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肽硼酸酯類蛋白酶抑制劑或其組合物在治療肺部疾病的藥物中的應用的製作方法

2023-07-02 16:23:36


本發明涉及一種藥物的新用途,具體是一種肽硼酸酯類蛋白酶抑制劑的新用途。
背景技術:
:急性肺損傷(ALI)是指在嚴重感染、休克、創傷及燒傷等由心源性以外的直接和間接致傷因素導致的致肺泡上皮細胞及肺血管內皮細胞損傷,造成彌散性肺間質及肺泡內水腫、肺不張,導致急性進行性呼吸困難和低氧血症,其發展至嚴重階段(氧合指數<200)被稱為急性呼吸窘迫症候群(ARDS)。根據1994年歐美聯席會議提出的ALI/ARDS診斷標準,2005年美國ALI,ARDS發病率分別在每年79/10萬和59/10萬。病因不同,ARDS發病率也不同。嚴重感染時ALI/ARDS發病率可高達25%~50%,大量輸血可達40%,多發性創傷達到11%~25%。同時存在2個或3個危險因素時,ALI/ARDS發病率進一步升高。另外,危險因素持續作用時間越長,ALI/ARDS的發病率越高,危險因素持續24、48及72h小時,ARDS患病率分別為76%,85%和93%。雖然不同研究對ALI/ARDS病死率的報導差異較大(15~72%),總體來說目前ARDS的病死率仍較高。對1994-2006年國際上正式發表的72個ARDS臨床研究進行薈萃分析,11426例ALI/ARDS病人的病死率為43%。我國上海市15家成人ICU2001年3月至2002年3月ARDS病死率也高達68.5%。近來,RiteshA等的薈萃分析,提示肺內因素與肺外因素所致的ALI在病死率上無差異。目前,急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群的臨床治療主要是根據其病理生理改變和臨床表現進行針對性或支持性治療。主要治療原則為積極治療原發病,控制感染,改善通氣和組織供氧,防止進一步的肺損傷和肺水腫。國內外已試圖針對其主要發病環節,進行藥物治療,以減輕肺和全身炎症。1、非皮質醇類抗炎藥物:此類藥物主要包括前列腺素代謝的脂氧合酶和環氧合酶通路抑制劑,如布洛芬等。但是,這類藥物須在早期的時候應用,才有效果。2、糖皮質激素:糖皮質激素的抗炎機制主要是與GR結合形成GC-GR複合體形式與DNA的順式元件或核轉錄因子(NF-κB、AP-1等)結合,從而調節基因的表達,或者通過「非基因組效應」途徑發揮抗炎作用。糖皮質激素治療急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群的效果理論上是可行的,但是其用藥時機、劑量、療程以及併發症都有待進一步的研究。3、氧自由基清除劑和抗氧化劑:此類藥物有維生素E、超氧化物歧化酶(SOD)等,但是,目前臨床上應用的經驗不多。綜上所述,目前,亟需一種臨床有效的藥物來對急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群進行治療。技術實現要素:本發明提供一種肽硼酸酯類蛋白酶抑制劑或其組合物,在治療急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群等肺部疾病藥物中的應用。本發明所提及的肽硼酸酯類蛋白酶抑制劑不僅包括化學合成的廣義的肽硼酸酯類蛋白酶抑制劑,而且還包括從天然植物及中藥中提取、分離、純化得到的肽硼酸酯類蛋白酶抑制劑。本發明所述的肽硼酸酯類蛋白酶抑制劑包括二肽或三肽的肽硼酸酯類抑制劑。本發明所述的肽硼酸酯類抑制劑為硼替佐米、CEP-18770等二肽或三肽的肽硼酸酯類抑制劑的一種或幾種的組合。按藥劑學方法,可以將肽硼酸酯類蛋白酶抑制劑加入輔料製成臨床有效的劑型,包括注射給藥、吸入給藥等起效快、效果好的給藥方式。優選注射給藥形式,例如注射劑、凍乾粉針劑或輸液劑型;或吸入給藥形式,例如脂質體給藥。優選的,本發明中肽硼酸酯類抑制劑相關劑型中有效成分的質量百分比為0.5%-99%,輔料的質量百分比為1%-99%。其中輔料選擇為本領域製劑中的常規選擇。本發明所述的肺部疾病,不僅包括急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群,也包括具有相同病理改變的其他肺部疾病,如哮喘、慢性支氣管炎等疾病。本發明還以硼替佐米在急性肺損傷中的應用為例,來進一步探討肽硼酸酯類蛋白酶抑制劑在肺部疾病中的應用的可能機理:對硼替佐米等硼酸酯類蛋白酶抑制劑在急性肺損傷中的動物實驗的研究表明,這類抑制劑能減少炎性細胞的浸潤,降低前沿性介質的釋放,減少炎性細胞在肺組織的活化與聚集,使肺上皮細胞及肺毛細血管內皮受損減輕,降低血管內皮的通透性,減少肺組織的氧化應激損傷,顯著改善肺部氣體交換功能;此外,這類抑制劑還能抑制NF-κB的表達,抑制TNF-α誘導肺泡上皮細胞凋亡,顯著減輕急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群等肺部疾病的炎症反應,從而顯著提高急性肺損傷動物的生存率。而上述機理的發現,同樣可能是硼酸酯類蛋白酶抑制劑可以對急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群等肺部疾病進行臨床有效的治療,改善患者的病情,並提高患者的生存率的作用機理。附圖說明圖1是各實驗組各時間點肺組織溼/乾重比的測定結果;圖2是各實驗組各時間點BALF蛋白含量結果;圖3是各實驗組NF-κB的DNA結合活性的測定結果。具體實施方式下面用具體實施方式對發明作進一步說明。實施例1硼替佐米對急性肺損傷大鼠的保護作用1、實驗動物及分組實驗動物為SD大鼠,隨機將大鼠分成4組,分別為:假手術組(sham)30隻;模型對照組(control)30隻;溶媒幹預組(vehicle)30隻;硼替佐米幹預組(bort)30隻。A組:sham組,開腹後,取出盲腸,然後回納關腹。B組:control組,也稱CLP組,盲腸結紮穿刺術(CLP術)。C組:Vehicle組,盲腸結紮穿刺後經腹腔注射生理鹽水。D組:Bort組,盲腸結紮穿刺後經腹腔注射1mg/kg硼替佐米+生理鹽水。2、給藥方法CLP術後2h給予Bort組腹腔注射1mg/kg硼替佐米+生理鹽水,Vehicle組給予同樣體積的生理鹽水。3、確定取樣時間點給藥之後4h、8h、12h時間點取A、B、C、D組各8隻動物,處死,對相關指標進行測定。4.1肺水含量的測定通過計算肺組織溼/乾重比值來反映肺組織含水量。取右上肺,用濾紙吸乾表面的滲液和血跡稱溼重,置入80℃烘箱內烘24h,再稱重獲得乾重,計算肺組織溼重/乾重來評價組織水腫。4.2、支氣管肺泡灌洗液(BALF)蛋白含量測定用BCA法測蛋白含量,先繪製蛋白標準曲線,再根據標準曲線測定565nm樣品蛋白含量。蛋白含量用mg蛋白/mlBALF表示。5、實驗結果:5.1肺水含量的測定結果實驗各組各時間點肺水含量用肺溼乾重比表示,結果如圖1所示(註:**:control組與sham組相比,p<0.01;##:Bort幹預組與Vehicle組相比,p<0.01),各時間點CLP組肺溼乾重比均高於Sham組,差異有統計學意義(p<0.01);各時間點硼替佐米幹預組肺溼乾重均低於CLP組,差異有統計學意義(p<0.05)。5.2支氣管肺泡灌洗液蛋白含量結果實驗各組各時間點BALF蛋白含量結果如圖2(註:**:control組與sham組相比,p<0.01;##:Bort幹預組與Vehicle組相比,p<0.01)所示,各時間點CLP組的BALF蛋白含量均高於Sham組,差異有統計學意義(p<0.01);各時間點的Bort的幹預組的BALF含量均明顯降低,差異有統計學意義(p<0.01)。6、實驗結論ALI時肺毛細血管通透性增高,大量蛋白質和水分滲入肺泡和肺間質,所以肺部炎症反應的病例特徵主要表現為肺水腫和肺透明膜的形成,導致換其功能障礙,引起嚴重的急性呼吸衰竭。本研究中,肺臟組織的溼重/乾重比值(代表肺水含量)被作為肺水腫的指標進行評價,而水腫是炎症的典型表現。結果表示硼替佐米能夠顯著降低CLP組的肺水含量,表明硼替佐米能防止液體向肺泡和肺間質的嚴重滲漏。支氣管肺泡灌洗液裡的蛋白含量被作為肺-毛細血管滲透性的指標而測定,結果顯示CLP組大鼠支氣管肺泡灌洗液的蛋白含量指標上調,硼替佐米治療組支氣管肺泡灌洗液內蛋白含量降低,說明急性肺損傷存在肺高滲透性,而硼替佐米可以降低這種滲透性。綜上所述,硼替佐米能抑制肺部的炎性反應、減少肺組織的氧化應激損傷,從而減輕CLP致ALI大鼠肺部微血管內皮細胞、肺泡上皮細胞損傷,改善肺部氣體交換功能,最終顯著提高大鼠的生存率。實施例2硼替佐米對急性肺損傷大鼠的保護作用1、實驗動物及分組實驗動物為SD大鼠,隨機將大鼠分成4組,分別為:假手術組(sham)30隻;模型對照組(control)30隻;溶媒幹預組(vehicle)30隻;硼替佐米幹預組(bort)30隻。A組:sham組,開腹後,取出盲腸,然後回納關腹。B組:control組,也稱CLP組,盲腸結紮穿刺術(CLP術)。C組:Vehicle組,盲腸結紮穿刺後經腹腔注射生理鹽水。D組:Bort組,盲腸結紮穿刺後經腹腔注射1mg/kg硼替佐米+生理鹽水。2、給藥方法CLP術後2h給予Bort組腹腔注射1mg/kg硼替佐米+生理鹽水,Vehicle組給予同樣體積的生理鹽水。3、確定取樣時間點將術後12h確定為取樣的時間點。4、標本處理CLP術後12h,手術切取右肺葉於液氮中保存待測。5、肺組織細胞核中NF-κB的DNA結合活性測定5.1肺組織細胞核蛋白的製備(1)液氮保存的肺組織樣品用研缽搗碎,稱取2g,加BuffferA3ml溶解,冰浴中製成勻漿,轉移入15ml離心管;(2)2000rpm,4℃離心1min,取上清液入另一離心管,冰浴10min;(3)5000rpm,4℃離心10min,留取核蛋白沉澱物;(4)加入1mlBufferB重懸核蛋白沉澱物,冰浴2min,震蕩;(5)12000rpm,4℃離心20min,吸取上層核蛋白提取液,裝入離心管中,保存於-80℃冰箱。5.2NF-κB探針標記(1)按以下方法一次加入各成分,經過離心,震蕩,再離心,致使反應液集中於離心管底部來標記NF-κB探針。(2)NF-κB探針標記反應體系:1.75pmol/μ1NF-κB探針2mlT4多核苷酸激酶10×緩衝液1ml370MBq/ml[γ32P]ATP1ml5-10U/μ1T4多核苷酸激酶1ml無核酸酶水5ml(6)12000rpm4℃離心10min,倒去上清液,保留離心後的沉澱物,使用TE溶液0.1ml將沉澱物溶解。使用標記的寡核苷酸10μl行閃爍計數(5萬-20萬cpm的探針)。標記了的寡核苷酸-20℃保存。5.3凝膠電泳遷移率實驗(1)探針和核蛋白的結合反應體系核蛋白液4ml5×結合緩衝液1mlNF-κB探針1ml無核酸酶水14ml(2)37℃孵育30min,加2μl10×電泳緩衝液,混勻,電泳分析;(3)7%非解離聚丙烯醯氨凝膠製備TEMED0.016ml雙蒸水13.13ml30%丙烯醯胺4.67ml5×電泳緩衝液2.01ml10%過硫酸銨0.2ml(4)將製備好的凝膠傾倒入垂直電泳槽的玻璃間,再將樣品梳子插好,等待一段時間,凝膠聚合後,輕輕將梳子從電泳槽中拔出來。之後用雙蒸水將樣品孔進行反覆衝洗,一般洗5次左右,直至樣品孔被衝洗乾淨,然後用濾紙拭乾樣品孔中的水分;再在樣品孔內加入20μl結合反應體系,在電泳槽內加1×EMSA電泳緩衝液,然後4℃冷室電泳,電泳時間大約為2h,電壓梯度12V/cm;(5)電泳過程結束後,把凝膠放進盛有30%冰醋酸的容器內固定5min,然後又用雙蒸水來進行充分的漂洗,漂洗後把凝膠的一面用濾紙覆蓋,而另一面則用保鮮膜覆蓋。濾紙-凝膠-保鮮膜的三層結構在凝膠真空乾燥儀內乾燥,共90min;(6)放射自顯影:取出製備好的凝膠,到暗室中將其放進X光片盒內,在保鮮膜上放置一張X光片,然後於-70℃放射自顯影,時間48-72h;(7)結果分析:在電腦內輸入圖像用凝膠成像分析系統,然後使用電腦軟體做結果分析,電泳區帶結果使用積分光密度值表達。6、實驗結果實驗組各組大鼠肺組織細胞核內NF-κB的DNA結合活性如圖3所示(註:**:CLP組與Sham組相比,p<0.01;#:Bort幹預組與CLP組相比,p<0.05),CLP組及硼替佐米幹預組肺組織細胞核內NF-κB的DNA結合活性均顯著高於Sham組,差異有統計學意義(p<0.01);硼替佐米幹預能顯著降低肺損傷大鼠肺組織細胞核內NF-κB的DNA結合活性,差異有統計學意義(p<0.05)。7、實驗結論NF-κB是調控炎症反應強弱的關鍵點,它受各種刺激如生物及理化因子激活,激活後的NF-κB能誘導並調控多種炎症相關因子的基因表達,介導了膿毒症ALI/ARDS瀑布式炎症級聯反應的形成、發展及惡化。實驗表明。硼替佐米能明顯抑制NF-κB活化,最終減少促炎細胞因子、趨化因子和粘附分子的表達和釋放而對急性肺損傷起到有效保護作用,從而有效降低急性肺損傷大鼠的死亡率。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp

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