一種耐高溫酵母菌及其應用的製作方法

2023-07-02 20:15:26 3

本發明涉及一種耐高溫酵母菌及其應用，屬於應用微生物領域。

背景技術：

隨著能源危機和環境汙染的日趨嚴重，可再生新能源的開發已成為世界各國亟待解決的問題。生物乙醇作為一種可再生的綠色能源，對緩解石油危機，降低環境汙染問題具有重大的戰略意義。同時，生物乙醇是當前可行性最高的替代液體燃料，孕育著巨大市場前景。

作物來源的澱粉和蔗糖仍然是目前乙醇生產的主要原料。糖蜜是製糖工業的副產品，作為燃料乙醇的生產原料，不但可以提高糖廠的經濟效益，減輕環境壓力，還可以有效的降低乙醇生產的原料成本。

傳統的糖蜜乙醇生產工藝包括將廢糖蜜稀釋到合適的濃度後加酸酸化，利用酵母菌進行乙醇發酵，最後通過加溫蒸餾回收乙醇的過程。

目前的糖蜜乙醇生產工藝中，為了防止雜菌汙染和提高酵母的乙醇產量，需在發酵液中加入大量的濃硫酸進行酸化，對發酵罐具有很強的腐蝕作用，增加發酵成本。同時，產生的發酵廢液（廢醪液）雖然富含可利用有機物質，但因含有高濃度的硫酸根離子（so4²¯），強酸性（ph值3.0～3.5）等原因，資源化利用非常困難，直接排放會造成嚴重的環境汙染。

另外，糖蜜乙醇工業中通常利用釀酒酵母（saccharomycescereviviae）在30℃左右的溫度條件下發酵生產乙醇。酵母在發酵過程中產熱和環境溫度的提高，往往造成發酵體系溫度的升高，從而降低釀酒酵母的生長和發酵活性。所以生產過程中為了保持酵母菌的活性，必須使用大量的冷卻水降低發酵罐的溫度，對能源和水資源的消耗非常嚴重。

因此，高能耗、運行費用高和發酵廢液無法再利用、環境汙染嚴重是當前乙醇生產工藝中的重要難題。

技術實現要素：

本發明克服了現有技術的不足，提供了一株耐高溫酵母菌株kluyveromycesmarxianusls201，該菌株已於2017年3月13日其在中國典型培養物保藏中心的保藏編號為：cctccno:m2017112。保藏地址為中國武漢武漢大學。

本發明所述耐高溫酵母菌株kluyveromycesmarxianusls201的培養溫度為25~48℃。

本發明所述耐高溫酵母菌株kluyveromycesmarxianusls201，其26srrnad1/d2+its區域具有seqidno.1所示的核苷酸序列。

本發明中所述耐高溫酵母菌株ls201，其核糖體rna（rrna）序列比對結果顯示，與已知的kluyveromycesmarxianus具有99%以上的相似性，以及系統發育分析結果表明其分類上屬於kluyveromyces屬的marxianus種（如圖1所示）。

本發明另一目的是將耐高溫酵母菌株應用在發酵生產乙醇中。

本發明中所述發酵生產乙醇是利用葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖、甘油、纖維二糖、乳糖、蔗糖、乳酸、麥芽糖、棉籽糖中的一種或幾種為碳源生產乙醇。

利用木質纖維素水解液、海藻水解液生產乙醇。

本發明中所述耐高溫酵母菌株在發酵生產乙醇的溫度為30~48℃。

本發明中所述的耐高溫酵母菌株kluyveromycesmarxianusls201主具有以下微生物學特徵（如表1所示）：

本菌株分離及培養的基礎培養基酵母浸出粉腖葡萄糖培養基（ypd培養基），培養基組分如下：2%葡萄糖，2%蛋白腖，1%酵母提取物，固體培養基需加入2%的瓊脂粉，115℃高溫高壓滅菌20min備用。除溫度、ph實驗之外的其他實驗均在45℃，自然ph的條件下培養；接種量除生理生化實驗中為1%外，其他實驗均為5%。所有實驗都設3組平行實驗。本發明中除特殊說明外，鑑定菌株特性的培養基採用ypd培養基（碳源為葡萄糖）。

1、形態學特徵

本發明菌株ls201是中國科學院西雙版納熱帶植物園土壤樣品中分離篩選獲得，酵母菌ls201為卵圓形，以單端出芽方式進行繁殖。在溫度25℃的產孢子培養基上培養5天後有子囊孢子產生，孢子呈卵圓形。在ypd固體培養基上塗布稀釋後的ls201菌株，結果發現，酵母菌菌落呈圓臺形，向上凸起，顏色均一為乳白色，質地均勻，邊緣圓整，表面光滑，粘稠易挑取（如圖2所示）。

2、生理生化特性

本發明的耐高溫酵母ls201菌株能無維生素的培養基（硫酸銨，2.0g/l；硫酸鎂，0.2g/l；磷酸二氫鈉，0.5g/l；氯化鈣，0.1g/l；磷酸氫二鉀，0.5g/l；葡萄糖，2.0g/l）中生長；

本發明的耐高溫酵母ls201菌株在ypd（2%葡萄糖，2%蛋白腖，1%酵母提取物）培養基中，25～48℃條件下生長；

本發明的耐高溫酵母ls201菌株，在ypd(2%葡萄糖，2%蛋白腖，1%酵母提取物)培養基中，可在ph3.0～7.0條件下正常生長；

本發明的耐高溫酵母ls201菌株可耐受最高乙醇濃度為8%（w/w）；

本發明的耐高溫酵母ls201菌株能在含有0.01%放線菌酮的在基礎氮源培養基（(nh4)2so42g/l，mgso40.2g/l，nah2po40.5g/l，cacl20.1g/l，k2hpo40.5g/l；ph6.5~6.8）中生長；

本發明的耐高溫酵母ls201菌株能在50%的d-葡萄糖培養基（50%的d-葡萄糖，2%蛋白腖，1%酵母提取物，2%瓊脂粉）上生長，在60%的d-葡萄糖培養基（60%的d-葡萄糖，2%蛋白腖，1%酵母提取物，2%瓊脂粉）上不生長；

本發明的耐高溫酵母ls201菌株可利用葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖醇、甘露醇、木糖、乙醇、甘油、纖維二糖、乳糖、蔗糖、乳酸、麥芽糖和棉籽糖等糖類，不能利用山梨糖、鼠李糖、木糖醇和可溶性澱粉；

表1：耐高溫酵母菌株ls201菌株的微生物學特性

註：表中「+」表示可以，「-」表示不可以。

本發明提供的耐高溫酵母菌株kluyveromycesmarxianusls201利用葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖、甘油、纖維二糖、乳糖、蔗糖、乳酸、麥芽糖、棉籽糖中的一種或幾種為碳源生產乙醇。其中，耐高溫酵母菌株kluyveromycesmarxianusls201在溫度為30～48℃的條件下發酵生產乙醇時乙醇的產率較高。

本發明中所述耐高溫酵母ls201菌株能夠利用糖蜜發酵生產乙醇。

本發明中所述耐高溫酵母ls201菌株能夠利用木質纖維素水解液發酵生產乙醇。

本發明中所述耐高溫酵母ls201菌株能夠利用乳清發酵生產乙醇。

耐高溫酵母ls201菌株澱粉和非澱粉多糖水解產生的單糖發酵生產乙醇。

本發明提供的耐高溫酵母kluyveromycesmarxianusls201菌株具有如下優點是：

（1）本發明提供的耐高溫酵母ls201菌株可以利用澱粉和非澱粉多糖水解後的單糖發酵生產乙醇，為乙醇的工業發酵提供了更多可能；

（2）本發明提供的耐高溫酵母ls201菌株可以利用糖蜜是製糖工業中的副產品糖蜜發酵乙醇，大大減少了工業乙醇生產的成本；

（3）本發明提供的耐高溫酵母ls201菌株能夠在高溫條件下高效生產乙醇。不僅可以實現大幅度減少冷卻水的用量和能耗，還能通過提高發酵溫度有效抑制雜菌的汙染，從而能減少濃硫酸的添加量，降低發酵廢液的酸性，使廢醪液的資源化利用變得可能。

附圖說明

圖1是本發明菌株kluyveromycesmarxianusls201的rna（26srrnad1/d2+its）基因序列的系統發育進化樹；

圖2是本發明菌株kluyveromycesmarxianusls201在生物顯微鏡下的形態示意圖；

圖3是本發明菌株kluyveromycesmarxianusls201在不同溫度下的生長示意圖。

具體實施方式

以下結合附圖和實施例對本發明進一步的詳細說明，但是本發明的保護範圍並不僅限於所述內容。

實施例1：耐高溫酵母kluyveromycesmarxianusls201菌株篩選分離

將從中國科學院西雙版納熱帶植物園土壤樣品加入到添加有終濃度均為25µg/l的鏈黴素和四環素鹽酸鹽的ypd液體培養基中，在42℃，150rpm搖床富集培養24h後，抽取1ml用生理鹽水進行10倍梯度稀釋，取各梯度稀釋菌液1ml塗布在添加有四環素鹽酸鹽和氯黴素的ypd瓊脂培養基中，於42℃靜止培養24h，長出菌落後，選擇具有典型酵母菌落特徵的單菌落進一步劃線分離2～3次，鏡檢為純種後轉入ypd液體培養基中，4℃保存。將篩選得到的菌株接入到ypd液體培養基中42℃培養24h，通過測定提高菌株的生長溫度後得到的菌株生長od600nm值，比較各菌株生長情況，篩選出能在48℃下高溫下生長的酵母，編號為ls201。通過分子系統發育學分析，命名為kluyveromycesmarxianusls201，送「中國典型培養物保藏中心」(簡稱cctcc)保存。

實施例2：不同溫度條件對耐高溫酵母ls201菌株生長的影響

將新鮮培養的耐高溫釀酒酵母ls201菌株接種於裝有10mlypd培養基的試管中，分別在25℃、30℃、37℃、42℃、45℃、48℃和50℃不同溫度下於150rpm/min轉速的搖床中培養24小時後，測定其在600nm處的od值，結果見圖3所示，由圖3可知，ls201菌株在25~48℃範圍內均能正常生長，在30℃時，od600nm為2.65，48℃時為2.35，50℃時該菌株的生長明顯受到影響，該菌株的適宜生長溫度為25~48℃。

實施例3：在不同溫度條件下，菌株ls201發酵葡萄糖生產乙醇

ls201菌株接種於活化培養基中，該活化培養基ph為6.5，活化培養基的質量百分比的組分為：葡萄糖10％，蛋白腖1％，酵母提取物1％，在裝有20ml的100ml搖瓶中於150rpm/min轉速的搖床中在30℃培養16小時後，按5％的接種量加入到裝有100ml發酵培養基的250ml三角瓶中，發酵培養基的ph為6.5，發酵培養基的質量百分比組分為：葡萄糖10％，蛋白腖1％，酵母膏1％。分別在30℃、37℃、42℃、45℃、48℃的搖床中，150rpm/min轉速下培養24小時，採用分光光度法測定菌體的生物量，高效液相色譜法測定發酵液中葡萄糖和乙醇的濃度，測試結果如表2所示，

表2

從表2可知，ls201菌株在以10%的葡萄糖為碳源發酵24小時，發酵液中ls201菌株的od600nm為3.1，乙醇濃度為44.55g/l，乙醇得率為0.47g/g；耐高溫酵母菌株ls201，在30℃、37℃、42℃、45℃、48℃溫度條件下均能發酵葡萄糖生產乙醇；在45℃溫度條件下細胞生長量最大，od（600nm）值為3.1，乙醇濃度為44.55g/l，乙醇得率為0.47g/g，24小時內的糖消耗速率最快，達到3.96g/l/h，乙醇產率最快，達到1.86g/l/h，乙醇得率最高，達到0.47g/l/h，是理論值的92.2%（理論值為0.51g/g）。

實施例4：菌株ls201發酵不同濃度甘蔗糖蜜生產乙醇

耐高溫酵母ls201菌株接種於活化培養基中，該活化培養基ph為6.5，活化培養基的質量百分比的組分為：葡萄糖10％，蛋白腖1％，酵母膏1％，在裝有20ml的100ml搖瓶中於150rpm/min轉速的搖床中在37℃培養12小時作為接種源；

將甘蔗糖蜜原液用蒸餾水稀釋成濃度為15bxº、20bxº、25bxº、30bxº的甘蔗糖蜜培養基，分別裝到100ml的250ml的搖瓶中，滅菌（121℃，20分鐘）後冷卻至發酵溫度；

按5％的接種量加入上述接種源，在45℃的搖床中，150rpm/min轉速下培養24小時；

採用高效液相色譜法測定發酵液中乙醇和總糖的濃度；測試結果如表3所示，

表3

從表3可知，在24h發酵結束時，糖蜜的初始濃度對乙醇產量的影響顯著，甘蔗糖蜜的錘度為20bxº時，發酵液中乙醇濃度最高，為49.01g/l，此時的乙醇得率為0.42g（乙醇）/g(總糖)，是理論值的83.1%，24小時的乙醇生產速率為2.04g/l/h。

實施例5：在不同濃度的硫酸鎂條件下，耐高溫酵母ls201菌株在溫度45℃發酵糖蜜生產乙醇

本實施例採用與實施例1相同的方法活化製備耐高溫酵母ls201菌株接種源；

用蒸餾水稀釋甘蔗糖蜜至20bxº濃度，並添加不同濃度的硫酸鎂，製備硫酸鎂終濃度為0%、0.02%、0.04%、0.06%和0.08%的糖蜜培養基；分別取100ml分裝到250ml容量的搖瓶中，滅菌（121℃，20分鐘）後冷卻至發酵溫度；按5％的接種量加入上述接種源，在45℃的搖床中，150rpm/min轉速下培養24小時；

採用高效液相色譜法測定發酵液中乙醇和總糖的濃度；測試結果如表4所示，

表4

從表4可知，硫酸鎂濃度對乙醇產量的影響顯著，當硫酸鎂添濃度為0.02%時，乙醇產量最高為55.08g/l，乙醇得率為0.47g（乙醇）/g(總糖)，是理論值的91.6%，24小時的乙醇生產速率為2.29g/l/h。

實施例6：在不同濃度的酵母提取物條件下，耐高溫酵母ls201菌株在溫度45℃發酵糖蜜生產乙醇

本實施例採用與實施例1相同的方法活化製備耐高溫酵母ls201菌株接種源；

用蒸餾水稀釋甘蔗糖蜜至20bxº濃度，並添加不同濃度的酵母提取物，製備酵母提取物濃度為0%、0.5%、1%、1.5%和2%的糖蜜培養基；分別取100ml分裝到250ml容量的搖瓶中，滅菌（121℃，20分鐘）後冷卻至發酵溫度；按5％的接種量加入上述接種源，在45℃的搖床中，150rpm/min轉速下培養24小時；

採用高效液相色譜法測定發酵液中乙醇和總糖的濃度；測試結果如表5所示，

表5

從表5可知，酵母提取物濃度對乙醇產量的影響顯著，當硫酸鎂添濃度為2%時，乙醇產量最高為56.59g/l，乙醇得率（乙醇）/(總糖)為0.44g/g，是理論值的86.7%，24小時的乙醇生產速率為2.36g/l/h；

ls201菌株發酵甘蔗糖蜜乙醇的最適發酵初始錘度為20bxº，營養物質添加量分別為酵母膏0.5%，硫酸鎂為0.04%。在此優化的發酵條件下，進行糖蜜乙醇的搖瓶發酵試驗，發酵24小時的乙醇產量為60.69g/l，乙醇得率為0.47g（乙醇）/g(總糖)，是理論值的93.0%，24小時的乙醇生產速率為2.53g/l/h。

實施例7：蔗糖對耐高溫酵母ls201菌株在45℃發酵生產乙醇的影響

採用與實施例1相同的方法活化製備耐高溫酵母ls201菌株接種源；

製備含蔗糖、酵母粉、蛋白腖的培養基，分別取100ml上述培養基分裝到250ml容量的搖瓶中，滅菌（121℃，20分鐘）後冷卻至發酵溫度；

按5％的接種量加入上述接種源，在45℃的搖床中，150rpm/min轉速下培養24小時；

採用高效液相色譜法測定發酵液中乙醇和總糖的濃度，測試結果顯示，發酵液中的總糖含量降低，發酵液中有乙醇。

實施例8：乳糖對耐高溫酵母ls201菌株在45℃發酵生產乙醇的影響

採用與實施例1相同的方法活化製備耐高溫酵母ls201菌株接種源；

製備含乳糖、酵母粉、蛋白腖的培養基，分別取100ml上述培養基分裝到250ml容量的搖瓶中，滅菌（121℃，20分鐘）後冷卻至發酵溫度；

按5％的接種量加入上述接種源，在45℃的搖床中，150rpm/min轉速下培養24小時；

採用高效液相色譜法測定發酵液中乙醇和總糖的濃度，測試結果顯示，發酵液中的總糖含量降低，發酵液中有乙醇。

實施例9：耐高溫酵母ls201菌株在45℃發酵海藻水解液生產乙醇的影響

採用與實施例1相同的方法活化製備耐高溫酵母ls201菌株接種源；

機械粉碎法將幹海帶粉碎成顆粒狀，用0.1mol/l的鹽酸在110℃下處理45min，製備成海藻酸水解液，分別取100ml上述培養基分裝到250ml容量的搖瓶中，滅菌（121℃，20分鐘）後冷卻至發酵溫度；

按5％的接種量加入上述接種源，在45℃的搖床中，150rpm/min轉速下培養24小時；

採用高效液相色譜法測定發酵液中乙醇和總糖的濃度，測試結果顯示，發酵液中有乙醇。

實施例10：耐高溫酵母ls201菌株在45℃發酵木質纖維素水解液生產乙醇

本實施例碳源為玉米秸稈的木質纖維素；

採用與實施例1相同的方法活化製備耐高溫酵母ls201菌株接種源；

木質纖維素用0.1mol/l的hcl處理後得到木質纖維素水解液，分別取100ml上述培養基分裝到250ml容量的搖瓶中，滅菌（121℃，20分鐘）後冷卻至發酵溫度；

按5％的接種量加入上述接種源，在45℃的搖床中，150rpm/min轉速下培養24小時；

採用高效液相色譜法測定發酵液中乙醇和總糖的濃度，測試結果顯示，發酵液中有乙醇。

昆明理工大學

一株耐高溫酵母及其乙醇發酵的應用

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馬克思克魯維酵母(kluyveromycesmarxianus)ls201菌株

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