一種菌藻聯合固定荒漠流沙的方法
2023-07-02 08:44:16
專利名稱：一種菌藻聯合固定荒漠流沙的方法
技術領域：
本發明涉及一種菌藻聯合固定荒漠流沙的方法，具體地說是涉及一種利用土壤中的芽孢桿菌與結皮中藻類聯合作用從而快速形成荒漠地表結皮進行防風固沙的方法。
背景技術：
荒漠地表生物結皮是乾旱區特殊環境的產物。通過地物光譜和遙感技術，可以觀測到沙漠表面約有40～60％的表面被這種特殊「皮膚」覆蓋。荒漠地表生物靠自然露水和降水可四季長青，能夠適應零下10℃到60℃之間的低營養環境，選擇它們作為固沙先鋒植物，在大面積流沙中培植，可以補充完善我國目前採用的「喬、灌、草」結合的防風固沙生態體系，尤其適合用於荒漠化地區實施重大工程對地表破壞後的恢復。
「生物結皮」在保持土壤溼度、固定大氣中的氮和增加土壤的有機質含量中扮演著重要的角色。結皮的高含水量可以使降雨較多地保留在土壤結皮表面，有利於結皮中低等生物的生長和繁殖並能通過其生活代謝方式影響並改變環境，在防風固沙、防止土壤侵蝕、改變水分分布狀況等方面起著重要作用。通過對結皮組成成分的分析，可以得知結皮中的主要成分之一是藻類物質，它們一旦在土壤和沙漠中大量生長，就能向體外分泌以多糖為主的物質，從而粘結土壤顆粒和沙粒形成結皮。然而單由藻種固定流沙形成的結皮在自然條件下生長緩慢，需要很長時間才能形成高覆蓋率的結皮植被。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術僅使用藻種固定流沙，形成結皮速度緩慢的缺陷，從而提供一種簡單易行、能快速和持久的固沙、且適用於工業化規模生產的菌藻聯合固定荒漠流沙的方法。
本發明的目的是通過如下的技術方案實現的本發明提供一種菌藻聯合固定荒漠流沙的方法，其為將荒漠藻和土壤芽孢桿菌聯合使用，具體包括如下步驟
1)從土壤結皮中分離和培養芽孢桿菌選擇來自乾旱、半乾旱、或荒漠地表結皮下2～10cm處的土樣與無菌水混和，經100℃高溫處理後製成土壤稀釋液，將此土壤稀釋液接種於牛肉膏蛋白腖培養基平板中，倒置培養；培養好的菌種使用芽孢染色法鑑定，分離出經染色後在油鏡下觀察芽孢呈綠色，菌體呈紅色的耐熱性的土壤芽孢桿菌；該土壤芽孢桿菌的分類命名為芽孢桿菌Bacillus sp，於2005年3月9日保藏於《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，其保藏號為CGMCC No.1324；將上述從土壤結皮中分離的土壤芽孢桿菌在液體培養基I上按常規方法經過大規模連續發酵液體培養後，離心，傾去上清液，下層的菌體沉澱物冷凍乾燥後得到凍乾粉，於冰箱保存備用；所述的液體培養基I為按下述比例配製而成每升水中加入80～100g玉米漿，5g氯化鈉，pH 7.0～7.5；2)從土壤結皮中分離和培養荒漠藻採集乾旱、半乾旱、或荒漠土壤表面結皮，除去其中的植物碎片等雜物後，研磨至能過0.5mm的分樣篩；將此培養樣品於紫外燈下照射後，加無菌蒸餾水振蕩，製得均一懸浮液，將之稀釋後接種於液體培養基II，置於光照培養箱中培養；將藻種挑出後轉接到固體培養基III上，直至獲得純化、無汙染的荒漠藻種；將此純化的荒漠藻種接入含有液體培養基II的三角瓶中，光照培養並間隙搖動燒瓶，得到的荒漠藻通過離心或過濾收集，收集藻片，粉碎，獲得荒漠藻乾粉；所述的液體培養基II是按下述方法配製的將硝酸鉀0.8～2.0g、硫酸鎂0.05～1.2g、磷酸二氫鉀0.02～0.05g和檸檬酸0.004～0.008g用少量蒸餾水溶解後，補加蒸餾水到980ml；將硝酸鈣2～4g用20ml蒸餾水溶解後，加入到上述溶液內；再加入植物生長調節劑0.1～1ppm；所述的固體培養基III是在上述液體培養基II中加入1％的瓊脂，加熱溶化後，15磅壓力下滅菌30min；3)野外接種將步驟1)和2)從結皮中分離和培養的荒漠藻乾粉和土壤芽孢桿菌乾粉按2～3∶1的質量比混勻，形成固沙劑，並按2.0～4.0g/米2的接種量接種於荒漠流沙中；同時噴灑液體營養調理劑，並用地膜覆蓋，所述的液體營養調理劑包括液體培養基II和丙烯酸類保水劑0.1～1g/Kg。
本發明在於將乾旱半乾旱地區土壤結皮中廣泛存在的芽孢桿菌與荒漠藻聯合使用，土壤芽孢桿菌具有粘性莢膜，膠質鞘或厚的果膠質外壁，在生長中能分泌大量的粘液，這些具有粘性附屬物的菌體和粘性質液通過與藻類物質的交連結合從而構成了結皮的基礎。使用此種方法固沙20～40天時，每平方米藻類覆蓋率可達到50～70％，50天時地表可形成微量結皮。
本發明與現有技術相比，其優益之處在於1、該方法簡單易行、操作方便、設備簡單。
2、本發明提供的方法是將微生物和藻類聯合使用，兩者相互作用促進生長，因而，與以往單一由藻類的大規模培養而固沙的技術相比，此種方法能更快速、持久的使荒漠土壤形成結皮。
3、該方法無需對所分離的菌種和藻種進行嚴格的種類純化鑑定，省略了以往繁瑣而不必要的操作步驟。
4、利用本發明提供的方法固沙後所形成的土壤，為沙漠提供了豐富的碳源和氮源，更利於它種微生物和一些低等的微管束植物生長，由此而更加堅固流沙。
5、本發明提供的方法能適用於工業化規模生產。
具體實施例方式
實施例1、選擇來自我國新疆準噶爾盆地地區土壤地表結皮下2cm的土樣10g與無菌水混和，放入盛有90ml的並帶有玻璃珠的三角瓶中振蕩20min後將三角瓶放在沸水中加熱10min後製成10-2、10-3、10-4、10-54種稀釋度的土壤懸液，每一稀釋度的土壤懸液中各吸取0.2ml接種於裝有細菌牛肉膏蛋白腖培養基的平板中，將培養基平板倒置在37℃的溫箱中培養2天。使用芽孢染色法鑑定培養好的菌種，將培養好的菌體塗片乾燥固定，經染液染色乾燥後置油鏡下觀察，分離出經染色後在油鏡下觀察芽孢呈綠色，菌體呈紅色的耐熱性的土壤芽孢桿菌；該土壤芽孢桿菌的分類命名為芽孢桿菌Bacillus sp，於2005年3月9日保藏於《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，其保藏號為CGMCC No.1324。
將上述從土壤結皮中分離的土壤芽孢桿菌使用優化的廉價液體培養基I-1進行大規模發酵，該液體培養基I-1的組成為每升水中含玉米漿80g，氯化鈉5g，pH 7.0，在此條件下，將上述分離的土壤芽孢桿菌大規模連續液體發酵培養3天，離心發酵液，傾去上清液，下層的菌體沉澱物冷凍乾燥，得到芽孢桿菌凍乾粉，其收率為90g/每升發酵液，於冰箱保存備用。
用洗淨消毒的採樣器採集我國新疆準噶爾盆地地區0.5cm厚的土壤地表結皮。把採集的樣品放在洗淨滅菌的培養皿和磨口試劑瓶中，取瓶中的樣品，仔細揀去殘留的植物碎片等雜物，放在研缽中輕輕敲碎，直至全部能通過0.5mm的分樣篩。稱取此培養樣品20g於60W的高效紫外燈下照射2min左右，然後放在250ml三角瓶中加無菌蒸餾水180ml，振蕩20min，製得均一懸浮液，然後按比例稀釋成10-2、10-3、10-4、10-54個等級並將之接種於液體培養基II-1。
培養條件是在4隻40瓦的日光燈管的光照培養箱中，光周期光/暗＝16h/8h，溫度25℃左右下培養，培養天數為10天左右。將平板培養基中生長的藻種用無菌玻璃棒或小鑷子挑出，在無菌載玻片上用液體培養基II-1清洗，再將之接種到新的裝有固體培養基III-1的平板上，獲得無汙染藻種後轉接到斜面保存。將斜面中生長的無汙染藻種進行大批量液體培養，接種量是把藻液光密度控制在0.1A左右，光照周期同上，培養周期為6天，計測培養後的細胞數，結果70,000細胞/ml。培養後得到的荒漠藻通過離心或過濾收集，塗抹於絲絹上，收集到藻片後，用粉碎機粉碎，獲得荒漠藻乾粉。培養全部在無菌條件下進行。
所述的液體培養基II-1是按下述方法配製的將硝酸鉀1g、硫酸鎂0.8g、磷酸二氫鉀0.03g和檸檬酸0.005g用少量蒸餾水溶解後，補加蒸餾水到980ml；將硝酸鈣2.5g用20ml蒸餾水溶解後，加入到上述溶液內；再加入植物生長調節劑三十烷醇0.1ppm。
所述的固體培養基III-1是在上述液體培養基II-1中加入1％的瓊脂，加熱溶化後，15磅壓力下滅菌30min。
將上述從結皮中分離和培養的荒漠藻乾粉和土壤芽孢桿菌乾粉以2∶1的質量比混合後，按2.0g/米2的量接種於荒漠流沙中；同時按0.5-1千克/米2使用移動式噴溉裝置噴溉液體營養調理劑，並用地膜覆蓋，地膜上扎有空洞便於空氣流通，該液體營養調理劑中含有上述液體培養基II-1，同時還含有聚丙烯酸鈉-聚丙烯醯胺保水劑0.1g/Kg。
在此種培養條件下地膜內5～7天後出現藻類生長跡象，40天左右時藻類覆蓋率達到50％，50天左右時形成微量結皮後揭去地膜，任其自由生長。
實施例2、選擇來自我國新疆準噶爾盆地地區土壤地表結皮下6cm的土樣10g與無菌水混和，放入盛有90ml的並帶有玻璃珠的三角瓶中振蕩20min後將三角瓶放在沸水中加熱10min後製成10-2、10-3、10-4、10-54種稀釋度的土壤懸液，每一稀釋度的土壤懸液中各吸取0.2ml接種於裝有細菌牛肉膏蛋白腖培養基的平板中，將培養基平板倒置在37℃的溫箱中培養3天。使用芽孢染色法鑑定培養好的菌種，將培養好的菌體塗片乾燥固定，經染液染色乾燥後置油鏡下觀察，分離出經染色後在油鏡下觀察芽孢呈綠色，菌體呈紅色的耐熱性的土壤芽孢桿菌。
將上述從土壤結皮中分離的土壤芽孢桿菌使用優化的廉價液體培養基I-2進行大規模發酵，該液體培養基I-2的組成為每升水中含玉米漿90g，氯化鈉5g，pH 7.5，在此條件下，將上述分離的土壤芽孢桿菌大規模連續液體發酵培養3天，離心發酵液，傾去上清液，下層的菌體沉澱物冷凍乾燥，得到芽孢桿菌凍乾粉，其收率為120g/每升發酵液，於冰箱保存備用。
在基本操作同實施例1的情況下，荒漠藻液體培養基II-2的組成為硝酸鉀1.5g、硫酸鎂1.0g、磷酸二氫鉀0.04g、檸檬酸0.006g、硝酸鈣3g、植物生長調節劑三十烷醇0.5ppm。所述的固體培養基III-2是在上述液體培養基II-2中加入1％的瓊脂，加熱溶化後，15磅壓力下滅菌30min。在此條件下發酵後計測培養後的藻細胞數，結果是300,000細胞/ml。
將上述從結皮中分離和培養的荒漠藻乾粉和土壤芽孢桿菌乾粉以3∶1的質量比混合後，按3.0g/米2的量接種於荒漠流沙中；同時按0.5-1千克/米2使用移動式噴溉裝置噴溉液體營養調理劑，並用地膜覆蓋，地膜上扎有空洞便於空氣流通，該液體營養調理劑中含有上述液體培養基II-2，同時還含有聚丙烯酸鈉—聚丙烯醯胺保水劑0.5g/Kg。
在此種培養條件下地膜內3～5天後出現藻類生長跡象，30天左右時藻類覆蓋率達到70％，50天左右時形成微量結皮後揭去地膜，任其自由生長。
實施例3、選擇來自我國新疆準噶爾盆地地區土壤地表結皮下10cm的土樣10g與無菌水混和，放入盛有90ml的並帶有玻璃珠的三角瓶中振蕩20min後將三角瓶放在沸水中加熱10min後製成10-2、10-3、10-4、10-54種稀釋度的土壤懸液，每一稀釋度的土壤懸液中各吸取0.2ml接種於裝有細菌牛肉膏蛋白腖培養基的平板中，將培養基平板倒置在37℃的溫箱中培養3天。使用芽孢染色法鑑定培養好的菌種，將培養好的菌體塗片乾燥固定，經染液染色乾燥後置油鏡下觀察，分離出經染色後在油鏡下觀察芽孢呈綠色，菌體呈紅色的耐熱性的土壤芽孢桿菌。
將上述從土壤結皮中分離的土壤芽孢桿菌使用優化的廉價液體培養基I-3進行大規模發酵，該液體培養基I-3的組成為每升水中含玉米漿100g，氯化鈉5g，pH 7.5，在此條件下，將上述分離的土壤芽孢桿菌大規模連續液體發酵培養3天，離心發酵液，傾去上清液，下層的菌體沉澱物冷凍乾燥，得到芽孢桿菌凍乾粉，其收率為80g/每升發酵液，於冰箱保存備用。
在基本操作同實施例1的情況下，荒漠藻液體培養基II-3的組成為硝酸鉀2.0g、硫酸鎂1.2g、磷酸二氫鉀0.05g、檸檬酸0.008g、硝酸鈣4g、植物生長調節劑三十烷醇1ppm。所述的固體培養基III-3是在上述液體培養基II-3中加入1％的瓊脂，加熱溶化後，15磅壓力下滅菌30min。在此條件下發酵後計測培養後的細胞數，結果10,000細胞/ml，這是因為高濃度的植物生長調節劑抑制藻類物質的生長。
將上述從結皮中分離和培養的荒漠藻乾粉和土壤芽孢桿菌乾粉以3∶1的質量比混合後，按4.0g/米2的量接種於荒漠流沙中；同時按0.5-1千克/米2使用移動式噴溉裝置噴溉液體營養調理劑，並用地膜覆蓋，地膜上扎有空洞便於空氣流通，該液體營養調理劑中含有上述液體培養基II-3，同時還含有聚丙烯酸鈉-聚丙烯醯胺保水劑1fg/Kg。
在此種培養條件下地膜內3～5天後出現藻類生長跡象，35天左右時藻類覆蓋率達到60％，50天左右時形成微量結皮後揭去地膜，任其自由生長。
由上述實施例可以看出，本發明將乾旱半乾旱地區土壤結皮中廣泛存在的芽孢桿菌與荒漠藻聯合使用，兩者相互作用促進生長，因而，與以往單一由藻類的大規模培養而固沙的技術相比，此種方法能更快速、持久的使荒漠土壤形成結皮，使用此種方法固沙20～40天時，每平方米藻類覆蓋率即可達到70～90％，50天時地表可形成微量結皮。而且，利用本發明提供的方法固沙後所形成的土壤，為沙漠提供了豐富的碳源和氮源，更利於它種微生物和一些低等的微管束植物生長，由此而更加堅固流沙。
權利要求
1.一種菌藻聯合固定荒漠流沙的方法，其為將荒漠藻和土壤芽孢桿菌聯合使用。
2.如權利要求1所述的菌藻聯合固定荒漠流沙的方法，其特徵在於所述的土壤芽孢桿菌的分類命名為芽孢桿菌Bacillus sp，於2005年3月9日保藏於《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，其保藏號為CGMCC No.1324。
3.如權利要求1所述的菌藻聯合固定荒漠流沙的方法，其特徵在於所述的土壤芽孢桿菌是通過如下的步驟從土壤結皮中分離和培養的選擇來自乾旱、半乾旱、或荒漠地表結皮下2～10cm處的土樣與無菌水混和，經100℃高溫處理後製成土壤稀釋液，將此土壤稀釋液接種於細菌牛肉膏蛋白腖培養基平板中，倒置培養；培養好的菌種使用芽孢染色法鑑定，分離出經染色後在油鏡下觀察芽孢呈綠色，菌體呈紅色的耐熱性的土壤芽孢桿菌；將上述從土壤結皮中分離的土壤芽孢桿菌在液體培養基I上按常規方法經過大規模連續發酵液體培養後，離心，傾去上清液，下層的菌體沉澱物冷凍乾燥後得到凍乾粉，於冰箱保存備用；所述的液體培養基I為按下述比例配製而成每升水中加入80～100g玉米漿，5g氯化鈉，pH7.0～7.5。
4.如權利要求1所述的菌藻聯合固定荒漠流沙的方法，其特徵在於所述的荒漠藻是通過如下的步驟從土壤結皮中分離和培養的採集乾旱、半乾旱、或荒漠土壤表面結皮，除去其中的植物碎片等雜物後，研磨至能過0.5mm的分樣篩；將此培養樣品於紫外燈下照射後，加無菌蒸餾水振蕩，製得均一懸浮液，將之稀釋後接種於液體培養基II，置於光照培養箱中培養；將藻種挑出後轉接到固體培養基III上，直至獲得純化、無汙染的荒漠藻種；將此純化的荒漠藻種接入含有液體培養基II的三角瓶中，光照培養並間隙搖動燒瓶，得到的荒漠藻通過離心或過濾收集，收集藻片，粉碎，獲得荒漠藻乾粉；所述的液體培養基II是按下述方法配製的將硝酸鉀0.8～2.0g、硫酸鎂0.05～1.2g、磷酸二氫鉀0.02～0.05g和檸檬酸0.004～0.008g用少量蒸餾水溶解後，補加蒸餾水到980ml；將硝酸鈣2～4g用20ml蒸餾水溶解後，加入到上述溶液內；再加入植物生長調節劑0.1～1ppm；所述的固體培養基III是在上述液體培養基II中加入1％的瓊脂，加熱溶化後，15磅壓力下滅菌30min。
5.如權利要求1所述的菌藻聯合固定荒漠流沙的方法，其特徵在於所述的將荒漠藻和土壤芽孢桿菌聯合使用為在野外接種時，將從結皮中分離和培養的荒漠藻乾粉和土壤芽孢桿菌乾粉按2～3∶1的質量比混勻，形成固沙劑，並按2.0～4.0g/米2的接種量接種於荒漠流沙中；同時噴灑液體營養調理劑，並用地膜覆蓋，所述的液體營養調理劑包括液體培養基II和丙烯酸類保水劑0.1～1g/Kg。
全文摘要
本發明涉及一種菌藻聯合固定荒漠流沙的方法。將從乾旱、半乾旱、或荒漠地表結皮中分離和大規模培養的荒漠藻乾粉和土壤芽孢桿菌乾粉按2～3∶1的質量比混勻，形成固沙劑，並按2.0～4.0g/m
文檔編號E02D3/00GK1833484SQ20051005538
公開日2006年9月20日 申請日期2005年3月18日 優先權日2005年3月18日
發明者任天瑞, 次素琴, 劉京玲, 陳亞寧, 李衛紅 申請人:中國科學院過程工程研究所