培養或更多的培養類型。培養要求適當養料和能量來源，其由培養基提供，以及適當的物理環境。組織培養自身可以成為用於病毒的培養基，其僅與活細胞生長。僅一種細胞的培養被稱為純培養，其不同於混合或汙染培養。「組織」意味形態和機能或多或少相似的細胞的集合。動物體由四個初級組織組成，即上皮細胞、結締組織(包括骨胳、軟組織和血液)、肌肉和神經組織。組織分化和成熟過程被稱為組織發生。「傳感器」廣義定義為能夠測量可測量性質的任何儀器。例如傳感器可以是一熱探測器、電探測器、化學探測器、光學探測器、離子探測器、生物探測器、放射性同位元素探測器、電化學探測器、輻射探測器、聲學探測器、磁探測器、電容探測器、壓力探測器、超聲波探測器、紅外線探測器、微波運動探測器、電波探測器、電眼、圖像傳感器、它們的任何組合等等。本發明中可以選擇應用多種傳感器。術語「分析物」意味能由細胞消耗或生產的材料。感興趣的分析物例子包括pH、鉀、氧、乳酸鹽、葡萄糖、抗壞血酸鹽、5-羥色胺、多巴胺、銨、穀氨酸鹽、嘌呤、鈣、鈉、鉀、NADH、質子、胰島素、NO(氧化氮)等等。術語「流動」意味流體如液體或固體通過本發明裝置或在本發明方法中的任何移動，且包括但不限於任何流體流，及與所述流、在所述流中或逆著所述流的任何材料，無論材料是否由所述流攜帶。例如分子或細胞通過本發明裝置或在本發明方法中的移動，如在本發明的微流控晶片(microfluidicchip)上基片中通道的運動，包含流動。也就是，依照本發明，無論分子或細胞是否由流體流攜帶，或者無論分子或細胞是由一些其他直接或間接的力或驅動引起移動，及無論任何驅動力的性質是否是已知的或了解，也都包含流動。任何力的應用都可被用於產生流動，包括但不限於，壓力、毛細管現象、電滲、電泳、雙向電泳、光鑷、及它們的組合，而不論任何特別的理論或作用機制，只要依照本發明分子或細胞可被導引來檢驗、測量或分類。「液體或介質」是一流體，其可以包含一種或多種影響細胞生長的物質，一種或多種分析物、或任何它們的組合。介質可提供被一種或多種細胞消耗的一種或多種分析物。介質可以有由一種或多種細胞生成的一種或多種分析物。介質也可以同時有由一種或多種細胞消耗的一種或多種分析物和由一種或多種細胞生成的一種或多種分析物。介質可由天然材料組成，例如酶消化液、酵母或牛肉浸膏、牛奶、土豆片、或雞胚胎。人造介質可依照特定配方由混合多種成份製備。複合介質包含至少一種來源於天然材料的原材料成分，因而有未知的化學組分。化學方法定義的或合成的介質有已知化學結構和每個組分含量。「輸入區」是接收分子或細胞或液體的生物反應器的一個區域。所述輸入區可以包含輸入口和通道，井或貯藏器、開口、及可使分子或細胞進入設備的其他特徵。如果需要，生物反應器可以包含多於一個的輸入區。所述輸入區與通道進行流體傳送且由此為上遊。「輸出區」是收集或分配分子或細胞或液體的生物反應器一個區域。輸出區在識別區下遊，且可以包含輸出通道或輸出口。如果需要，生物反應器可包含多於一個的輸出區。「分析單元」是微製造基片，如微制晶片，其有至少一個輸入區，至少一個通道和室，至少一個探測區及至少一個輸出區。本發明設備可以包括多個分析單元。「通道」是本發明生物反應器的路徑，其允許分子或細胞流動以經過用於探測(識別)或測量的一探測區。所述探測和識別區可以位於或構成在通道內。所述通道典型地在輸入口或輸入區進行流體傳送，其允許分子或細胞或液體流動至通道內。所述通道也典型地在輸出區或輸出口進行流體傳送，其允許分子或細胞或液體流動至通道外。所述通道也能用作生長細胞的室，反之亦然。「探測區」或「傳感區」或「室」是生物反應器內的一區域，典型地與在通道內或與通道(或其中一部分)重合，和/或在探測環路中或與探測環路重合，生長、被識別、表徵、雜交、測量、分析或維持(等等)的分子或細胞在此基於預定特性被檢測。在一個實施例中，分子或細胞每次檢測一個。在另一個實施例中，分子、細胞或樣品被一起檢測，例如按組、按排、快速、同時或同期連續或平行排列，或採用親合色譜法。「反應時間」是關注的體系需要響應變化的時間。例如，細胞反應時間是用於至少一個細胞生理過程適應或響應其環境變化所需要的時間。每種類型的細胞對於其環境中特定變化都有其自己的的特徵反應時間。傳感器反應時間是用於傳感器響應其探測量變化所需要的時間。例如電化學傳感器的反應時間由傳感器大小及傳感器活性表面保護塗層的厚度和性質確定。微流控體系(microfluidicsystem)反應時間通過對環境變化的細胞反應時間、化學物擴散過傳感區所需時間、傳感器反應時間和由驅動器控制的分析物擴散時間來決定。「細菌」是非常小的—通常直徑0.3-2.0微米—且相對簡單的微生物，具有原核細胞類型結構。每個細菌細胞由有相似特徵的已存在細胞分離，或通過兩個這種細胞在有性過程中的結合而產生。「原生動物」意味著傳統動物界分出的一組真核微生物。儘管名稱表示原始動物，一些原生動物(植物鞭毛蟲和粘液菌)表現很多類似植物特性以證明他們是植物。原生動物尺寸範圍從1至106微米。鞭毛蟲、纖毛蟲和肉足綱是已知的群體。儘管生殖和體遊動孢子的顯著區別可以標記某些群體，如團藻，原生動物不產生組織和器官。現在參考圖1-2描述幾個實施例，在圖1-2中相同數字標記相同部分。發明綜述本發明的發明人克服了現有技術中的缺陷，開發了新的生物反應器，除其他新穎性和創造性特徵外，其能提供控制的化學激素梯度獨立於灌注流動，並且允許細胞基質外滲。將近來在納米濾層製作57-61上的發展用於製造依照本發明的灌注-膜生物反應器，其在所說的設備中可控制的、穩定的化學激素或生長因子梯度的條件下，允許在1毫米×1毫米×100微米體積內在接近組織的密度下細胞混合培養生長，以模仿體內瘤微環境。本發明的一個優點是可以構造定製設備以使分離的灌注和細胞輸送系統允許在實驗過程中獨立控制剪應力和化學激素梯度。此外，光學和電化學代謝微傳感器安置在這些生物反應器中，以允許在反應器選擇區域同時定量局部代謝和化學環境(乳酸鹽、pH、O2等)，其間細胞移動或細胞信號發放事件可由螢光顯微鏡成像。因此，根據本發明所述生物反應器可以被認為是下一代移動生物反應器，其可越過簡單的MTW系統(MicroTransWell)邁向那種更接近複製體外微環境活組織的體系。此外，根據本發明的生物反應器應用微製造技術、微流控(microfluidics)、及微生物傳感器(microbiosensors)，給瘤血管生成及白細胞和癌細胞外滲的分子機制研究提供了機會。例如，在脈管形成和再造中Tie2和VEGF作用的系統檢查及識別更多特定的用於抗血管生成治療的分子靶標。類似的微設備模型(microdevicemodel)可以用於檢查白細胞和癌細胞外滲。這些設備給寄主鼠瘤外植體提供了適當的細胞環境，因此潛在提供了用於瘤活組織檢查材料的轉移分析。這些生物反應器中的代謝傳感將幫助提供對瘤微環境的更清楚了解和確定我們的體外系統的有效性62-65。另外，平面鮑仁斯坦(Borenstein)設計的局限性是可用的毛細管表面區太小以至於不支持細胞實際體積的增長，這點已被本發明克服，改進這個問題是建造一個多層插入供給和返回的生物反應器，其允許平面生物反應器全部表面被毛細管覆蓋，及毛細管灌注的細胞。更為明確的一方面，本發明涉及生物反應器。這些生物反應器是生物微電動機械式系統((BioMEMS)，其用作移動微環境以研究瘤血管生成、瘤轉移和白細胞遷移的分子機制，也可起到更常規的組織生物反應器和灌注系統的作用。除其他方面外，這些微流控設備的一個獨特方面是適當細胞培養和微製造技術的結合，其允許細胞在小的、限定的、很好灌注的體積組織密度下生長，提供多化學激素和生長因子梯度、剪切力、組織灌注、及物理屏蔽對細胞遷移滲透性的獨立控制，並且允許在細胞移動、內滲、外滲、血管生成和其他細胞過程中對正常和癌細胞的細緻的光學和電化學觀測。近來在納米濾層(nanofilter)製作57-61上的發展可用於實施本發明以提供灌注-膜生物反應器，其在設備中在可控制的、穩定的化學激素或生長因子梯度的條件下，允許在1毫米×1毫米×100微米體積內在接近組織的密度下細胞混合培養生長，以模仿體內瘤微環境。本發明的一個優點是可以構造定製設備以使分離的灌注和細胞輸送系統允許在實驗過程中獨立控制剪應力和化學激素梯度。此外，光學和電化學代謝微傳感器可安置在這些生物反應器中，以允許在反應器選擇區域同時定量局部代謝和化學環境(乳酸鹽、pH、O2等)，其間細胞移動或細胞信號發放事件可由螢光顯微鏡成像。因此，移動生物反應器的下一代最終將越過簡單MTW系統(MicroTransWell)邁向一個更接近複製體外微環境活組織的體系。微製造技術、微流控和微生物傳感器的應用，給瘤血管生成、及白細胞和癌細胞外滲的分子機制研究提供了機會。例如，在脈管形成和再造中Tie2和VEGF的作用的系統檢查及可識別更多特定的用於抗血管生成治療的分子靶標。類似的微設備模型可以用於檢查白細胞和癌細胞外滲。這些生物反應器給寄主鼠瘤外植體提供了適當的細胞環境，因此潛在提供了用於瘤活檢材料的轉移分析。在這些生物反應器中代謝傳感將幫助提供對瘤微環境的更清楚的認識並確定我們的體外系統的有效性62-65。以下給出了根據本發明實施例的典型設備、它們的應用和有關觀測，其並非是意圖限定本發明範圍。注意用在實施例中的標題或副標題是為了方便讀者，其決不應限定本發明範圍。此外在這裡會提及和披露某些理論，然而，無論它們正確或是錯誤，都絕不應限定本發明範圍，只要所用的設備或它們的應用是根據本發明實施的，沒有關係任何特定理論或操作。實施例單屏障生物反應器現在參考圖1A和圖1B，本發明可以由結合圖1A和圖1B所示的發明生物反應器100來實現。在一個實施例中，生物反應器100包括一具有第一表面140a和相對第二表面104b的第一基片140，其間界定了用於接收細胞和液體介質的室101。生物反應器100有一將所述室101分成第一亞室102和第二亞室103的屏障104，其中屏障104有多孔性以允許所述第一亞室102和所述第二亞室103進行流體傳送，並且允許至少一個預定的細胞類型在所述第一亞室102和所述第二亞室103之間透過。屏障104的多孔性也可選擇為不讓任何細胞透過。如所構成的，第一亞室102適於接收第一類型材料如細胞113且第二亞室103適於接收第二類型材料如細胞114，其中每個所述第一類型材料和所述第二類型材料包含選自細胞、化學製劑及流體中的至少一種。所述細胞可以是任何類型的活細胞，包括但不限於細菌、原生動物、或兩者、正常細胞、瘤細胞、或它們的組合。生物相容塗層116可應用在生物反應器100的室壁上，其中生物相容塗層116包含可以抑制細胞粘著於所述生物相容塗層、增強細胞粘著於所述生物相容塗層、或起螢光標記或細胞狀態指示劑作用的材料。生物反應器100進一步包括至少一個或多個輸入口105、106和一個或多個相應的輸入轉移通道112、107。如所構成的，輸入轉移通道112與相應的輸入口105和第一亞室102可進行流體傳送，且輸入轉移通道107與相應的輸入口106和第二亞室103可進行流體傳送，以允許分別輸送細胞、流體或化學製劑至相應亞室102或103。例如，流體可從一個外部設備(未顯示)通過輸入口105和相應的輸入轉移通道112引入到第一亞室102。輸入口105、106各與外部設備或埠(未顯示)進行流體傳送。生物反應器100另外包括至少一個或多個輸出口111、109和一個或多個相應輸出轉移通道110、108。如所構成的，輸出轉移通道110可與相應的輸出口111和第一亞室102進行流體傳送，且輸入轉移通道108可與相應輸出口109和第二亞室103進行流體傳送，以允許分別從相應亞室102或103中移出細胞、流體或化學製劑。例如，流體可從第一亞室102通過輸出轉移通道110和相應輸出口111引出。輸出口111、109每個均可與外部設備或埠(未顯示)進行流體傳送。生物反應器100進一步包括至少一個或多個輔助口115和一個或多個輔助通道115a。如所構成的，每個輔助通道115a可與一相應輔助口115及輸入轉移通道112、107和輸出轉移通道110、108中相應的一個進行流體傳送，以衝洗相應轉移通道。輔助口115每個均與外部設備或埠(未顯示)進行流體傳送。輔助口115和輔助通道115a被用於防止生物反應器100中細胞或細胞碎片阻塞。它們也可以用於選擇性施加塗敷到有流體傳送的通道中。生物反應器100另外包括一個或多個訪問口117和一個或多個訪問通道117a。如所構成的，每個訪問通道117a可與一相應訪問口117和第一亞室102及第二亞室103中相應的一個進行流體傳送，用於允許細胞、流體、化學製劑、塗料或傳感材料向相應亞室的輸送或移出。訪問口117和相應訪問通道117a的位置設定以使其可提供向第一亞室102和第二亞室103的直接訪問為宜。例如，流體可快速通過訪問通道117a和相應訪問口117引入第一亞室102中，因為訪問口117和第一亞室102之間的距離在這個實施例中最短。每個訪問口117均可與外部設備或埠(未顯示)進行流體傳送。此外，生物反應器100有一第二基片150，其中第二基片150位於鄰近第一基片140的第一表面140a處，且界定了多個連接通道155。所形成的每個連接通道155可使其與如以上所述的輸入口105、106，輸出口111、109，輔助口115和訪問口117中相應的一個進行流體傳送。生物反應器100進一步包括相應於多個連接通道155的多個連接口151，每個連接口151形成有通道153並且其相對於所述第二基片150的位置設定以使每個連接口151的通道153可與第二基片150中形成的連接通道155中相應的一個進行流體傳送為宜，如圖1B所示。第一基片140由玻璃、聚脂薄膜、聚二甲基矽氧烷(PDMS)、矽、聚合物、半導體、或它們的任何組合所構成。屏障104由多孔材料形成。屏障104是微製造的以使其形成允許在所述第一亞室102和所述第二亞室103之間進行流體傳送的結構，其可允許某些預定類型的細胞透過屏障104而其他類型細胞則不能透過。例如在圖1A和1B所示的實施例中，屏障104形成有彼此間隔的多個柱(posts)，以允許細菌而原生動物不能通過。生物反應器100進一步包括一第三基片160及位於所述第三基片中的裝置，所說的第三基片160位於鄰近第一基片140的第一表面處，所說的裝置適於電化學測量對第一亞室102和第二亞室103之一或兩者中液體介質的細胞響應。第三基片160可以由半導體材料形成，例如矽。在如圖1B所示的一個實施例中，電化學測量的裝置包括參考電極161、反電極162、多個邊緣連接器墊板164和多個導電端子163。第一導電端子163將參考電極161電連接至相應的邊緣連接器墊板164，且第二導電端子163將反電極162電連接至相應的邊緣連接器墊板164。用於電化學測量的裝置進一步包括多個單獨可尋址工作電極165，每一個多個單獨可尋址工作電極165均通過相應導電端子163被電連接至相應的邊緣連接器墊板164。多個單獨可尋址工作電極165的探測頭戰略性位於圖1B輪廓線166所示區域。實際操作中，引入到第一亞室102和第二亞室103之一或兩者的液體介質可以包括一種或多種分析物，且多個單獨可尋址工作電極適用於在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，傳感在所述室101多個位置上液體介質的單一分析物濃度或在所述室101多個位置上液體介質的多種分析物濃度。多個單獨可尋址工作電極進一步適用於在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，測量對在所述室101的多個位置上液體介質的細胞響應關聯的代謝變量。多個單獨可尋址工作電極165的探測頭戰略性地位於與室101相應的輪廓線166所示區域以執行此類工作。生物反應器100進一步還包括一第四基片170及位於第四基片170中的裝置，其中第四基片170位於所述第一基片140的第二表面140b上面，所說的裝置適於光學測量對在第一亞室102和第二亞室103中至少一個的液體介質的細胞響應。第四基片170至少是部分透明的。例如它可以由半導體材料或玻璃或兩者形成。在如圖1B所示的一實施例中，光學測量裝置包括多個光學傳感器171、多個邊緣連接器墊板173和多個端子172，各將光學傳感器171連接至相應邊緣連接器墊板173。多個光學傳感器171可包含選自發光二級管和光電二極體對、光纖耦合器和光學探測頭一組中的至少一個設備。實際操作中，引入至第一亞室102和第二亞室103之一或兩者的液體介質可包括一個或更多分析物，且多個光學傳感器171適於在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，傳感在室101多個位置上液體介質的單一分析物濃度或在室101多個位置上液體介質的多種分析物濃度。多個光學傳感器171進一步適於在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，測量對在室101的多個位置上的液體介質的細胞響應關聯的代謝變量。多個光學傳感器171的探測頭戰略性地位於與室101相應的輪廓線174所示區域以執行此類工作。多屏障生物反應器參考圖2，本發明可以由結合圖2所示的發明生物反應器700來實現。在一個實施例中，生物反應器700包括一具有第一表面和相對第二表面的基片730，其間界定了用於接收細胞和液體介質的室732，其中所述室732形成有中心734和邊界736。生物反應器700有一第一屏障738，其圍繞中心734和部分室732以形成一個中央室706，和一第二屏障740，其位於第一屏障738和邊界736之間以形成一個中間室705和一個外室704。在一個實施例中，第一屏障738有第一多孔性，以允許中央室706和中間室705進行流體傳送及允許至少第一預定類型細胞在所述中央室706和所述中間室705之間透過，且第二屏障740有第二多孔性，以允許外室704和中間室705進行流體傳送及允許至少第二預定類型細胞在所述外室704和所述中間室705之間透過。此外，中央室706適於接收第一類型材料例如瘤細胞714，中間室705適於接收第二類型材料例如正常組織細胞713，且外室704適於接收第三類型材料例如內皮細胞712。每個第一類型材料、第二類型材料和第三類型材料包含選自細胞、化學製劑及流體一組中的至少一種。第一預定類型細胞包括瘤細胞714，其通常接收於中央室706中形成模擬瘤空間。第二預定類型細胞包括正常組織細胞713，其通常接收於中間室705中形成模擬組織空間。此外，外室704形成模擬脈管空間，其適於接收內皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、任何它們的組合、或其他免疫細胞類型。生物相容塗層742被用於在邊界736處的室壁上，其中生物相容塗層742包括可以抑制細胞粘著於所述生物相容塗層、增強細胞粘著於所述生物相容塗層、或起螢光標記或細胞狀態指示劑作用的材料。生物反應器700進一步包括一個或更多輸入或輸出口701及相應的一個或更多輸入或輸出轉移通道751，每個輸入或輸出轉移通道751與相應輸入或輸出口701及外室704進行流體傳送，以允許向外室704輸送細胞、流體或化學製劑。生物反應器700另外可包括一個或更多輸入或輸出口702和相應的一個或更多輸入或輸出轉移通道752，其中每個輸入或輸出轉移通道752與相應輸入或輸出口702和中央室706進行流體傳送，以允許向中央室706輸送細胞、流體、或化學製劑。生物反應器700進一步包括一個或更多輸入或輸出口703和相應的一個或更多輸入或輸出轉移通道753，其中每個輸入或輸出轉移通道753與相應輸入或輸出口703和中間室705進行流體傳送，用於允許向中間室705輸送細胞、流體、或化學製劑。基片730由玻璃、聚脂薄膜、聚二甲基矽氧烷(PDMS)、矽、聚合物、半導體、或它們的任何組合所構成。第一屏障738由多孔材料形成。第一屏障738是微製造的以形成允許在所述中央室706和中間室705之間進行流體傳送的第一結構。第二屏障740由多孔材料形成。第二屏障740是微製造的以形成允許在外室704和中間室705之間進行流體傳送的第二結構。第一屏障738和第二屏障740可以用相同或不同的材料形成。且第二結構可以與第一結構相同或不同。例如，在圖2所示的實施例中，第一屏障738由彼此間隔比第二屏障740更密的多個柱形成。第一屏障738和第二屏障740可以形成相同或不同的形狀。例如，在圖2所示實施例中，第一屏障738和第二屏障740都基本為圓形。邊界736也可以是各種幾何形狀。例如，在圖2所示實施例中，邊界736基本為圓形。生物反應器700進一步包括裝置，其戰略性地定位，並適於電化學測量對一個或更多外室704、中間室705和中央室706中液體介質的細胞響應。在圖2所示實施例中，用於電化學測量的裝置包括參考電極707、反電極708和多個單獨可尋址工作電極。在實際操作中，引入到外室704、中間室705和中央室706之一或多個的液體介質可以包括至少一種或多種分析物，且多個單獨可尋址工作電極分別包括第一組單獨可尋址工作電極709、第二組單獨可尋址工作電極710和第三組單獨可尋址工作電極711。對於圖2所示實施例，第一組單獨可尋址工作電極709適於能在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，傳感在外室704多個位置上液體介質的單一分析物濃度或在外室704多個位置上液體介質的多種分析物濃度。第一組單獨可尋址工作電極709進一步適於能在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，測量對在外室704多個位置上液體介質的細胞響應關聯的代謝變量。第二組單獨可尋址工作電極710適於能在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，傳感在中央室706多個位置上液體介質的單一分析物濃度或在中央室706多個位置上液體介質的多種分析物濃度。第二組單獨可尋址工作電極710進一步適用於能在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，測量在中央室706多個位置上液體介質的細胞響應關聯的代謝變量。同樣地，第三組單獨可尋址工作電極711適於能在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，傳感在中間室705多個位置上液體介質的單一分析物濃度或在中間室705多個位置上液體介質的多種分析物濃度。第三組單獨可尋址工作電極711進一步適於能在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，測量對在中間室705多個位置上液體介質的細胞響應關聯的代謝變量。如所構成的，除其他方面外，生物反應器700可用於供養、培養、觀察、探測和探查細胞、細胞集合、細胞形成的生物膜及相關細胞活性。例如，如圖2所示，生物反應器700允許發生一系列細胞活動，包括細胞715，其可以為免疫類型細胞例如巨噬細胞或中性粒細胞，經過外滲穿過第二屏障740從外室704至中間室705，且細胞716，其可以為通過周圍組織自中央室706轉移至脈管空間的瘤細胞，經過內滲穿過第二屏障740從中間室705至外室704，及細胞717，例如內皮細胞，經歷管形成穿過第二屏障740，最終導致腫瘤血管形成。儘管展示了本發明多種實施例，但應理解在設備元件形式排列和方法步驟上可以作出改變以實施本發明，如本領域技術人員所知，未背離權利要求所陳述的本發明的範圍。此外，上述實施例僅用於舉例說明本發明原理，且不是意圖將權利要求限定在所披露的元素。當然，由於在不背離本發明精神和範圍時本發明很多實施例可以被實現，因此本發明存在於附加在下文中的權利要求中。參考文獻目錄1.Godbey，W.T.andAtala，A.，InVitroSystemsforTissueEngineering，Ann.N.Y.，Acad.Sci.，961，10-26，2002.2.Murdin，A.D.，Thorpe，J.S.，Kirkby，N.，Groves，D.J.，Spier，R.E.，ImmobilisationandGrowthofHybridomasinPackedBeds，InBioreactorsandbiotransformations，Moody，G.W.andBaker，P.B.，eds.ElsevierAppliedSciencePublishers，London，NewYork，99-110，1987.3.DeBartolo，L.，Jarosch-VonSchweder，G.，Haverich，A.，Bader，A.，ANovelFull-ScaleFlatMembraneBioreactorUtilizingPorcineHepatocytesCellViabillityandTissue-SpecificFunctions，Biotechnol.Prog.，16，102-108，2000.4.McDuffie，N.G.，CellCultureBioreactiors.InBioreactorDesignFundamentals，Butterworth-Heinemann，Boston，93-119，1991.5.Drioli，E，etal.，BiocatalytieMembraneReactors，ApplicationsinBiotechnologyandthePharmaceuticalIndustry，TaylorFrancis，London，Philadelphia，1999.6.Labecki，M.，Bowen，B.D.，Piret，J.M..，ProteinTransportinUltrafiltrationHollow-FiberBioreactorsforMammalianCellCulture，InMembraneSeparationsinBiotechnology，Wang，W.K.，ed.，M.Dekker，NewYork，1-62，2001.7.Nollert，M.U.，Diamond，S.L.，McIntire，L.V.，HydrodynamicShear-StressandMass-TransportModulationofEndothelial-CellMetabolism，Biotechnol.Bioeng.，38，588-602，1991.8.Augenstein，D.C.，Sinskey，A.J.，Wang，D.I.C.，EffectofShearonDeathofTwoStrainsofMammalianTissueCells，Biotechnol.Bioeng.，13，409-418，1971.9.Millward，H.R.，Bellhouse，B.J.，Sobey，I.J.，TheVortexWaveMembranceBioreactorHydrodynamicsandMassTransfer，ChemicalEngineeringJournalandtheBiochemicalEngineeringJournal，62，175-181，1996.10.Beeton，S.，Bellhouse，B.J.，Knowles，C.J.，Millward，H.R.，Nicholson，A.M.，Wyatt，J.R.，ANovelMembraneBioreactorforMicrobial-Growth，Appl.Microbiol.Biotechnol.，40，812-817，1994.11.Hu，W.S.AndAuins，J.G.，Large-ScaleMammalianCellCulture，Curr.Opin.Biotechnol.，8，148-153，1997.12.Tobert，W.R.，Lewis，C.JR.，White，P.J.，Feder，J.，PerfusionCultureSystemsforProductionofMammalianCellBiomolecules，InLarge-ScaleMammaliancellculture，Feder，J.andTolbert.W.R.，eds.，AcademicPress，Orlando，97-123，1985.13.Voisard，D.，Meuwly，F.，Ruffieux，P.A.，Baer，G.，Kadouri，A.，PotentialofCellRetentionTechniquesforLarge-ScaleHigh-DensityPerfusionCultureofSuspendedMammalianCells，Biotechol.Bioeng.，82，751-765，2003.14.MacNeill，B.D.，Pomerantseve，I.，Lowe，H.C.，Oesterle，S.N.，Vacanti，J.P.，TowardaNewBloodVessel，Vasc.Med.，7，241-246，2002.15.Wu，H.K.，Odom，T.W.，Chiu，D.T.，Whiteside，G.M.，FabricationNofComplexThree-DimensiohalMicrochannelSystemsinPDMS，J.Am.Chem.Soc.，125，554-559，2003.16.Griffith，L.G.，EmergingDesignPrinciplesinBiomaterialsandScaffoldsforTissueEngineering，ReparativeMedicineGrowingTissuesandOrgans，961，83-95，2002.17.Snyder，J.D.andDesai，T.A.，FabricationofMultipleMicroscaleFeaturesonPolymerSurfacesforApplicationsinTissueEngineering，BiomedicalMicrodevices，3，293-300，2001.18.Solan，A.，Prabhakar，V.，Niklason，L.，EngineeredVesselsImportanceoftheExtracellularMatrix，Transplant.Proc.，33，66-68，2001.19.Griffith，L.G.andNaughton，G.，TissueEngineering-CurrentChallengesandExpandingOpportunities，Science，295，1009-+，2002.20.Powers，M.J.，Domansky，K.，Kaazempur-Mofrad，M.R.，Kalezi，A.，Capitano，A.，Upadhyaya，A.，Kurzawski，P.，Wack，K.E.，Stolz，D.B.，Kamm，R.，Griffith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述生物反應器，其中所述多個光學傳感器進一步適於能在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，測量對在所述室的多個位置上液體介質的細胞響應關聯的代謝變量。31.如權利要求25所述生物反應器，其中所述第四基片包含半導體材料。32.如權利要求31所述生物反應器，其中所述第四基片是至少部分透明的。33.一種用於在液體介質中培養活細胞的生物反應器，包含a.一基片，其具有第一表面和相對第二表面，其間界定了一室用於接收細胞和液體介質，其中所述室形成有一中心和一邊界。b.一第一屏障，其圍繞所述中心和部分所述室形成一中央室；和c.一第二屏障，其位於所述第一屏障和所述邊界之間，形成一中間室和一外室；其中所述第一屏障有第一多孔性，以允許所述中央室和所述中間室進行流體傳送及允許至少一種第一預定類型細胞在所述中央室和所述中間室間透過，且所述第二屏障有第二多孔性，以允許所述外室和所述中間室進行流體傳送及允許至少一種第二預定類型細胞在所述外室和所述中間室間透過。34.如權利要求33所述生物反應器，其中所述中央室適於接收第一類型材料，所述中間室適於接收第二類型材料，且所述外室適於接收第三類型材料。35.如權利要求34所述生物反應器，其中每個所述第一類型材料、所述第二類型材料和所述第三類型材料包含選自細胞、化學製劑及流體一組中的至少一種。36.如權利要求33所述生物反應器，其中所述第一預定類型細胞包括瘤細胞，其通常被接收於所述中央室中對應一腫瘤空間。37.如權利要求36所述生物反應器，其中所述第二預定類型細胞包括正常組織細胞，其通常被接收於所述中間室中對應一組織空間。38.如權利要求37所述生物反應器，其中所述外室對應於一脈管空間適於接收內皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、任何它們的組合、或其他免疫細胞類型。39.如權利要求33所述生物反應器，進一步包括一生物相容塗層施於所述邊界的所述室壁上。40.如權利要求39所述生物反應器，其中所述生物相容塗層包含一種材料，其可抑制細胞粘著於所述生物相容塗層、增強細胞粘著於所述生物相容塗層、或起螢光標記或細胞狀態指示劑作用。41.如權利要求33所述生物反應器，進一步包括至少一個輸入或輸出口和一個輸入或輸出轉移通道，所述輸入或輸出轉移通道可與所述輸入或輸出口及所述外室進行流體傳送，以允許細胞、流體或化學製劑向外室的輸送。42.如權利要求41所述生物反應器，進一步包括至少一輸入或輸出口和一輸入或輸出轉移通道，所述輸入或輸出轉移通道可與所述輸入或輸出口及所述中央室進行流體傳送，以允許細胞、流體或化學製劑向所述中央室輸送。43.如權利要求42所述生物反應器，進一步包括至少一輸入或輸出口和一輸入或輸出轉移通道，所述輸入或輸出轉移通道可與所述輸入或輸出口及所述中間室進行流體傳送，以允許細胞、流體或化學製劑向所述中間室輸送。44.如權利要求33所述生物反應器，其中所述基片由玻璃、聚脂薄膜、聚二甲基矽氧烷、矽、聚合物、半導體、或它們的任何組合所構成。45.如權利要求33所述生物反應器，其中所述第一屏障包含多孔材料。46.如權利要求45所述生物反應器，其中所述第一屏障是微製造的以形成允許在所述中央室和所述中間室之間進行流體傳送的第一結構。47.如權利要求46所述生物反應器，其中所述第二屏障包含多孔材料。48.如權利要求47所述生物反應器，其中所述第二屏障是微製造的以形成允許在所述外室和所述中間室之間進行流體傳送的第二結構，且所述第二結構與所述第一結構不同。49.如權利要求33所述生物反應器，進一步包含裝置，其適於電化學測量對所述外室、所述中間室和所述中央室中至少一個的液體介質的細胞響應。50.如權利要求49所述生物反應器，其中用於電化學測量的所述儀器包含i.一參考電極；ii.一反電極；和iii.多個單獨可尋址工作電極。51.如權利要求50所述生物反應器，其中所述液體介質包括至少一種分析物，且其中所述多個單獨可尋址工作電極包含一第一組單獨可尋址工作電極，其適於能在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，傳感在所述外室多個位置上液體介質的單一分析物濃度或在所述外室多個位置上液體介質的多種分析物濃度。52.如權利要求51所述生物反應器，其中所述第一組單獨可尋址工作電極進一步適於能在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，測量對在所述外室的多個位置上液體介質的細胞響應關聯的代謝變量。53.如權利要求52所述生物反應器，其中所述多個單獨可尋址工作電極進一步包括一第二組單獨可尋址工作電極，其適於能在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，傳感所述中央室多個位置上的液體介質的單一分析物濃度或所述中央室多個位置上的液體介質的多種分析物濃度。54.如權利要求53所述生物反應器，其中所述第二組單獨可尋址工作電極進一步適於能在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，測量對所述中央室的多個位置上液體介質的細胞響應關聯的代謝變量。55.如權利要求54所述生物反應器，其中所述多個單獨可尋址工作電極包括一第三組單獨可尋址工作電極，其適於能在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，傳感所述中間室多個位置上的液體介質的單一分析物濃度或在所述中間室多個位置上的液體介質的多種分析物濃度。56.如權利要求55所述生物反應器，其中所述第三組單獨可尋址工作電極進一步適於能在短於涉及細胞的至少一個細胞生理活性特徵反應時間的時間間隔內，測量對所述中間室多個位置上液體介質的細胞響應關聯的代謝變量。57.如權利要求33所述生物反應器，其中所述第一屏障基本為圓形。58.如權利要求33所述生物反應器，其中所述第二屏障基本為圓形。59.如權利要求33所述生物反應器，其中所述邊界基本為圓形。60.一種用於在液體介質中培養活細胞的生物反應器，包含a.一基片，其具有第一表面和相對第二表面，其間界定了帶有邊界的一室用於接收細胞和液體介質；和b.區分所述室為多個室的裝置；其中每個多個亞室可與多個亞室中至少另一個進行流體傳送。61.如權利要求60所述生物反應器，其中所說的區分的裝置包含一屏障，將所述室區分為第一亞室和第二亞室，且其中所述屏障有多孔性以允許所述第一亞室和所述第二亞室可進行流體傳送並允許至少一種預定細胞類型可以透過所述第一亞室和所述第二亞室之間。62.如權利要求60所述生物反應器，其中所說的區分的裝置包含一第一屏障和一第二屏障，將所述室區分為第一亞室、第二亞室和第三亞室，且其中所述第一屏障有第一多孔性以允許所述第一亞室和所述中間亞室進行流體傳送以及至少第一預定細胞類型滲過所述第一亞室和所述第二亞室之間，且所述第二屏障有第二多孔性以允許所述第二亞室和所述第三亞室進行流體傳送及至少第二預定細胞類型滲過所述第二亞室和所述第三亞室之間。63.如權利要求62所述生物反應器，其中所述第一多孔性和所述第二多孔性可以相同或不同。64.如權利要求60所述生物反應器，其中所說的區分的裝置包含n多個屏障，n為大於0的整數，將所述室區分為n+1個亞室。65.如權利要求64所述生物反應器，其中每個n個屏障有相應的多孔性，其可以與其它屏障的多孔性相同或不同。全文摘要一種用於在液體介質中培養活細胞的生物反應器。在本發明一個實施方式中，所述生物反應器有一第一基片(140)，其具有第一表面(140a)和相對第二表面(140b)，其間界定了用於接收細胞和液體介質的室(101)。所述生物反應器進一步有一屏障(104)將所述室(101)分成第一亞室(102)和第二亞室(103)，其中所述屏障有多孔性以允許所述第一亞室(102)和所述第二亞室(102)可進行流體傳送，且允許至少一個預定的細胞類型在所述第一亞室(102)和所述第二亞室(102)之間透過。文檔編號C12M3/04GK1678731SQ03820506公開日2005年10月5日申請日期2003年8月27日優先權日2002年8月27日發明者約翰·P·威克思沃,費朗茨·J·鮑德巴赫,大衛·克裡福,弗雷德裡克·R·哈賽頓,尤金·裡博福,愛爾絲·波克,蘭德爾·S·瑞斯芮,馬克·斯萃姆雷申請人:範德比爾特大學