一種檢測鯉科魚類卵黃蛋白原試劑盒的製備方法
2023-07-02 18:07:11 1
專利名稱：一種檢測鯉科魚類卵黃蛋白原試劑盒的製備方法
技術領域：
本發明涉及類雌激素的生態安全及風險性評價研究，特別是涉及一種基於酶聯免疫吸附原理定量檢測鯉科魚類血液中、肝組織以及魚體中卵黃蛋白原(Vitellogenin，VTG)含量的試劑盒的製備方法。
背景技術：
當前，人類使用了大量的殺蟲劑及除草劑來提高農業產量，許多化工產品的應用也顯著改善了人們的生活水平。但大量使用這些人工化學品給我們的環境及人類健康本身也造成了極大的危害。近年來越來越多的研究表明，多種野生動物生殖力衰退，野生群落退化，人類精子數量和質量降低、乳腺癌和睪丸癌等發病率上升。這些現象的發生均與環境中某些具有激素活性的汙染物的存在有著密切關係。他們能夠模擬或幹擾內源性激素的作用，對人類和野生動物的發育，生殖和健康產生各種負面影響。這類化合物一般被統稱為內分泌幹擾物，即那些可幹擾維持體內內分泌平衡，調節生長發育的內源激素的產生、分泌、運輸、代謝及作用的外源化合物。它們可幹擾生物體內分泌系統的功能，從而影響生物體的生長、發育和繁殖。所以目前迫切需要建立能夠篩選和鑑定環境中已經大量存在的以及人們不斷新合成的物質是否具有內分泌幹擾效應的方法，並藉助這些方法對其生態安全性進行正確的評價。
卵黃蛋白原是具有種特異性的高分子量磷脂蛋白。卵黃生成期間的雌魚分泌雌激素，誘導肝細胞生成卵黃蛋白原，卵黃蛋白原通過血液循環系統，運輸到卵巢，在經過修飾後，成為魚卵生長發育的營養物質—卵黃蛋白。雌魚在卵黃生成期可生成大量卵黃蛋白原，但在雌魚的其它生活期間，魚體內的卵黃蛋白原的含量卻很低。雄魚和幼魚在大劑量的人工雌激素作用下，以及在低劑量的類雌激素長期作用下，都能誘導體內卵黃蛋白原的生成。另外，某些內分泌幹擾物具有抗雌激素的作用，其幹擾雌魚體內卵黃蛋白原的生成，使雌魚血液中卵黃蛋白原的含量比正常時低。因而雄魚和幼魚及非卵黃生成期的雌魚體內卵黃蛋白原生成水平的變化可作為環境中類雌激素汙染存在的生物標誌物。
目前國外也建立了幾種硬骨魚類卵黃蛋白原的酶聯免疫吸附檢測試劑盒和放射性免疫檢測試劑盒，但試劑盒所能檢測的魚類在中國的分布很少或沒有，不具有代表性，而且試劑盒的價格極其昂貴，難以推廣。
發明內容
本發明的目的在於提供一種檢測鯉科魚類卵黃蛋白原試劑盒的製備方法，採用該方法製備的試劑盒，可靈敏、準確、方便的定量檢測多種鯉科魚類血液中、肝組織以及魚體中的卵黃蛋白原。
為了達到上述目的，本發明採用以下技術方案本發明基於間接酶聯免疫吸附檢測原理，即檢測樣品非特異吸附在酶標板上，封閉多餘的結合位點，加入適量的抗體與之結合，除去多餘的抗體後，再加入過量的酶標記抗抗體與之結合一段時間，除去多餘酶標記抗抗體後，最後加入底物開始酶促反應，並測定溶液的吸收強度，而吸收強度與檢測樣品中卵黃蛋白原的含量呈正相關。同時用標準蛋白溶液同步對比操作擬合標準曲線，檢測樣品可根據其吸收強度在標準曲線上計算出卵黃蛋白原的相應濃度。
本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果檢測試劑盒利用抗原抗體之間的特異結合能力，可靈敏、準確、方便的檢測多種鯉科魚類卵黃蛋白原，其最低檢測限為10ng/ml，線性工作範圍為25ng/ml-150ng/ml，為類雌激素的篩選、鑑定和風險性評價提供了一個有效的研究手段。
具體實施例方式
其步驟如下(1)卵黃蛋白原標準樣品的誘導和分離純化配製17α-乙炔基雌二醇(17α-ethinylestradiol，EE2)溶液將100mg17α-乙炔基雌二醇先溶於5mL丙酮，再轉溶於10mL豆油中，丙酮用氮氣吹乾。腹腔注射入魚體，劑量為5mg/kg，暴露5-7天後，取魚血，4℃離心獲得血清。血清通過離子交換層析柱，填料為DEAE Sepharose CL-6B。層析柱先用0.025mol/LTris-HCl(pH7.5)緩衝液平衡，加入2mL血清樣品，用含NaCl的Tris-HCl(pH7.5)緩衝液進行梯度洗脫，採用部分收集器收集洗脫液，並以電泳確定各管中是否含有卵黃蛋白原。收集含卵黃蛋白原蛋白的溶液，經透析脫鹽後，冷凍乾燥為凍乾粉。
(2)卵黃蛋白原多克隆抗體的製備稱取1mg卵黃蛋白原的蛋白凍乾粉，溶於1mL雙蒸水中，加入1mL弗氏完全佐劑，乳化後，在紐西蘭大白兔背部皮內多點注射，進行初次免疫。第28、42、56天各加強免疫一次免疫劑量同第一次，但採用弗氏不完全佐劑乳化抗原溶液，並在紐西蘭大白兔背部皮下多點注射，加強免疫。65天後，從兔耳緣靜脈抽取少量血液測量抗體的滴度，如果抗體的效價較低，可多加強免疫一次。如抗體的效價高，則從兔頸動脈放血，製備卵黃蛋白原的抗血清。
(3)本發明所製備的試劑盒的具體操作步驟如下1.在96孔酶標板每孔中加入100ul用標準樣品稀釋液稀釋了的樣品、標準品、陰性標準品或試劑空白樣品。
2. 4℃冰箱中，包被過夜(16-24小時)。
3.棄去酶標板中的液體，每孔加入360ul封閉液，置於4℃冰箱中，封閉過夜(16-24小時)。
4.棄去酶標板中的封閉液，每孔加入300ul的洗滌液，輕微振蕩1分鐘後，棄去洗滌液，重複3次。
5.每孔加入100ul用稀釋液稀釋的卵黃蛋白原多克隆抗體，室溫孵育1小時。
6.棄去酶標板中的卵黃蛋白原多克隆抗體，如步驟4洗板4次。
7.每孔加入100μl用稀釋液稀釋的酶標記羊抗兔IgG抗體，室溫孵育1小時。
8.棄去酶標板中的酶標記羊抗兔IgG抗體，同步驟4洗板4次。
9.每孔加入100ul顯色底物，室溫暗處反應10至30分鐘，待標準品呈現明顯的黃色後，加入50ul反應終止液，終止反應。
10.用酶標儀在490nm處檢測樣品的吸光度。
11.根據樣品的吸收強度在標準曲線上算出其相應濃度。
本發明所設計的鯉科魚類卵黃蛋白原定量檢測試劑盒組成如下A、空白96孔高吸附酶標板(1塊)B、標準品1支(5ug左右的卵黃蛋白原凍乾粉)，使用前用標準品稀釋液稀釋到所需濃度C、陰性對照標準品1支(0.2ml/支)，為不含卵黃蛋白原的鯉魚血清D、卵黃蛋白原多克隆抗體(50ul)，使用前用稀釋液稀釋1000倍E、酶標記羊抗兔IgG抗體(50ul)，使用前用稀釋液稀釋1000倍F、顯色液(A)和標準品稀釋液(B)、稀釋液(C)、洗滌緩衝液(D)各一支G、終止液(0.5mol/L H2SO4)8ml註標準品稀釋液0.1mol/L碳酸鹽緩衝液，pH9.5稀釋液PBS緩衝液，pH7.4洗滌緩衝液含0.05％ Tween 20的稀釋液封閉液含1％牛血清白蛋白的稀釋液顯色液鄰苯二胺(OPD)溶液
權利要求
1.一種檢測鯉科魚類卵黃蛋白原試劑盒的製備方法，包括下列步驟A、卵黃蛋白原標準樣品的誘導和分離純化①配製17α-乙炔基雌二醇溶液，將100mg1 7α-乙炔基雌二醇先溶於5mL丙酮，再轉溶於10mL豆油中，丙酮用氮氣吹乾；②腹腔注射入魚體，劑量為5mg/kg，暴露5-7天，取魚血，4℃離心獲得血清；③血清通過離子交換層析柱，填料為DEAE Sepharose CL-6B，層析柱用0.025mol/L Tris-HCl，pH7.5緩衝液平衡，加入2mL血清樣品，用含NaCL的0.025mol/L Tris-HCl，pH7.5緩衝液進行梯度洗脫；④收集含卵黃蛋白原蛋白的洗脫液，透析脫鹽後，冷凍乾燥為凍乾粉；B、卵黃蛋白原多克隆抗體的製備①稱取1mg卵黃蛋白原的蛋白凍乾粉，溶於1mL雙蒸水中，加入1mL弗氏完全佐劑，乳化後，在大白兔背部皮內注射，進行初次免疫；②第28、42、56天各加強免疫一次，免疫劑量同第一次，採用弗氏不完全佐劑乳化抗原溶液，並在大白兔背部皮下注射，加強免疫；③65天後，從兔耳緣靜脈抽取少量血液測量抗體的滴度；④從兔頸動脈放血，製備卵黃蛋白原的抗血清。
全文摘要
本發明公開了一種檢測鯉科魚類卵黃蛋白原試劑盒的製備方法，首先是卵黃蛋白原的誘導和分離純化，配製乙炔基雌二醇溶液，腹腔注射入魚體，誘導一段時間，取魚血，離心獲得血清，用離子交換柱分離純化，透析脫鹽，製備凍乾粉；其次是卵黃蛋白原多克隆抗體的製備，稱取凍乾粉，溶於雙蒸水中，加入弗氏佐劑乳化，免疫大白兔，製備多克隆抗體。本發明可靈敏、準確、方便的定量檢測多種鯉科魚類血液中、肝組織及魚體中的卵黃蛋白原。
文檔編號G01N33/53GK1395101SQ0213891
公開日2003年2月5日 申請日期2002年8月12日 優先權日2002年8月12日
發明者徐盈, 梁勇 申請人:中國科學院水生生物研究所